eredmények

a celluláris p107 szintek modulációja ellenőrzött proteolízissel. Korábban kimutattuk, hogy az endogén P107, az RB fehérjecsalád tagja, amely nem az SCF Xhamtrcp természetes szubsztrátja, eliminálható a c33a méhnyakrák sejtjeiben egy kiméra kiméra (adapcitin–e7n) ubiquitin-protein ligáz (oncoprotein E7 (E7N) N-terminális 35-aa maradványaiból származó P107-kötő peptid méhen kívüli expressziójával (1). Számos sejtfehérje működését azonban intracelluláris bőségük határozza meg, nem pedig egyszerűen jelenlétük vagy hiányuk. Eddig nem volt megbízható módszer az emlőssejtek intracelluláris fehérjeszintjének pontos modulálására.

először azt vizsgáltuk, hogy a P107 szintek szisztematikusan csökkenthetők-e különböző mennyiségű intraventrcp-E7N kontrollált expressziójával. a humán c33a cervicalis carcinoma sejteket egyre növekvő dózisú rekombináns adenovírussal fertőztük meg, amely az intraventrcp-E7N-t vagy a kontroll adenovírust hordozta 24 órán keresztül. A fertőzés 100% volt, még a legalacsonyabb alkalmazott dózis mellett is, az adenovírus által az összes recipiens sejtben hordozott GFP expressziója alapján (az adatok nem jelennek meg). Amint az ábrán látható. 1 (Felső), az endogén p107-szinteket szisztematikusan a steady-state szintek 78% – ára, 25% – ára és 5% – ára csökkentették, amikor a c33a sejteket rekombináns xhamstertrcp-E7N adenovírussal transzdukálták 10, 35 és 80 mois mellett, de nem azonos dózisú Ad1 kontroll vírussal. Ezért a módosított SCF-Dcctrcp-BP egyszerű és reprodukálható eszközt kínál a célfehérjék teljes mennyiségének meghatározott szinteken történő csökkentésére a biológiai aktivitásra gyakorolt dózishatások vizsgálatához.

a P107 stabilan kapcsolódik a ciklin A-hoz és a Cdk2-hez a proliferáló sejtek nagy affinitású kötőhelyén keresztül (13-15). Annak megvizsgálására, hogy ezeket a p107-hez kapcsolódó fehérjéket is célirányos degradációnak vetették-e alá az intraventrcp-E7N által, immunoblotolást végeztünk az Ad-F-TrCP-E7N vírussal fertőzött C33A sejtekben. Amint az ábrán látható. 1, az endogén ciklin A és Cdk2 szint változatlan maradt, míg a p107 drámaian csökkent. Továbbá az F-TrCP-E7N nem befolyásolta a nem célcsoportba tartozó ons-aktin szintjét (ábra. 1). Ez az eredmény erős bizonyítékot szolgáltatott arra vonatkozóan, hogy a megtervezett adaptrcp-E7N ubiquitin–fehérje ligáz specifikusan lebontja a megcélzott P107 szubsztrátot, de a hozzá kapcsolódó fehérjéket nem.

a Célfehérje specifikus Poszttranszlációsan módosított szubpopulációjának szelektív lebomlása. A sejtfehérje módosítása poszttranszlációs szinten, például foszforilezés, alapvető eszköz a sejtek számára a funkció szabályozására vagy a fehérje új tevékenységeinek biztosítására. Egy adott poszttranszlációs módosítási eseményhez társított funkció boncolására szolgáló kísérleti eszközök jelenleg korlátozottak. Mivel a protein knockout poszttranszlációs szinten működik, amely közvetlenül felismeri a célfehérjéket, az egyik alkalmazás egy specifikus E3 megtervezése, amely képes kiválasztani a poszttranszlációsan módosított fehérjék alcsoportját a lebomlás érdekében, ahelyett, hogy elpusztítaná az egész populációt.

a HPV16 E7 szelektíven kötődik az RB (16) hipofoszforilezett formájához. Megvizsgáltuk, hogy a kiméra DCG-e7n ubiquitin – protein ligáz képes-e megkülönböztetni a hipo-és hiperfoszforilált RB-t, és csak a hipoformot választja-e ki a lebomláshoz. Az emberi u2os osteosarcoma sejtek expresszálják az RB mindkét formáját, amelyek könnyen azonosíthatók, az SDS/PAGE különböző elektroforetikus mobilitása alapján (ábra. 2A, 1. sáv) (17). E két RB faj azonosságát immunoblottálással tovább igazoltuk, az RB hipo – vagy hiperfoszforilált formáira specifikus antitestek alkalmazásával (ábra. 2a, 2. és 3. sáv). Az U2OS sejteket rekombináns Ad-F-TrCP-E7N-nel vagy a kontroll Ad1 adenovírusokkal fertőztük meg 48 órán keresztül, és az RB-P és az RB egyensúlyi állapotát egyidejűleg Western blot-tal elemeztük, egy anti-RB monoklonális antitest alkalmazásával, amely felismeri mindkét formát. Összhangban az e7n hipofoszforilezett RB-hez való preferenciális kötődésével, az F-TrCP-E7N ektopiás expressziója a hipofoszforilezett RB eliminációját eredményezte, míg a hiperfoszforilezett RB-P érintetlen maradt (ábra. 2b felső, hasonlítsa össze a 4-6 sávokat az 1-3 sávokkal). Ez az eredmény kiemeli a módosított F-TrCP-E7N ubiquitin–fehérje ligáz képességét az RB specifikus alcsoportjának kiválasztásában a lebomlás érdekében, amely a célfehérje bizonyos poszttranszlációs módosításának állapotán alapult.

a teljes hosszúságú HPV16 E7 kölcsönhatásba léphetett a ciklin-függő kináz inhibitorokkal p21Waf1 és p27Kip1, de a kötő domént a C-terminális doménhez (40-98 maradék) rendelték az E7N fragmentum helyett (18-20 maradék). Az F-TrCP-E7N specificitásának további vizsgálata érdekében ugyanazokat az U2OS sejtkivonatokat p21Waf1 és p27Kip1 elleni antitestekkel is megvizsgálták. Amint az ábrán látható. 2B (középső), a p21waf1 és a p27Kip1 egyensúlyi szintje változatlan maradt. Összességében a módosított F-TrCP-E7N proteolitikus specifitást mutatott az RB család fehérjéivel szemben, de nem mutatott más sejtciklus-szabályozókat, mint például a Cdk2, a ciklin A, a p21Waf1 és a p27Kip1.

szerkezet-alapú mutagenezis egy nagyon specifikus adaptrcp-E7N Ubiquitin–fehérje ligáz előállításához. A kiméra adaptrcp-E7N továbbra is képes megkötni az endogén adaptrcp szubsztrátokat, beleértve az IkB-t, a CA-katenint és az ATF4-et (3-7). A túlexpresszió a DCC-E7N zavarhatja ezen natív szubsztrátok lebomlását. Ezzel szemben az endogén szubsztrát kötődése az xhamtrcp-E7N-hez zavarhatja a tervezett szubsztrát megfelelő elhelyezkedését, hogy elfogadja az ubiquitint az ubiquitin-konjugáló enzimből, ezért csökkenti a célzott lebomlás hatékonyságát (ábra. 3AUpper). Továbbá, az enterprcp kölcsönhatásba lép egy pszeudo szubsztráttal, a hnRNP-U-val, amely leköti a sejtmagban az xhamstertrcp-t és származékait, és kizárja a szubsztrátokkal való kölcsönhatásukat (21). Az aminosavmaradékok specifikus mutációinak bevezetésével az xhamtrcp-n, hogy kiküszöböljük a kötődését a xhamsterhez-catenin, IkB, vagy hnRNP-U, arra számítunk, hogy nemcsak a specifitást, hanem a A tervezett szubsztrát toborzása céljából a megtervezett adaptrcp-E7N elérhetősége (ábra. 3alsó).

a szubsztrát-kötő doménje a C-terminális régióban hét WD40 ismétlést tartalmaz, amelyek a WD40 fehérjék (3-7) között konzervált tipikus hétpengésűekké válnak. Mivel a WD40 fehérjék deprogram-propellerszerkezetének általános integritása kritikus fontosságú a funkcióik szempontjából, a standard deléciós mutagenezis megközelítés valószínűleg durva szerkezeti változásokat idéz elő, ezért nem alkalmazható szubsztrátkötő helyek meghatározására az dprc-n. A WD40 fehérjék ismert kristályszerkezetét azonban ki lehet használni, hogy azonosítsuk a felszíni maradványokat, amelyek részt vesznek a kötőanyagban. A szerkezet-alapú mutagenezis megközelítést öt pozitív töltésű maradék (R285, K365, R474, R521 és R524) azonosítására és mutációjára tervezték, amelyek várhatóan a WD40 propeller felső felületén helyezkednek el, amelyek részt vesznek a WD40-hez kapcsolódó fehérjékhez való kötődésben (ábra. 3B) (22). Ezt a megközelítést a támogató módszerek részletezték, amelyet támogató információként tesznek közzé a PNAS webhelyén. Is, lásd ábra. 6, amelyet támogató információként tesznek közzé a PNAS webhelyén. Ezen túlmenően ezeknek a Lys/Arg maradékoknak a szubsztitúciói valószínűleg nem változtatják meg a teljes intraventrcp struktúrát.

a QuikChange multisite-directed mutagenesis kit (Stratagene) használatával ezeket a maradványokat egyidejűleg Glu-ra mutáltuk. Ez a zászló által megjelölt vegyület mutáns, kijelölt F-TrCP(m1) – E7N, teszteltük, hogy kötődik-e mind az endogén (IkB), mind a tervezett (p107) kiütési célokhoz. A HeLa sejteket átmenetileg transzfektáltuk F-TrCP(m1)-E7N vagy F-TrCP-E7N-nel, és az IkB-vel és a p107-tel való kölcsönhatásukat coimmunoprecipitációval határoztuk meg. Az F-TrCP-E7N és az F-TrCP hasonló affinitást mutatott, mint a foszforilált IkB fehérje, míg az M1 mutációk megszüntették az F-TrCP(m1) – E7N kötődést (ábra. 3C középső). Ezzel szemben a P107 hasonló szintjét észlelték az F-TrCP-E7N vagy az F-TrCP(m1)-E7N immunkomplexeiben (ábra. 3C alacsonyabb), jelezve, hogy a tervezett F-TrCP(m1)-e7n ubiquitin–fehérje ligáz teljes mértékben működőképes a tervezett sejtcélok toborzásában. Ezek az eredmények összhangban vannak az ábrán látható strukturális előrejelzésekkel. 3b, továbbá meghatározza az endogén szubsztrát felismerés szempontjából kritikus aminosavmaradványokat az xhamstertrcp-n.

a módosított F-TrCP(m1)-E7N-t tovább elemeztük az endogén p107 lebontásában kifejtett hatásossága szempontjából. A C33A sejteket F-TrCP, F-TrCP-E7N vagy F-TrCP(m1)-E7N, valamint CD19 expressziós plazmiddal együtt kotranszfektáltuk. Negyvennyolc órával a transzfekció után a sejteket összegyűjtötték és dúsították a transzfektált plazmidokat kapók számára az anti-CD19 monoklonális antitesthez konjugált immunmágneses gyöngyök felhasználásával. Az endogén p107 szinteket ezt követően immunoblottálással határoztuk meg. Amint az ábrán látható. Az F-TrCP(m1)-E7N 3D, ektopiás expressziója az endogén p107 szint 95%-os csökkenését eredményezte, míg az F-TrCP-E7N esetében a p107 82% – os lefelé történő szabályozását figyelték meg (ábra. 3D felső, hasonlítsa össze a 4. és 3. sávot). Továbbá az F-TrCP(m1)-E7N expressziója nem volt megfigyelhető hatással a tumor nekrózis faktorára (TNF)-a natív SCF által indukált IKB–degradáció (d) – a natív SCF által) stb., vagy a p27kip1 megsemmisítésére SCFSkp2 ubiquitin-fehérje ligázok (az adatok nem láthatók). Ezért a mesterséges F-TrCP(m1)-E7n ektopiás expressziója nem befolyásolja az SCF általános ubiquitinációs aktivitását azáltal, hogy az endogén F-box fehérjék által megosztott alapvető SCF komponenseket (Skp1, CUL-1 és Rbx1/Roc1) összenyomja.

a célzott P107-degradációt indirekt immunfluoreszcens vizsgálattal tovább értékelték egyedi C33A sejtekben. Következetesen, p107 nagyrészt felszámolták c33a sejtek expresszáló F-TrCP-E7N vagy F-TrCP (m1)-E7N, de nem f-TrCP önmagában (ábra. 3E). Ezek az eredmények együttesen azt mutatják, hogy az endogén adaptrcp szubsztrátok kötőhelyeinek kiküszöbölésével a módosított F-TrCP(m1)-E7N ubiquitin–fehérje ligáz fokozott specifitást és robusztus proteolitikus aktivitást mutatott a tervezett cél felé.

minimális kötési domén, mint célzott peptid a hatékony szubsztrát-toborzás érdekében. A szubsztrát-toborzás magas specificitásának elérése és az egyéb sejtfehérjék nem specifikus célzásának minimalizálása érdekében megvizsgáltuk, hogy az e7n (kijelölt E7m) minimális P107/RB interakciós doménje, amely magában foglalja az E7 21-29 maradékát, amely az LXCXE motívumot öleli fel (23), képes-e elérni a P107 hatékony kötődését és lebomlását. Egy kiméra ubiquitin-protein ligázt hoztak létre, amelyben az xhamstertrcp-t és az E7M-et kovalensen összekapcsolták egy rugalmas 20-aa távtartóval, amely 10 Gly-Ser ismétlésből állt (10gs). Az F-TrCP-E7N-t vagy az F-TrCP-10GS-E7m-et átmenetileg transzfektáltuk C33A sejtekké, és az endogén p107-hez való kötődésüket immunprecipitációval értékeltük az MG132 proteaszóma-inhibitorral végzett kezelés után készített kivonatokban, hogy gátolják a lebomlást ezen kölcsönhatás következtében. Amint az ábrán látható. A 4A (2. és 3. sáv), az F-TrCP-10gs-E7m kissé nagyobb affinitást mutatott a p107-hez, mint az eredeti F-TrCP-E7N. az F-TrCP-E7N és az F-TrCP-10gs-E7m esetében tovább értékelték hatékonyságukat a P107 degradáció során tranziens transzfekcióval a C33A sejtekben, az ábra szerint. 3D.ábrán látható módon. A 4B, az F-TrCP-E7N és az F-TrCP-10GS-E7m a p107 akár 92%-os és 95%-os lefelé történő szabályozását indukálta, ami azt jelzi, hogy a minimális p107-kötő domént hordozó, módosított anti-trcp ugyanolyan hatékonyan működik, mint az eredeti F-TrCP-E7N a lebomló célfehérjékben.

az endogén célpontok tartós degradációja érdekében a módosított adaptrcp retrovírus által közvetített szállítása. Ezután megvizsgáltuk, hogy a tervezett ubiquitin–fehérje ligázok stabilan expresszálhatók-e a tervezett cél tartós lebomlásának elérése érdekében. A HL-60 promyelocytás leukémia sejteket pbmn-GFP-T, F-TrCP(m1)-E7N-t vagy kontroll F-TrCP-E7N-t expresszáló rekombináns retrovírusokkal transzdukáltuk, amelyekben az RB/p107-kötőhelyet törölték(1). A kromoszómálisan integrált Kiméra F-TrCP transzgénekkel fertőzött sejteket FACS válogatással izoláltuk a vírusokból származó GFP expressziója alapján, és az endogén p107 lebomlását a fertőzött HL-60 sejtekből közvetlenül a fertőzés után értékeltük (ábra. 5A), vagy 3 hónapos tenyésztés után táptalajban (ábra. 5B). Továbbá, mivel az RB család fehérjéinek két másik tagja, az RB és a p130 szintén expresszálódik a HL-60 sejtekben, megvizsgáltuk, hogy egyetlen F-TrCP-E7N képes-e egyidejűleg megcélozni a teljes RB fehérjecsalád lebomlását, amelyek kölcsönhatásba lépnek az e7n azonos LXCXE motívumával. a retrovirálisan transzdukált F-TrCP-E7n méhen kívüli expressziója az RB hipofoszforilált formájának, valamint a p107 (ábra. 5A) és p130 (az adatok nem jelennek meg) HL-60 sejtekben, közvetlenül a fertőzés és a FACS válogatás után (ábra. 5A), vagy 3 hónappal a fertőzés és a folyamatos tenyésztés után (ábra. 5B, 3. sáv). Ezzel szemben az F-TrCP-E7N stabil expressziója (XHAMDLYC) a HL-60 sejtekben nem volt hatással a p107, RB megváltoztatására (ábra. 5A, 3. sáv) és p130 szintek (az adatok nem jelennek meg). Összhangban azzal a megfigyeléssel, hogy az F-TrCP-E7N előnyösen lebontja a hipofoszforilezett RB-t az U2OS sejtekben (ábra. 2), a hiperfoszforilált RB Fajok csökkentése az F-TrCP-E7N stabil expressziójával kevésbé volt kifejezett, összehasonlítva a HL-60 sejtekben a hipofoszforilált formával (ábra. 5A, hasonlítsa össze a pRB és a pRB-P 2. sávját).

all-transz retinsavval (ATRA) végzett kezelés esetén a HL-60 sejtek kilépnek a sejtciklusból és terminális differenciálódáson mennek keresztül. Megfigyelték a hipofoszforilált RB felhalmozódását, amelyről korábban beszámoltak arról, hogy hozzájárul az ATRA által kiváltott növekedés leállításához, míg a hiperfoszforilált RB nem volt kimutatható (24, 25). Annak vizsgálatához, hogy az SCF-ből a Sejtciklusból való kilépés során is hasznosítható-e az SCF-ből való kilépés, az F-TrCP-E7N-t vagy az F-TrCP(m1) – E7N-t stabilan expresszáló HL-60-as sejteket 1 db 72 órán át tartó atra-val kezeltük, és az RB család fehérjéinek lebomlását értékeltük. Az F-TrCP-E7N-t stabilan expresszáló HL-60 sejtek az RB, p107 és p130 szintek 95%-os, 98%-os és 85% – os csökkenését eredményezték a kontroll pBMN-GFP vírussal fertőzött sejtekhez képest (ábra. 5B, 2. sáv). Mivel az ATRA aktiválja a gének transzkripcióját a Pbmn-GFP (26) Moloney egér leukémia vírus LTR ellenőrzése alatt, az F-TrCP-E7N fokozott expressziója az ATRA kezelés során valószínűleg tovább hozzájárult a p107, p130 és hipofoszforilált RB hatékony szabályozásához (ábra. 5B).

az RB család fehérjéinek a normál sejtciklus progressziójára gyakorolt hatását egér embrió fibroblasztokban vizsgálták, amelyekben az RB, p107 és p130 gének zavarai voltak, és megállapították, hogy nem reagálnak a G1 leállását kiváltó jelekre, például a növekedési faktor visszavonására vagy a DNS károsodására (27, 28). Az RB családtagok kollektív hatásait azonban a tumorsejtek proliferációjában nem vizsgálták, a hatékony fordított genetikai eszközök hiánya miatt. A stabil HL-60 sejtek expresszálják az F-TrCP-t(m1)-E7N ebből a tanulmányból lehetővé tette számunkra, hogy felmérjük, hogyan reagáltak a tumorsejtek mindhárom RB családfehérje szempontjából hiányosak a G1-letartóztatási jelekre. Exponenciálisan növekvő HL-60 sejtekben, amelyek expresszálják az F-TrCP(m1)-E7N-t, amely az RB család fehérjéinek konstitutív lebomlását indukálta, a sejtciklus progressziójának jelentős gyorsulását figyelték meg a kontroll pBMN-GFP vírus által fertőzöttekkel összehasonlítva (ábra. 5c balra). Ez az eredmény összhangban van az RB–/–, p107–/– és P130–/– triple knockout egér embrió fibroblasztokban megfigyelt G1– s átmenetek csökkent kontrolljával (27, 28).

az ATRA kezelés gátolta a G1-S-fázis átmenetet a kontroll pbmn-GFP által fertőzött HL-60 sejtekben (ábra. 5C) vagy F-TrCP-E7N(DCC) vírus (adat nem látható), amely összhangban van azzal, amit jelentettek a nem fertőzött HL-60 sejtek (ábra. 5C) (24). A G1–S átmenet kezdeti késleltetését a pBMN-F-TrCP(m1)-E7N/HL-60 sejtekben is megfigyelték az ATRA után 48 órával. A G1 teljes leállását azonban a későbbi szakaszban (72-96 óra) nem sikerült elérni, és a sejtek folytatták a sejtciklus progresszióját (ábra. 5C). Ezzel szemben a kontroll pBMN-GFP / HL-60 sejtek mind blokkolva voltak a G1-ben 72 és 96 óra között. ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy az RB családtagok F-TrCP(m1)-E7N által közvetített lebomlása rontja a növekedés leállításához szükséges késői ATRA–válasz eseményt, míg a G1-S progressziójának korai csillapítását nagyrészt nem befolyásolta. Ezenkívül a sejtszám drámai csökkenését figyelték meg az ATRA utáni kezelés 72 és 96 óra között az atra által kiváltott sejtciklus kilépése és differenciálódása során bekövetkező masszív sejthalál miatt (29). Feltűnő, hogy az F-TrCP(m1)-E7N-t expresszáló HL – 60 sejtek átlagosan 2-3-szoros növekedést mutattak a subG1 populációkban a kontroll vírussal fertőzött HL-60 sejtekhez képest (az adatok nem jelennek meg), ami összhangban van az RB–/–, p107–/– és p130–/– tripla knockout egér embrionális fibroblaszt sejtjeinek növekedésgátló körülmények között történő megnövekedett sejthalálával (28). Az F-TrCP(m1)-E7N konstitutív expressziója együttesen indukálta a teljes RB családfehérjék down-szabályozását, ami a növekedés megállításának gátlásához és a sejthalál fokozódásához vezet az ATRA kezelés során.

az ATRA által kiváltott G1 letartóztatás több sejtes jel/komponens összehangolt szabályozását foglalja magában, amelyek negatívan szabályozzák a sejtciklust (lásd ref. 30). Dimberg et al. (31) arról számoltak be, hogy az ATRA eseménysorozatot vált ki a mieloid sejtekben, amely magában foglalja a p21waf1 expressziójának korai növekedését, a p27kip1 stabilizálódását, majd később az RB defoszforilációját a G1 leállításának kezdetén. Mivel az(M1)-e7n) degradálja az RB-család tagjait, és nincs hatással a p21waf1 és a p27kip1 stabilitására, valószínű, hogy csak a késői, RB-függő ATRA választ befolyásolja, ami összhangban van a pBMN-F-TrCP(m1)-E7N/HL–60 sejtek rezisztenciájával a G1 arrestat72-96 h teljesítésére (ábra. 5C). A megfigyelt korai növekedés gátlása ATRA a 48 h (ábra. 5C) legalább részben a p21waf1 és a p27kip1 felfelé történő szabályozásának tulajdonítható, amelyek stabilitását nem befolyásolja a konstitutív F-TrCP (m1)-E7N expresszió (ábra. 2. és 5.).