szisztémás agonista rák az immunterápia a CD4 és CD8 T-limfociták differenciális expanzióját indukálja a limfoid és perifériás szervekben

az anti-CD40 és az IL-2 kombinációja több egér tumor modellben késleltetett növekedést és regressziót indukál . A cell line tumormodelleket használó közzétett adatokhoz hasonlóan az emlő intraepithelialis neoplasia-outgrowth (min-O) modell , egy szövetátültetési vonal kezelése anti-CD40 és IL-2 immunterápiával (IT) jelentős tumorellenes válaszokhoz vezetett (P = 0,0057), beleértve a regressziót a >50%-ban a kezelt egerekben (további fájl 1: S1A ábra). Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy ezek a tumorellenes válaszok a CD8 T-sejteknek köszönhetők, ezért értékeltük a T-sejt fenotípusát a lépben, valamint a tumorban és a tüdőben (gyakori metasztatikus hely sok különböző tumormodell számára). Míg megjegyeztük, hogy a terápia általában indukálta a CD8 terjeszkedését az összes szervben, észrevettünk néhány különbséget a CD8 T-sejt memória fenotípusában a szervhelyek között (további fájl 1: S1B-C ábra).

mi és mások korábban kimutatták, hogy az erős immunstimuláló terápiák a rák indukálja erős proliferációját memória (CD44high) CD4 és CD8 T-sejtek a lépben és a nyirokcsomókban . Azt is megfigyelték, hogy a CD4, de nem a CD8, a T-sejtek szintén aktiváció által kiváltott sejthalálon mennek keresztül interferon(IFN)-függő módon, ami a CD4 T-sejtek jelentéktelen általános kiterjedését eredményezi számokkal ezekben a szervekben a kiindulási értékhez képest . Ezeket az adatokat limfoid szervek leolvasásával állítottuk elő. A MIN-O csapágyban, immunterápiával kezelt egerekben megfigyelt fenotípusok fényében azonban az aktivált T-sejtek expanziója, aktiválása és apoptózisa különbözőképpen befolyásolható a perifériás szövetekben. Ezért arra törekedtünk, hogy tovább jellemezzük és összehasonlítsuk a T-sejtek aktiválódását a perifériás szervekben (ahol az elsődleges tumor és/vagy metasztatikus léziók tartózkodhatnak) és a másodlagos limfoid szervekben (amelyeket gyakran immunterápiás vizsgálatok során vizsgálnak a hatásmechanizmusok értékelésére). Megvizsgáltuk a CD8 és CD4 T sejt (Foxp3neg) gyakoriságát, expanzióját és apoptózisát szisztémásan mind a limfoid, mind a perifériás szervekben. Összhangban van a csoportunk korábbi Jelentéseivel, miközben nem változtatja meg jelentősen az Általános gyakoriságukat (ábra. 1A), az anti-CD40/IL-2 immunterápia a CD8 T-sejtek teljes számának jelentős növekedését eredményezte a lépekben és a nyirokcsomókban (ábra. 1b). A teljes CD8-szám növekedésével összhangban a bromodeoxiuridint (BrdU) in vivo befogadó CD8 T-sejtek gyakorisága jelentősen bővült, és az extracelluláris Annexin v expresszióval értékelt apoptotikus sejtek aránya nem különbözött szignifikánsan a kontrolloktól (C-D ábra). Ezzel szemben a teljes CD4 T-sejt frekvencia csökkent, és a számok nem változtak szignifikánsan az ugyanazon szerveken belüli kontrollokhoz képest (ábra. 1a-b). Míg a CD4 T-sejtek a BrdU beépülésével értékelve bővültek, jelentős részük apoptózison is átesett (ábra. 1c-d) az összes szám nettó jelentéktelen változását eredményezi. Ezek az adatok összhangban voltak a korábban megfigyeltekkel . Amikor megvizsgáltuk a nem limfoid szerveket, beleértve a tüdőt és a májat, hasonló tendenciákat tapasztaltunk mind a CD4, mind a CD8 T-sejtekben, nevezetesen, hogy a CD8 T-sejtek bővültek és túléltek az azt követő összes szervben (ábra. 2A-b), míg a CD4 T-sejtek (Foxp3neg) tágultak és egyidejűleg apoptózison mentek keresztül hasonló mértékben, ami jelentéktelen változásokat eredményezett mind gyakoriságukban, mind számukban (ábra. 2C-d) a periférián.

a T-sejtmemória fenotípusai a CD8 T-sejtekben a másodlagos limfoid szervek és a perifériás nem limfoid szövetek között változnak, az azt követő CD4 T-sejtek azonban nem

egerekben a CD4 és CD8 T-sejtek tovább sorolhatók a memória és a na 6vve fenotípusokba a CD62L (L-szelektin) és CD44 alapján a cd44lowcd62l+ populációval (na), a cd44highcd62l+ populációval (TCM) és a cd44highcd62lneg populációval (effektor) és/vagy effektor memóriával (te/em). Ismeretes, hogy a CD4 és CD8 T-sejtek különböznek ezen részhalmazok eloszlásában a limfoid és perifériás szervekben. Míg a CD4 és CD8 populációkon belül a na 6 frekvenciák viszonylag hasonlóak maradnak, a CD44high populáció inkább a CD8 T-sejtekben torzult központi memória, az effektor memória pedig a nyugvó organizmus CD4 T-sejtjeiben torzult . A perifériás szervekben azonban a szöveti rezidens T-sejtek mind a CD4, mind a CD8 T-sejt részhalmazon belül túlnyomórészt az effektor memória fenotípusába tartoznak .

korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a memória fenotípusú sejtek (CD44high) a fő sejttípus, amely stimuláló immunterápiákat követően bővül . Annak érdekében, hogy jobban megértsük a CD4 és CD8 T sejtek összetételét a különböző szervekben, megvizsgáltuk a memória fenotípus állapotát minden egyes szervben. Nyugalomban a limfoid szervekben a cd44high CD8 T-sejtek populációja túlnyomórészt TCM volt (>90%), míg a perifériás szervekben ~60% TCM-Mel kombinálták (ábra. 3a, c, e, – f). Általában a CD44 magas frekvenciájának általános terjeszkedését eredményezi az összes szervben. A TCM frekvenciák változatlanok vagy enyhén emelkedtek, míg a TE/EM populációk jelentősen bővültek (ábra. 3e-f) ~10% – tól 30% – ig a limfoid szervekben, lenyűgöző módon ~30-85% – tól a perifériás szervekben.

a CD44 T-sejtek Cd4high populációján belül a nyugvó egerek erősebben torzultak a TE/EM fenotípus felé, körülbelül 60-70% – kal a lymphoidban és 75-95% – kal a perifériás szövetekben (ábra. 3b, d). Amint a CD8 T-sejtekben történt, ezt követően a Cd44magas Arány kibővült, de annak a ténynek köszönhetően, hogy a nyugalmi egerek összes szervében annyira erősen torzult a te/EM fenotípushoz, a CD4 TE/EM frekvenciái nagyrészt konzisztensek voltak az IT-vel kezelt egerek összes szervében (ábra. 3e). A TCM CD4 frekvenciák viszonylag alacsonyak és konzisztensek maradtak az összes szervben, mind a pre -, mind a post-IT (ábra. 3f).

az aktivációs markerek expressziója a CD4 és CD8 T-sejtekben a helytől és a memória fenotípusától függ

a proliferáció és az apoptózis különbségei mellett rutinszerűen megfigyeltük, hogy a CD4 és CD8 T-sejtek differenciálisan szabályozzák az azt követő aktivációs és gátló molekulákat. A legjelentősebb példa erre a PD-1, amely a másodlagos limfoid szervekre (lép és LN) összpontosító vizsgálatok alapján előnyben részesítette a CD4-et, nem pedig a CD8 T-sejteket, és valószínűleg részt vett a preferenciális AICD folyamatban, amely a CD4-ben történt, de nem CD8 T-sejtek követik . Egy másik példa az nkg2d preferenciális felszabályozása a CD8 T-sejteken, de nem a CD4, amely a kívülálló által indukált litikus képességet biztosítja a CD8 memória részhalmazának erős citokin-expozíciót követően. Laboratóriumunk korábbi tanulmányai, valamint az ábrán bemutatott adatok. 3 kimutatták, hogy mind a CD4, mind a CD8 T-sejtek közül az elsődleges sejtek, amelyek aktívan szaporodnak és reagálnak rá, a CD44high memória fenotípusú sejtek . Ezért a továbbiakban erre a népességre összpontosítottunk.

a CD44high populációban kimutatták, hogy a proliferáló CD8 T-sejtek nem képesek az antigén-specifikus inger, például a CD25 és a PD-1 aktiválásával összhangban lévő markerek szabályozására, mégis olyan markerek szabályozására, amelyek lehetővé teszik számukra, hogy megszerezzék a kívülálló fenotípusát, nevezetesen az NKG2D-t, amely lehetővé teszi számukra, hogy jobban cselekedjenek nk-szerű, antigén korlátlan módon. Ezzel szemben a CD44 magas, proliferáló (Foxp3neg) CD4 T-sejtek aránytalanul felszabályozzák a PD-1-et (ellentétben a CD8 T-sejtekkel és a Foxp3+ szabályozó CD4 T-sejtekkel), amelyeket javasoltunk, lehetővé teszi számukra, hogy előnyben részesítsék az apoptózis indukcióját . Ezekkel a korábbi jelentésekkel összhangban hasonló fenotípusokat figyeltünk meg a lép és a nyirokcsomó rezidens, IT-kezelt CD44highCD8 + T-sejtek között, amelyek jelentősen szabályozták az NKG2D-t, de nem a PD-1-et (ábra. 4A, c), valamint CD44highCD4+ T sejtek, amelyek erőteljesen szabályozták a PD-1-et, de nem NKG2D (ábra. 4b, d). Amikor ugyanazokat a fenotípusos markereket értékeltük a perifériás, nem limfoid szervekben rezidens T-sejt populációkban, a CD44highCD8 + T-sejt fenotípus jelentősen különbözött a másodlagos limfoid szervekben rezidensekétől. Míg CD44highCD8 + T-sejtek rezidens a tüdő és a máj még NKG2D + CD25neg (ábra. 4A, c), az nkg2d+ sejtek gyakorisága ebben a populációban a limfoid szervek 20-30% – áról a perifériás szervek 40-50% – ára nőtt (ábra. 4a). Továbbá, ellentétben a limfoid szervekkel, ahol a PD-1 expresszió változatlan volt, a PD-1 expresszió szignifikánsan megnőtt mind a tüdőben, mind a májban a CD44highCD8+ populációban (ábra. 4c). Ezzel szemben a CD44highCD4 T-sejt fenotípusa rendkívül hasonló volt a léphez és a nyirokcsomó CD4 T-sejtjeihez az összes szervben (ábra. 4b, d) A PD-1 hasonló expressziójával és az NKG2D minimális upregulációjával. a CD25 egyetlen helyen sem volt szabályozva a CD4 vagy CD8 T-sejtekben (az adatok nem láthatók). Ez váratlan volt, mert korábban már felvetettük, hogy a PD-1 differenciális expressziója valószínűleg a CD4 és CD8 T-sejtek közötti apoptózis differenciális indukciójának mögöttes mechanizmusa erős, immunstimuláló it-kezelést követően. A perifériás szervekben a CD4 T-sejteket továbbra is aránytalanul befolyásolja az apoptózis, annak ellenére, hogy a PD-1 expressziója összehasonlítható a CD4 és a CD8 T-sejtek között. Ez a kialakult minta azért is érdekes volt, mert a megnövekedett aktivációs marker expresszió a periférián úgy tűnt, hogy közvetlenül korrelál a TE/EM túlsúlyával, különösen a PD-1 esetében.

a közelmúltban kimutatták, hogy a keringő TE / EM sejtek expresszálják a PD emelkedett szintjét-1 a pihenő emberekben . Ezért feltételeztük, hogy a CD8 + TE/EM sejtek előnyösen expresszálhatják ezeket az aktivációs markereket a CD8 + TCM-hez képest, ami a CD44highCD8+ T sejtek differenciális frekvenciáit eredményezi, amelyek aktivációs markereket expresszálnak a másodlagos limfoidokban és perifériás szervekben. Ezért értékeltük az NKG2D és a PD-1 expressziót CD8 + CD44highCD25neg TE/EM és TCM sejteken az összes szervben nyugvó és IT-vel kezelt egerekben. A kontroll egerekben mindkét NKG2D (ábra. 5a) és PD-1 (ábra. 5c) nagyobb gyakorisággal expresszálódtak a CD8+CD44highCD25 populáció TE/EM részhalmazán. A te/EM populáció teljes gyakorisága azonban a nyugalmi egerek CD8+ T-sejtjei között viszonylag alacsony a TCM-hez képest (kördiagramok ábra. 5a), ezért összességében mind a PD-1, mind az NKG2D expressziója túlnyomórészt alacsony (ábra. 4) mivel a TCM a CD8+ T-sejtek többségét nyugalomban teszi ki. Az immunterápiával kezelt egerekben mind az NKG2D, mind a PD-1 expresszió növekedett az összes szervben (ábra. 4). Ismét mindkét NKG2D (ábra. 5b) és PD-1 (ábra. 5d) nagyobb mértékben expresszálódtak a TE/EM CD8+ T sejteken, mint a TCM CD8+ T sejteken. A limfoid szervekben, ahol a te / EM populáció bővült a kontrollhoz képest, még mindig szignifikánsan kevesebb volt, mint a CD8+ TCM sejtek (kördiagramok, ábra. 5b), ami kevésbé jelentős bővítéseket eredményez ezeken a helyeken. A limfoid szervekkel ellentétben a vizsgált perifériás szervek többségét CD8+ TE/EM sejtek tették ki (kördiagramok, ábra. 5b), ezáltal az nkg2d és a PD-1 teljes expressziója jelentősen magasabb ezeken a helyeken. Ismét fontos megjegyezni, hogy az immunterápiával kezelt egerek limfoid szerveiben mindkét aktivációs marker teljes expressziója szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a perifériás szervekben, mivel a CD8 populációban a nyirokcsomókban a TCM torzult. Az expressziós szintek nem különböztek nagymértékben a különböző szervek TE/EM-je között (nem voltak szignifikáns különbségek a lymphoid és a perifériás szervek között) ugyanazon kezelési csoportokon belül, de általában növekedtek az IT-kezelésben a kontrollhoz képest, ez a tendencia szignifikánsan kifejezettebb volt az NKG2D-vel, mint a PD-1-vel (ábra. 5). Ezzel szemben a TCM aktivációs marker expressziója viszonylag állandó maradt nemcsak a kezelt csoporton belüli egerek szervei között, hanem a kontroll és az IT-vel kezelt csoportok között is (ábra. 5a-b). Ezek az adatok együttesen azt sugallják, hogy a memória/aktivált medence felépítése (TCM vs TE/EM) súlyosan súlyozza az aktivált T-sejt populáció fenotípusát, különösen a CD8 T-sejteknél, mivel felépítésük nagyban változik a limfoid és a nem limfoid szervek között.

nagy dózisú szisztémás immunstimuláló terápiában részesülő betegek T-sejtjeinek értékelése

ezután azt akartuk felmérni, hogy ezek az eredmények a rák immunstimuláló terápiáiban részesülő humán betegekre fordultak-e. Jelenleg nincsenek olyan vizsgálatok, amelyek a kombinált agonista anti-CD40-et rekombináns humán IL-2-vel értékelnék, azonban rutinszerűen összehasonlítottuk kombinációs terápiánkat más szisztémás immunstimuláló kezelésekkel, beleértve a nagy dózisú TLR agonistákat és a nagy dózisú szisztémás citokin terápiákat, és hasonló fenotípusos és funkcionális változásokat mutattak ki a T-sejtekben, mint a preklinikai modellünkben . Annak felmérése, hogy a klinikán a betegek hasonló változásokat mutattak-e a felszíni marker expresszióban, perifériás vér mononukleáris sejteket (Pbmc-ket) gyűjtöttünk metasztatikus melanómás betegekből szisztémás nagy dózisú IL-2 terápia. A betegek 6X10^5 NE/Kg-ot kaptak 8 óránként a tervezett összesen 14 adagra. A PBMC mintákat egy nappal a kezelés megkezdése előtt (kiindulási állapot) vagy az első terápiás ciklus 8.napján (8. nap) gyűjtöttük A T-sejt fenotípusának értékelésére. Összehasonlítva a kiindulási és a 8. napi mintákat, a PD-1+ memória fenotípus (CD45RO+) sejtek szignifikáns növekedését észlelték mind a CD4, mind a CD8 T-sejt alcsoportban nagy dózisú IL-2 terápiát követően (ábra. 6a-c). Amikor ezt a populációt tovább bontották központi memóriára (CD62L+) és effektor/effektor memóriára (CD62L-) a 8.napon, az effektor/effektor memória részhalmaz szignifikánsan nagyobb PD-1 expressziót fejezett ki, mint a központi memória részhalmaz (ábra). 6d-e). Ezek az adatok együttesen korrelálnak az egérkísérletekben megfigyeltekkel, ami arra utal, hogy ezek az adatok alkalmazhatók humán vizsgálatokra, és indikátorai lehetnek annak, ami lokálisan történik.