humán sejtfelszíni marker szűrés

a hESC és a hPSC-RPE sejteket tryple alkalmazásával 5-10 percig disszociáltuk egyetlen sejtre. Az optikai vezikulákat egyetlen sejtre disszociáltuk TrypLE Select (Gibco, Invitrogen) alkalmazásával 10 percig, majd fizikai disszociáció következett egy 20 G-os tűn keresztül. Lehetővé teszi az egyidejű elemzése ezek a különböző populációk az azonos minta, hESC, hPSC-RPE sejtek, valamint optikai vesicle sejtek jelölt CellTrace™ CFSE (0,25 µM) 7 perc, 37 °C-on, vagy CellTrace™ Violet (5 µM) 20 percig 37 °C-on követően a gyártó által megadott protokoll (Thermo Fisher Scientific). Ezután a három sejttípust a gyártó protokollját követve a BD Lyoplate (BD Biosciences) Szűrőpanelekkel festettük. A sejtek vonalkódolása lehetővé tette a három sejtcsoport közötti könnyű megkülönböztetést és a minta variabilitásának minimalizálását a szűrés során. A mintákat 96 lyukú lemezeken elemeztük egy 405, 640, 488, 355 és 561 nm-es lézerrel (BD Biosciences) vagy 405, 638, 488 és 561 nm-es lézerrel (Beckman Coulter) felszerelt Lsrfortessa-n. A nem életképes sejteket 7-AAD (7-aminoaktinomicin D) nukleinsavfestékkel (BD Biosciences) kizárták az elemzésből. Az adatok elemzését a FlowJo v. 10 szoftver (Tree Star) segítségével végeztük. A sejtfelszíni marker képernyőt egyszer 3D optikai vezikulumok, egyszer pedig hPSC-RPE 60.nap.

sejttenyészet

a HESC-vonalakat a HS980 és HS983 korábban xeno-mentes és meghatározott feltételek mellett származtatták és tenyésztették30 (svéd etikai felülvizsgálati Hatóság: 2011/745:31/3). Az adományozók tájékozott beleegyezésüket adták a hESC-vonalak levezetéséhez és későbbi használatához. A WA09 / H9 hesc vonalat a wicell-től szerezték be, és a hrln-521-en (10 6G/mL, Biolamina) a takarmánymentes tenyésztéshez igazították. A sejteket a nutristem hPSC XF táptalajon (Biological Industries), 5% CO2/5% O2 inkubátorban, hrln-521 bevonattal ellátott lemezeken klonális szaporítással tartottuk fenn, és enzimatikusan 1:10 arányban 5-6 naponta passzáltuk.

a CTRL-7-II, CTRL-9-II, CTRL-12-I és CTRL-14-II hiPSC vonalakat a Karolinska Institutet iPSC Core facility (svéd etikai felülvizsgálati Hatóság) biztosította: 2012/208-31/3, 2010/1778-31/4). A donorok tájékozott beleegyezésüket adták a hiPSC vonalak levezetéséhez és későbbi használatához. A sejteket hrln-521 bevonatú lemezeken (Biolaminán) klonális szaporítással tartották fenn NutriStem hPSC XF táptalajon (Biological Industries), 5% CO2/5% O2 inkubátorban, és enzimatikusan 1:10 arányban passzálták 5-6 naponta.

a passzázshoz az összefolyó tenyészeteket kétszer mossuk foszfátpufferelt sóoldattal (PBS) Ca2+ és Mg2+ nélkül, és 5 percig inkubáljuk 37 Kb C, 5% CO2 / 5% O2 hőmérsékleten TrypLE Select-tel. Az enzimet ezután óvatosan eltávolítottuk, és a sejteket friss, előmelegített nutristem hPSC XF táptalajban, enyhe pipettázással gyűjtöttük össze, hogy egysejtű szuszpenziót kapjunk. A sejteket 300 Ft-on centrifugáltuk 4 percig, a pelletet frissen előmelegített nutristem hPSC XF táptalajban reszuszpendáltuk,és a sejteket frissen hrLN-521 bevonattal ellátott edényre vontuk. Két nappal az áthaladás után a táptalajt friss előmelegített nutristem hPSC XF táptalajra cserélték, és naponta cserélték.

hPSC-RPE egyrétegű differenciálás

a differenciálási protokollt leíró lépésenkénti protokoll megtalálható a Protocol Exchange36 oldalon. a hesc-t vagy a hiPSC-t 2,4-es sejtsűrűséggel vontuk be 104 sejt/cm2 lamininbevonatú edényeken (20 ~ g/mL) NutriStem hPSC XF közeggel. Rho-kináz inhibitor (Y-27632, Millipore) koncentrációban 10 6 / ml adunk az első 24 óra, míg a sejtek tartjuk 37 kb 5% CO2/5% O2. 24 óra elteltével a hPSC táptalajt nutristem hPSC XF differenciáló táptalajra cserélték, amely nem tartalmaz bázikus fibroblaszt növekedési faktort (bFGF) és transzformáló növekedési faktort-6 (TGF) (biológiai iparágak), és a sejteket 37 (5% CO2/21% O2) – ra helyezték. A bevonást követő 6. naptól kezdve 100 ng / mL aktív a-T (R&D rendszerek) adtunk a közeghez. A sejteket hetente háromszor etették és 30 napig tartották. Az egyrétegeket ezután tripszinizáljuk TrypLE Select (Gibco, Invitrogen)alkalmazásával 10 percig 37 kb, 5% CO2. Az enzimet óvatosan eltávolítottuk, és a sejteket friss, előmelegített nutristem hPSC XF táptalajba gyűjtöttük, bfgf és TGF nélkül, enyhe pipettázással, hogy egysejtű szuszpenziót kapjunk. A sejteket 300 6-4 percen keresztül centrifugáltuk, a pelletet reszuszpendáltuk, egy sejtszűrőn (40-4) átvezetettük, és a sejteket lamininbevonatú edényeken (hrLN-111 és hrLN-521 20 mg/mL-nél) vetettük be különböző sejtsűrűségekben, 1,4 106-1, 4-104 sejt/cm2 között. A replikált sejteket hetente háromszor etettük a következő 30 napban nutristem hPSC XF táptalajjal, bFGF és TGF nélkül. A hPSC-RPE in vitro differenciálódásához a 3D szuszpenziós EBs – ben követtük a korábban közzétett protokollt10. Röviden, a pluripotens őssejteket rhln-521-en való összefolyásra tenyésztettük, és kézzel lekapartuk, hogy EBs-t állítsunk elő egy 1000 Ft-os pipetta hegyével. Az Eb – ket ezután szuszpenzióban tenyésztettük alacsony rögzítésű lemezekben (Corning) 5-7 604 sejt/cm2 sűrűséggel. A differenciálást egyedi gyártású nutristem hESC XF táptalajon végeztük, amelyben a Bfgf és a TGF a heti kétszeri médiacserével megszűnt. Tíz mikromol Rho-kináz inhibitort (Y-27632, Millipore) adtunk a szuszpenziós tenyészetekhez csak az első 24 óra alatt. 5 hét differenciálódást követően a pigmentált területeket szikével mechanikusan kivágtuk az EBs-ből. A sejteket ezután tryple Select alkalmazásával disszociáltuk, majd egy 20 G-os tűvel és fecskendővel átöblítettük. A sejteket egy sejtszűrőn keresztül vetettük be (~40~, BD Biosciences) LN-bevonatú edényeken 0 sejtsűrűséggel.6-1, 2 604 sejt/cm2 és hetente kétszer etetik a fent említett differenciálódó táptalajjal. A fényes terepi képeket Nikon Eclipse TE2000-s mikroszkóppal, a Canon SX170 IS kamerával pedig a kutak tetejéről történő pigmentáció rögzítésére használták.

Kvantitatív valós idejű PCR

a teljes RNS-t az RNeasy Plus Mini Kit segítségével izoláltuk, és rnázmentes Dnázzal kezeltük (mindkettő Qiagen-ből származik). A komplementer DNS-t (cDNS) a gyártó utasításainak megfelelően szintetizáltuk 1 db teljes RNS-t 20 db 60 ml-es reakcióelegyben, amely véletlenszerű hexamereket és felső index III reverz transzkriptázt (Gibco, Invitrogen) tartalmazott.

áramlási citometria

a sejtek válogatását hPSC-RPE tenyészeteken végeztük 21 vagy 30 napos differenciálás után. A sejteket az említett konjugált antitestekkel inkubáltuk jégen 30 percig. Az FMO kontrollokat minden feltételhez bevonták a negatív és pozitív sejtek azonosítására és kapu-negatív és pozitív sejtek azonosítására. A festett sejteket ezután egy BD FACS Aria Fusion Cell szortírozó (BD Biosciences) segítségével válogattuk a FACSDiva Sofware v8.0.1 segítségével.

közvetlenül a válogatás után 70 000 sejtet hígítottak 100 db 2% – os FBS-ben és 1 mM-es EDTA-t (Sigma) citospináltak 5 percig 400 fordulat / perc sebességgel üveglemezekre. A tárgylemezeket szobahőmérsékleten egy éjszakán át száradni hagyjuk, majd szobahőmérsékleten 4% metanol-mentes formaldehiddel rögzítjük 10 percig, majd immunfluoreszcens festéssel.

immunfluoreszcencia

szövettan és szöveti immunfestés

közvetlenül az eutanázia után 100 mg/kg pentobarbitál intravénás injekcióval (Allfatal vet. 100 mg/mL, Omnidea), a szemet enucleatizálták, és a bleb injekció területét zöld Szövetjelző festékkel (TMD) (Histolab termékek) jelölték meg. Az FS-ben 24-48 órán keresztül történő rögzítés és paraffinba ágyazás előtt intravitrealis injekció formájában 100 db 6% – os pufferolt formaldehidből (solvenco AB) álló FS fixáló oldatot (FS) adtunk be. Négy mikrométeres soros szakaszokat állítottunk elő a TMD-vel jelölt területen keresztül, és minden négy szakaszt hematoxilin–eozinnal festettünk.

az immunfestéshez a diákat xilolban deparaffinizáltuk, Osztályozott alkoholokban dehidratáltuk, majd ddH2O-val és trisz-pufferelt sóoldattal öblítettük (TBS, pH 7,6). Az antigén-visszakeresést 10 mM-es citrát pufferben (trinátrium-citrát-dihidrát, Sigma-Aldrich, pH 6,0) 1:2000 Tween-20 (Sigma-Aldrich) – val érjük el 96 kb-on 30 percig, majd 30 perc szobahőmérsékleten történő hűtés. A tárgylemezeket TBS-sel mostuk és 30 percig blokkoltuk 10% normál szamárszérummal (Abcam), 5% (m/v) IgG-t és proteázmentes szarvasmarha szérumalbumint (Jackson Immunoresearch) tartalmazó TBS-ben hígítva, párásított kamrában. A blokkoló pufferben hígított elsődleges antitesteket egy éjszakán át inkubáltuk 4 CAC-n: humán nukleáris mitotikus készülék fehérje (numa) (1:200, Abcam ab84680), BEST-1 (1:200, Millipore MAB5466), CD140b/PDGFRB (1:100, Santa Cruz Biotechnology sc-432) és CD56/NCAM1 (1:100, Santa Cruz Biotechnology sc-7326, klón ) (kiegészítő adatok 2). Másodlagos antitestek (szamár anti-nyúl IgG (H + L) Alexa Fluor 555 A31572 és szamár anti-egér IgG (H + L) Alexa Fluor 647 A31571, mind a Thermo Fisher Scientific) (kiegészítő adatok 2) hígított 1:200 blokkoló pufferben inkubáltuk 1 óra szobahőmérsékleten. A szakaszokat vektoros Vektashielddel szereltük fel DAPI ((4′,6-diamidino-2-fenilindol)) rögzítő közeggel (Vektor laboratóriumok) 24 60 mm2-es fedőlap alatt.

az immunhisztokémia esetében a diákat deparaffinizálták, majd antigén-visszakeresést (ER2 oldat, pH 9, 20 perc, Leica Biosystems) és festést (IHC protokoll F) végeztek CD140b/PDGFRB (1:100, Santa Cruz Biotechnology sc-432 ) és CD56/NCAM1 (1:100, Santa Cruz Biotechnology sc-7326, klón) antitestekre (kiegészítő adatok 2) Bond RXM műszeren (Leica Biosystems).

a képek Olympus IX81 fluoreszcens invertált mikroszkóppal vagy Zeiss LSM710-NLO pontpásztázó konfokális mikroszkóppal készültek. A képek akvizíció utáni elemzését az ImageJ szoftver segítségével végeztük.

fagocitózis vizsgálat

fluoreszcein izotiocianáttal jelölt szarvasmarhafélék POSs-ját izolálta és kedvesen adta be Dr. E. F. Nandrot az Institut de la Vision-tól, Párizsból37. a hPSC-RPE sejteket transzwellmembránon (0,33 cm2, Corning) tenyésztettük hrLN-521 20 6G/mL-rel bevonva a vetés után 1 hónapig. A sejteket inkubáltuk 37-en (c) vagy 4-en (c) 16 órán át, 2,42-en (106) felolvasztott POS/Transwell DMEM-ben (Dulbecco módosított Eagle táptalaja) vagy CO2-független táptalajon (mindkettő a Thermo Fisher Scientific-től) hígítva. Inkubálás után a sejteket Trypan Blue 0 oldattal leállítottuk.2% (Gibco, Invitrogen) 10 percig szobahőmérsékleten, 4% metanol-mentes formaldehiddel (Polysciences) rögzítve szobahőmérsékleten 10 percig, majd 0,3% Triton X-100-mal permeabilizálva D-PBS-ben 15 percig. Rodamin-falloidin festést (1: 1000, 20 perc szobahőmérsékleten, Biotinum 00027) (kiegészítő adatok 2) használtunk a sejthatárok megjelenítésére. A magokat Hoechst 33342-vel festettük (1: 1000, 20 perc szobahőmérsékleten, Invitrogén).

a képeket Zeiss LSM710-NLO pontszkennelő konfokális mikroszkóppal készítettük. A képek akvizíció utáni elemzését Imaris (Bitplane), a POS kvantifikációkat pedig a CellProfiler 2.1.1 szoftverrel végeztük. Használt modulok: LoadImages, ColorToGrey, IdentifyPrimaryObjects, Measurebjectsizeshape, SaveImages és ExportToSpreadsheet. Az objektumokat egy tipikus 10-40 pixeles átmérővel azonosítottuk két osztály, globális, Otsu, súlyozott variancia küszöbérték módszer alkalmazásával, 0,01 és 1,0 alsó és felső határokkal, valamint 2,1 korrekciós tényezővel, az összetapadt objektumokat intenzitással különböztetve meg.

enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálat

a hPSC-RPE sejteket különböző szubsztrátokkal bevont Transzwell membránokon (0,33 cm2, Millipore) tenyésztettük. A felülúszókat mind a hPSC-RPE apikális, mind a bazális oldalról (azaz a transzwell felső, illetve alsó rekeszéből) 60 órával a közeg cseréje után gyűjtöttük össze. A pedf szekréciós szinteket triplikátumokban mértük minden egyes állapotra a kereskedelemben kapható emberi PEDF ELISA készletekkel (BioVendor RD191114200R), a gyártó utasításainak megfelelően, 60 napos tenyésztés után. Az optikai sűrűség Sreadings segítségével mértük SpectraMax 250 Microplate olvasó (molekuláris eszközök). Az eredményeket átlagként mutatjuk be 6 sem.

TEER mérések

Transzepitheliális elektromos ellenállás A Transzwellekre bevont RPE cellákat (0,33 cm2, Millipore) a Millicell elektromos ellenállás rendszer volt-ohm mérőjével (Millicell ERS-2, Millipore) mértük, a gyártó utasításainak megfelelően. Hatvan napos tenyészeteket egyensúlyoztunk az inkubátoron kívül szobahőmérsékleten 15-20 percig a kísérlet előtt. A méréseket változatlan táptalajon három példányban végeztük minden állapotra, minden kút három különböző helyzetében. A további elemzéshez átlagokat használtunk. A háttérellenállást egy üres tenyészbetét alapján határoztuk meg ugyanabban a közegben, amely a megfelelő szubsztráttal van bevonva, de sejtek nélkül, és kivontuk a megfelelő kísérleti állapotból. A méréseket ohmban mért ellenállásként, a négyzetcentiméterben kifejezett terület szorzataként (6 cm2) kell jelenteni. Az eredményeket átlagként mutatjuk be 6 sem.

pásztázó elektronmikroszkóppal

hPSC-RPE sejteket tenyésztettünk transzwell betéteken, ln521-gyel bevonva (20 ~ g / mL) 60 napon keresztül. Ezeket 2,5% glutáraldehidbe merítéssel rögzítettük 0,1 M foszfátpufferben, pH 7,4. A transwell membránt kivágták és MilliQ vízben mosták, mielőtt etanolos dehidratációt és kritikus pontú szárítást végeztek volna szén-dioxiddal (Leica EM CPD 030). A betéteket a mintacsonkokra szénragasztó fülekkel és vékony platina réteggel bevont porlasztóval (Quorum Q150T ES) szerelték fel. A pásztázó elektronmikroszkópos felvételeket Ultra 55 terepi emissziós pásztázó elektronmikroszkóppal (Zeiss, Oberkochen, Németország) 3 kV-on és az SE2 detektorral szerezték be.

transzmissziós elektronmikroszkópos

hPSC-RPE sejteket tenyésztettünk transzwell betéteken, ln521-gyel (20 Ft / mL) bevonva 60 napon keresztül. Ezeket 2,5% glutáraldehidbe merítéssel rögzítettük 0,1 M foszfátpufferben, pH 7,4. A transzwell membránt vékony csíkokra vágtuk, 0,1 M-es foszfátpufferben öblítettük, majd 2% – os ozmium-tetroxidban, 0,1 M-es foszfátpufferben, pH 7,4-en, 4CC-n 2 órán át. A membráncsíkokat fokozatosan etanolos dehidratációnak vetettük alá, végül LX-112-be ágyazva laposan. Az ultravékony szakaszokat (~50-60 nm) Leica EM UC7 alkalmazásával állítottuk elő, és uranil-acetáttal, majd ólom-citráttal állítottuk elő. A transzmissziós elektronmikroszkópos képalkotást Hitachi HT7700 transzmissziós elektronmikroszkóppal (Hitachi High-Technologies) végezték 80 kV-on, a digitális képeket pedig Veleta CCD kamerával (Olympus Soft Imaging Solutions) készítették.

egysejtű RNS-szekvenáló bioinformatikai analízis

a hatvannapos hPSC-RPE sejteket tryple Select segítségével disszociáltuk, és egy sejtszűrőn keresztül vezettük át őket (60 Kb, BD Biosciences). A PBS-ben 1000 sejt/ml koncentrációban reszuszpendáltuk őket 0,04% BSA-ban. A sejteket 4-nél szállítottuk kb C Az eukarióta egysejtű genomikai létesítménybe (ESCG, SciLifeLab, Stockholm, Svédország), ahol egy 3′ cDNS könyvtárat készítettek egysejtű RNS-szekvenáláshoz a 10x genomikai platformmal (10x genomika) a NovaSeq 6000 szoftver. Cell Ranger 2.1.Az 1 (10x Genomics) csővezetéket arra használták, hogy az Illumina base call fájlokat fastq formátumba konvertálják, a szekvenálást a hg19 transzkriptómához igazítsák a STAR aligner38 segítségével, és funkció-vonalkód mátrixokat generáljanak. A cell Ranger minőségellenőrző szűrt cellákat (718, 810, 931 és 1129 sejttartalmú cseppeket rögzítettünk CD140b+GD2 -, CD140b+CD184−, replated 1:20 és hESC minták) elemeztük az R 3.5.1 (R Core Team)39 verzióban, a Seurat suite 2.3.440, 41 verziójával. Mint egy további minőség-ellenőrzési intézkedés, RPE sejtek egyedi expresszált gének (≥2000 ≤5000), UMIs (≥10.000 ≤30,000), illetve százalékos UMI feltérképezése MT gének (≥0.025 ≤0.10) választottak. Hasonlóképpen, hESC támogatásával expresszált gének (≥2000 legfeljebb 8000), UMIs (≥10.000 ≤80,000), illetve százalékos UMI feltérképezése MT gének (≥0.025 ≤0.10). Ez a szűrési lépés 616, 725, 779 és 905 cellák végleges adatkészletét eredményezte a CD140b+GD2−, CD140b+CD184−, replated 1:20 és hESC minták esetében. A dimensionality reduction by főkomponens (PC) analízis előtt az UMIs által vezérelt génexpresszió sejt–sejt variációja, a mitokondriális génexpresszióés a sejtciklus szakaszai az adatskálázási folyamat során visszafejlődtek42. Az RPE mintákon belüli változó géneket normalizált átlagos expressziójuk és diszperziójuk alapján választottuk ki (expressziós határérték = 0,0125-5, alsó diszperziós határérték = 0,5). A PC kiválasztásánál a PCHeatmap, a jackStraw, a PC standard deviációk és a Clustree analízis eredményeit értékelték43. Az első 15 PC-t a tSNE projection44 és a klaszterezés elemzéséhez használták (felbontás = 0,1, zavar = 40).

a sejtcsoportokat két megközelítéssel elemeztük. A felső differenciál géneket először minden klaszternél azonosították Wilcoxon rangösszegének tesztjével. Másodlagos, aláírás génexpressziót (modul pontszámokat) számítottak ki a differenciálatlan hESC-re és számos sejttípusra, amelyek jelen vannak az emberi retinában. A Mezoderma markereket expresszáló sejteket manuálisan külön klaszterbe osztottuk a Seurat interaktív ábrázolási funkcióinak felhasználásával. Az adatok feltöltése ArrayExpress (EMBL-EBI) – lásd a részleteket alább.

állatok

az Észak-Stockholmi állatkísérleti Etikai Bizottság (DNR N25/14) jóváhagyását követően 10 új-zélandi fehér albínó nyulat (a Lidk Xhamsterpings nyúlfarm, Lidk Xhamsterping, Svédország) használtak ebben a vizsgálatban 5 hónapos, 3,5-4,0 kg testtömegű nyulakat. Minden kísérletet az állatok szemészeti és Látáskutatásban való felhasználására vonatkozó Nyilatkozatnak megfelelően végeztünk.

Szubretinális transzplantáció

a hPSC-RPE monorétegeket PBS-sel mossuk, tryple-vel inkubáljuk, és egysejtű szuszpenzióvá disszociáljuk. A sejteket Neubauer hemocytometer kamrában számoltuk 0,4% Trypan blue (Thermo Fisher Scientific Corp.) alkalmazásával, 300 ml-en centrifugáltuk 4 percig, majd a sejtpelletet frissen szűrővel sterilizált PBS-ben reszuszpendáltuk 1000 sejt/6L végső koncentrációra. A sejtszuszpenziót ezután aszeptikusan alikvotálták 600 MHz-es egységre, és a műtétig jégen tartották.

az állatokat 35 mg/ttkg ketamin (Ketaminol, 100 mg/mL, Intervet) és 5 mg/ttkg xilazin (Rompun vet) intramuscularis adagolásával altatták általános érzéstelenítésben. 20 mg/mL, Bayer Animal Health) és a pupillákat 0,75% ciklopentolát/2,5% fenilefrin (APL) keverékével tágították ki. A mikrosebészeteket mindkét szemen 2 portos, 25 G-os transzvitreális pars plana technikával (Alcon Accurus, Alcon Nordic) végeztük a korábban leírtaknak45. A sejtszuszpenziót egy hosszabbító csőhöz és egy 38 g polytip kanülhöz (MedOne Surgical Inc.) csatlakoztatott 1 mL-es fecskendőbe szívtuk. Előzetes vitrectomia nélkül a kanült a felső temporális trokáron keresztül helyezték be. A megfelelő csúcspozícionálás után, amelyet fokális retina fellángolással állapítottak meg, 50 000 sejtszuszpenziót (ami 50 000 sejtnek felel meg) lassan injektáltunk szubretinálisan ~6 mm-rel a látóideg fejének alsó széle alatt, egységes blebet képezve, amely jól látható volt a működési mikroszkóp alatt. A reflux minimalizálása érdekében ügyeltek arra, hogy az injekció beadása során a hegy a bleb-ben maradjon. A műszer eltávolítása után könnyű nyomást gyakoroltunk az önzáró varrat nélküli szklerotómiákra. Két mikrogramm (100 Ft) intravitrealis triamcinolont (Triescence, Alcon Nordic) adtak be 1 héttel a műtét előtt, és nem adtak műtét utáni antibiotikumokat.

statisztika és reprodukálhatóság

a statisztikai analízisek során kétirányú varianciaanalízist és post hoc többszörös összehasonlításokat végeztek Tukey-teszt korrekciójával a különböző vizsgált sűrűségek in vitro különbségeinek és a replikált állapotokhoz viszonyított válogatásnak a értékelésére TEER és PEDF szekréciós vizsgálatokban.

minden kvantifikációt vakon végeztünk. Statisztikai paraméterek, beleértve az n definícióit és pontos értékét (pl. a kísérletek teljes száma, replikációk stb.), az eltéréseket, a P értékeket, valamint a statisztikai tesztek típusait az ábrák, a megfelelő ábrák, valamint ebben a szakaszban mutatjuk be. A statisztikai elemzést Prism 7 (GraphPad szoftver, 7.0 c verzió) segítségével végeztük. Minden esetben statisztikai elemzést végeztek legalább három biológiailag független kísérleti replikáció adatain. A csoportok közötti összehasonlításokat a statisztikai tesztelés előtt tervezték, és a célhatás méretét nem határozták meg előre. A grafikonokon megjelenő hibasávok legalább három független kísérlet átlagát képviselik. Az összes bemutatott mikrográf három független kísérlet reprezentatív képe, hacsak másként nem jelezzük (pl. 1c).

jelentés összefoglaló

a kutatási tervezéssel kapcsolatos további információk a cikkhez kapcsolódó Nature Research Reporting Summary-ban találhatók.