vizsgálati terv

VX-765 vizsgálat: öt hónapos vivőanyaggal injektált WT (WT + vivőanyag; n = 18) és J20 egerek (J20 + vivőanyag: n = 14), és VX-765-vel injektált J20 egerek (WT + vivőanyag: n = 14) J20 + VX-765: n = 13) az egereket hosszirányban öt különböző időpontban értékelték: kiindulási alap a kezelés előtt (a kiindulási kezeletlen J20-at csoportosítottuk; n = 19), hetente három IP injekció után VX-765 vagy vivőanyag (1.kezelés), hat további injekció után 2 hét alatt (2. kezelés), 4 hetes kimosási periódus után (WO), majd további három injekció után 1 hét alatt (3. kezelés) (ábra. 1a). Az összes vizsgált állatot bevonták az elemzésekbe, kivéve, ha (a) az állat a kísérlet során elpusztult, vagy (b) az állat viselkedésre nem reagált. Összesen 25 almot használtak, négy különböző kohorszban elosztva, különböző időpontokban tesztelve. Ezen kohorszok közül három nor és nyílt terepi tesztelésen esett át, míg a 4.kohortot a Barnes maze-hez használták. Miután az állatokat a kiindulási vizsgálat során megvizsgálták annak megerősítésére, hogy a J20 állatok viselkedésbeli deficitek, a J20 állatokat véletlenszerűen vagy vivőanyag, vagy VX-765 kezelésre osztották be, függetlenül a viselkedési teljesítménytől. Az összes felhasznált állat közül négy J20 egér nem mutatott viselkedési hiányt a kísérlet elején, és nem használták őket. Két J20 + jármű egér egyáltalán nem mozdult a kísérlet során, viselkedési adataikat kizárták; ezeket az állatokat azonban megtartották, és még mindig használták őket a post mortem elemzéshez.

Casp1 validációs vizsgálat: a VX-765 Casp1-specifikus hatásainak validálásához J20 egereket generáltunk Casp1−/− háttéren. Hetvenhárom egeret használtunk (n = 12-13 genotípusonként, hat különböző genotípus), amelyek mindegyikét 35 donor nőstényből in vitro megtermékenyítéssel (IVF) tenyésztették. A tenyésztés részleteit az alábbi állatkísérletek szakasz ismerteti. Az összes egeret 7 és 8 hónapos kor között vizsgálták, és egyetlen állatot sem zártak ki ebből a vizsgálatból.

az összes egeret 8 hónapos korban feláldozták és feldolgozták. A viselkedési pontozást az egér genotípusa és a kezelés alapján elvakították, és minden állatot véletlenszerűen kijelöltek biokémiai vagy szövettani elemzésre és vakon elemeztek.

VX-765, VRT-043198 IC50 vizsgálatok rekombináns kaszpázokon

állatkísérletek

minden állati eljárás a kanadai állatgondozási Tanács irányelveit követte, és a McGill Egyetem állatgondozási bizottsága jóváhagyta. A J20 transzgenikus egér vonal (Jax Stock No. 006293, Jackson Laboratories, Bar Harbor,ME, USA) kifejezi a svéd (670 / 671KM, NL) és Indiana (717V, F) humán APP mutációkat a pdgf-ons szerint. Hím J20 egereket használtak tenyésztőként, spermájukat pedig IVF kolónia bővítésére használták.

a genotípusokat farokbiopsziával és RT-PCR-rel határoztuk meg. Az egereket csoportosan helyezték el (ketrecenként 2-4 állat) standard Makrolon ketrecekben 12 órás fordított fény / sötét ciklus és ellenőrzött környezeti feltételek mellett. Az étel és a víz ad libitum volt.

a VX-765-öt (Adooq Bioscience, Irvine, CA) 20% cremophorban oldottuk fel dH2O-ban (Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Kanada), és intraperitoneálisan adtuk be. A vivőanyaggal kezelt J20 és WT egerek csak cremophor-t kaptak.

vér–agy gát permeabilitás analízis

öt hónapos J20 és WT egereket érzéstelenítettünk izofluránnal, és a jobb nyaki artériát elválasztottuk. A carotis fal mentén egy kis bemetszést hajtottak végre, és egy mikro-katétert helyeztek be a belső carotis artéria bejáratába. A katétert varrócérna segítségével rögzítették a helyén. A VX-765−öt (50 mg kg−1) 50 ml min-1 (90-120 ml össztérfogaton) infundálták. A mikrokatétert további 5 percig hagytuk a diffúzió lehetővé tétele érdekében, majd a vért szíven belüli szúrással gyűjtöttük össze. Az egeret transzkardiálisan jéghideg sóoldattal perfundálták, és a hippokampuszt és az agykérget kivágták. A mintákat folyadékkromatográfiás és tandem tömegspektrometriás analízisre küldték a Biofarmacy platformra (Universit adapt de Montreal).

viselkedéselemzés

nyílt terepen: a mozgásszervi aktivitást HVS2100 automatizált nyomkövető rendszerrel mértük (HVS Image, Hamptom, Egyesült Királyság). Az egereket a nyílt terepi kamrába helyeztük (40 60 cm plexi doboz, nincs mennyezet és fehér padló), és 5 percig hagytuk felfedezni.

új objektumfelismerés (NOR): az egereket előzetesen két azonos tárgynak tették ki a nyílt terepi kamrában 5 percig. Két órával az előzetes expozíció után az egereket visszatettük a kamrába, és egy ismerős tárgyat és egy új tárgyat 5 percig kitettünk. Az egereket csak egyszer tették ki egy adott tárgynak a különböző vizsgálati munkamenetek során, és az új tárgyak elhelyezését ellensúlyozták az egyes kezelési csoportokon belül. Az új objektum százalékos érintése a tesztfázisban és a diszkriminációs index ((# érintés új − # érintés ismerős)/teljes érintés) értékelésre került.

Barnes maze: A Barnes maze platform (91 cm átmérőjű, a padlótól 90 cm-re emelkedett) 20 lyukból állt (mindegyik 5 cm átmérőjű). Minden lyuk blokkolva volt, kivéve egy céllyukat, amely egy süllyesztett menekülődobozhoz vezetett. Térbeli jelzéseket, erős fényt és fehér zajt használtak arra, hogy motiválják az egereket, hogy megtalálják a menekülést minden munkamenet során. Az adaptációs fázisban minden egér 60 másodpercig kutatta a platformot. minden egér, amely nem találta meg a menekülési dobozt, vezetett hozzá, és 90 másodpercig ott maradt. az akvizíciós szakaszban minden kísérlet ugyanazt a protokollt követte, azzal a céllal, hogy minden egeret kiképezzen a cél megtalálására, és 180 másodpercen belül belépjen a menekülési dobozba. az egerek további 60 másodpercig maradtak a dobozban. napi négy kísérletet, körülbelül 15 perc különbséggel, 4 egymást követő napon keresztül végeztek. A szonda tesztben (5.nap) minden egér egy 90 másodperces próbát végzett. A célpont még mindig ugyanabban a helyzetben volt, de a menekülődoboz blokkolva volt. Mértük a cél eléréséhez szükséges késleltetést és hibákat, valamint az egyes lyukakhoz tartozó egérbökések számát (célpreferencia). Az Y-labirintus egy szimmetrikus Y-alakú labirintusból állt, három karral, 120-szor egymástól, a, B és C jelzéssel. az állatokat az a kar disztális végén helyezték el, és 5 percig hagyták felfedezni a labirintust. A teljes karbejutást és a spontán váltakozást, amelyet három különböző kar egymást követő bejegyzéseként határoztak meg, feljegyezték. Meghatározták a százalékos váltakozást.

Szövetfeldolgozás

az immunhisztokémia esetében az egereket (csoportonként n = 4-6) izofluoránnal érzéstelenítettük, majd transzkardiálisan jéghideg sóoldattal perfundáltuk, majd jéghideg 4%-os paraformaldehiddel (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) 0,1 M foszfátpufferelt sóoldatban. Az agyat 10%-os semleges pufferelt formalinban (Thermo Fisher Scientific, Mississauga, ON, Kanada) 16 órán át rögzítették, és 70%-os etanolba helyezték át. Az agyat paraffinba ágyazták, és 4 MHz-en metszették.

western blot és ELISA esetén (n = 4-8 csoportonként) az érzéstelenített egereket cervicálisan kificamították, a hippokampuszt és az agykérget kivágták és azonnal lefagyasztották szárazjégen. A fehérjéket 5 db térfogat/tömeg arányban extraháltuk RADIOIMMUNPRECIPITÁCIÓS assay (RIPA) pufferrel (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% NP-40, 150 mM NaCl, 0,25% Na-dezoxikolát, 1 mM EDTA, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 1 mM PMSF, 10 ml ml−1 proteáz inhibitor koktél (Sigma-Aldrich)) jégen Szövet homogenizátorral (OMNI International, Kennesaw, GA, USA). A mintákat centrifugáltuk (20 000 db g, 4 db C) 20 percig, a felülúszót visszanyertük, és a fehérjét BCA módszerrel számszerűsítettük. A RIPA-oldhatatlan pelletet 70% hangyasavban dH2O-ban extraháltuk, elpárologtattuk, majd 200 mM-es trisz-HCl-ben resolubilizáltuk, pH 7,5.

Immunhisztológiai festés

az epitópokat citrátban (10 mM Tris-Na citrát, pH 6,0) vagy EDTA-ban (10 mM Tris bázis, 1 mM EDTA, 0,05% Tween-20, pH 9.0) antigén-visszakeresési puffer, és a Dako Autostainer Plus automatizált diaprocesszor és az EnVision Flex rendszer (Dako, Burlington, ON, Kanada). A depardiaffinizációt és a rehidrációt követően a szekciókat peroxidázzal kezelték, szérummentes proteinblokkban blokkolták, és az EnVision Flex antitest hígítószerrel hígított következő antitestekkel immunszaporították: 1:2000 rabbit Anti-Iba1 (Wako 019-19741, Richmond, VA, USA), 1:8000 rabbit anti-GFAP (Dako Z-0334), 1:2000 rabbit anti-A 6-1-40 (f25276, laboratórium által kifejlesztett) és 1:1000 egér antisynaptophysin (Sigma-Aldrich s5768). A szekciókat a készlethez mellékelt megfelelő egér vagy nyúl HRP-konjugált másodlagos antitesttel kezeltük, és DAB-val vizualizáltuk. A szekciókat hematoxylin ellenfestéssel, dehidratálással és permount (Fisher Scientific) borítással látták el. A szakaszokat digitálisan szkennelték a Mirax SCAN segítségével elemzés céljából (Zeiss, Don Mills, ON, Kanada). Deparaffinizálás és rehidráció után a diákat szűrt 1%-os vizes Tioflavin-S-vel (Sigma-Aldrich) festettük.

kvantitatív immunhisztológiai analízis

a hippokampusz CA1 régiójának kérgében és elülső részében lévő Iba1-pozitív sejteket a területszámláló keret módosított változatával számszerűsítettük48. Röviden, minden ötödik diát számszerűsítettünk (agyonként négy szakaszt eredményezve). A MIRAX vizsgálattal több, 80-as számú képet készítettünk az érdeklődési területen belül, és az Iba1-pozitív sejtek számát manuálisan megszámoltuk. A numerikus sűrűség (a sejtek száma mm−3) az elülső CA1 régióban és a kéregben becsülhető. A megbízható becsléshez területenként legalább 150 találat szükséges. További szakaszokat számoltunk, ha nem tudtuk elérni a minimális számot. A mennyiségi meghatározást vakon végezték a kezelés és a genotípus szempontjából. Az ImageJ szoftvert (NIH, Bethesda, MD, USA) használták a CA1 régióban és az agykéregben a CA1 akkumuláció, a GFAP és a szinaptofizin immunopozitív festődés mérésére. Agyonként négy szakaszt elemeztek, és minden egyes szakaszon belül több képet készítettek, hogy lefedjék a CA1 régiót és az agykérget. A küszöb minden agyra egyformán igazodott, hogy kiemelje a foltos területet, és a részecskéket elemezték a festés teljes területének meghatározásához. Az eredményeket az elemzett teljes területenként festett teljes területként fejezzük ki (6m2 mm−2). A reprezentatív képeket csak a méretkorlátozásoknak megfelelően vágták le, és nem végeztek utófeldolgozást.

Western blot

Egérfehérjemintákat (25-100 6G) Laemmli-ban (5% 2-KB−merkaptoetanol, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 1 mM PMSF, 10 ml ml-1 proteáz inhibitor koktél (Sigma-Aldrich)) készítettünk, 5 percig forraltuk, majd poliakrilamid gélelektroforézissel (PAGE) elválasztottuk. A mintákat a következő primer antitestekkel vizsgáltuk, vagy 5% zsírmentes száraz tejben hígítva trisz-pufferelt sóoldatban és 0,1% Tween-20 vagy PBS blokkoló pufferben (Thermoscientic): 1:1000 egér anti-human A A (6e10) (BioLegend 803001, San Diego, CA, USA), 1:2000 nyúl anti-APP C-terminus (Sigma-Aldrich A8717), 1:1000 nyúl anti-neprilysin (Abcam ab79423), 1:500 nyúl anti-IDE (Abcam ab32216), 1:1000 nyúl Anti-kaszpáz-3 (sejtjelzés 9665), 1:1000 egér antiaktív kaszpáz-8 (sejtjelzés 8592), 1:1000 nyúl Anti-kaszpáz-9 (sejtjelzés 9504), és 1:5000 egér Anti-ons-aktin (Sigma-Aldrich a5441). A blot-okat 1:5000 HRP-hez kapcsolt anti-egérrel (ge Amersham NA9310, Montreal, QC, CA) vagy 1:5000 anti-nyúl (Dako P0217) másodlagos antitesttel detektáltuk, amelyet ECL (GE Amersham) követett. Az immunreaktív sávokat imagequant LAS 4000 képalkotó rendszerrel (Fujifilm USA, Valhalla, NY, USA) vizualizáltuk, a denzitometriás elemzéseket pedig Image Gauge analysis szoftverrel (Fujifilm USA) végeztük. A nyers blotok fényerejét/kontrasztját az Adobe Photoshop CS5 szoftverrel (Adobe Systems, Ottawa, ON, CA) a teljes képen egyformán beállítottuk reprezentatív képek előállításához. További módosítás nem történt. A CanvasTM X szoftvert (Acd system, Plantation, FL, USA) használták a végső számok létrehozásához. A western blotok nyers blotjai a 11. kiegészítő ábrán találhatók.

Elisa

Pro – és gyulladáscsökkentő citokinek, valamint az egér agyában az a-szintek meghatározása a Meso Scale Discovery (Rockville, MD, USA) elektrokemilumineszcens immunvizsgálati készleteivel történt. A szabványokat és a mintákat a gyártó protokolljai szerint készítették el, és két példányban futtatták. A ten-plex egér proinflammatory panelt egér hippocampus és kortikális és mintákhoz használták. Az egér plazmájának mérésére egyetlen Il-1 ons készletet használtak. A négyplex humán proinflammatorikus panelt használtuk a HPN mintákhoz (lásd alább). A négypaneles humán a 6e10 készletet egér hippocampus és cortex, valamint HPN mintákhoz használták.

RNS extrakció és cDNS szintézis

a teljes RNS-t egér hippocampusából és cortexből (csoportonként n = 3) kivontuk Qiazollal (Qiagen, Valencia, CA, USA), majd 20-as méretű tűvel homogenizáltuk. A miRNeasy mini kit, beleértve az oszlopon lévő DNáz kezelési lépést, a teljes RNS (Qiagen) tisztítására használták. Az RNS minőségét és mennyiségét spektrofotométerrel határoztuk meg (DS-11 FX+, DeNovix, Wilmington, DE, USA). Five hundred nanograms of total RNA was reverse transcribed for each sample (with avian myeloblastosis reverse transcriptase (AMV-RT)) (Roche, Mannheim, Germany).

PCR and real-time PCR

HAPP transgene PCR amplification was performed using Taq DNA polymerase (New England Biolabs, Whitby, ON, Canada) using the following primers: (hAPP) 5′-AACACAGAAAACGAAGTT-3′ and 5′-CCGATGGGTAGTGAAGCA-3′ (480-bp amplicon)31, (Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase, HPRT) 5′-GTAATGATCAGTCAACGGGGGAC-3′ and 5′-CCAGCAAGCTTGCAACCTTAACCA-3′ (177-pb amplicon) (Carcinogenesis). A termékeket a RedSafe-n (FroggaBio, North York, ON, Kanada) 2% – os agaróz gélekkel festették. Valós idejű PCR kísérleteket végeztünk SYBR Green Taq Mastermix (Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD, USA) egy alkalmazott Biosystems 7500 gyors valós idejű PCR rendszer gép (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). A gén amplifikációt a következő primerekkel végeztük: (18S) 5 ‘-GTAACCCGTTGAACCCCAT-3 ‘és 5′ – CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3′; (IDE) 5’ – ACTAACCTGGTGGTGAAG-3 ‘és 5′ – GGTCTGGTATGGGAAATG-3′; (Neprilizin) 5′- TCTTGTAAGCAGCCTCAGCC-3′ és 5′- CTCCCCACAGCATTCTCCAT-3’. Az eredményeket fold-indukciós értékekben fejezzük ki, amelyek a HPRT és a 18S referencia géneket jelentik a Pfaffl módszerével.

egér szinaptikus plaszticitás RT2-Profiler PCR tömb

az egér szinaptikus plaszticitás RT2 Profiler PCR tömb (PAMM-126z, Qiagen) a tanulás és a memória során a szinaptikus változásokban részt vevő 84 gén expresszióját, valamint öt háztartási gént (~- aktin; ~ -2-mikroglobulin; gliceraldehid 3-foszfát-dehidrogenáz, GAPDH; ~ – glükuronidáz, Gusb; Hősokk fehérje 90 alfa (citoszol), Hsp90ab1) valós idejű PCR-rel. A teljes RNS-t (465 ng minden mintára) reverz transzkripcióval írtuk át (amely tartalmazott egy genomi DNS eliminációs lépést) a gyártó protokollját követve (első szál cDNS szintézis készlet, Qiagen). A valós idejű PCR reakciót valós idejű cycler ABI 7500-ban (gyors blokk) (alkalmazott bioszisztémák) hajtottuk végre az RT2 SYBR Green/ROX PCR master mix (Qiagen) alkalmazásával. A kerékpározás feltételei a következők voltak: 2 perc 50 KB-nál, 10 perc 95 Kb-nál, 40 ciklus, egyenként 15 perc 95 Kb-nál, és 1 perc 60 KB-nál. A küszöbértéket és a kiindulási értéket manuálisan állították be a gyártó utasításainak megfelelően. Az adatokat az öt háztartási gén mértani átlagára normalizáltuk, és összehasonlító Ct-módszerrel (2−ons) elemeztük.

neuronális sejttenyészet és axonális degenerációs vizsgálat

tizenkét – tizenhat hetes magzati kortikális szövetet nyertünk a születési rendellenességek Kutatólaboratóriumából (University of Washington, Seattle, USA) a McGill institutional review board jóváhagyott protokolljának megfelelően. A HPN-t a tripszinnel disszociált agyból tenyésztettük, dezoxiribonukleáz I-vel kezeltük, és 130, 70 és 30 MHz-es nejlonhálón szűrtük21. A disszociált sejteket 10 percen át centrifugáltuk 300 g-on, majd reszuszpendáltuk minimális esszenciális táptalajban (mem) Earle-sókkal, és kiegészítettük 5%-os dekomplementált BCS-vel, 1 db penicillin-sztreptomicinnel, 1 mM-es nátrium-piruváttal és 2 mM-es L-glutaminnal (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). A sejteket 3 606 ml-1 sejtsűrűséggel vetettük be 5 0 g ml-1 poli-l-lizinnel bevont hatkútú szövettenyészeti lemezeken (Sigma-Aldrich). A MEM táptalajt 2 naponta cserélték, és az asztrocita proliferációt fluorodeoxyuridince (FdU) antimitotikus kezeléssel (1 mM, Sigma) korlátozták az első 4 napban. A neuronális tenyészeteket 7-10 nappal a kísérletek elvégzése előtt termesztettük. Négy különböző neuronkészítményt teszteltek különböző időpontokban. Az egyik neuronkészítmény nem volt stabil, és a tenyészet, beleértve a szérum + kontrollt , amely nem kapott semmilyen gyógyszert, meghalt a kísérlet közepén. Ezért három különböző neuronkészítményt használtunk három genetikailag különböző donortól.

a VX-765 toxicitást 3-(4,5-dimetiltiazol-2-Il)-2,5-difeniltetrazolium-bromiddal (MTT) értékelték. Az idegsejteket 25-200-mal kezeltükm VX−765 vagy 0,1% DMSO (a legmagasabb DMSO koncentráció) 72 órán keresztül. a neuronokat ezután 0,5-vel inkubáltuk 6G ml-1 MTT (Sigma-Aldrich) 4 órán át 37-nél (5% CO2). A formazan kristályokat 100 6L DMSO-ban oldottuk 30 percig. Az abszorbanciát 560 és 670 nm-en mértük a Synergy H4 lemezolvasóval.

az axonális degenerációt vagy APPWT transzfekció, vagy szérum deprivációs stressz okozta. A VX-765-et vagy előkezelési stratégiaként (1 órával a stresszor előtt), vagy utókezelő kezelési stratégiaként (48 órával a stresszor után) adták be. A neuronokat Gene gun (BioRad, Mississauga, ON, Kanada) transzfektálta pbudce41-eGFP-vel bevont arany gyöngyökkel a fluoreszcencia megjelenítéshez. Az APPWT stressz alatt álló neuronokat pbudce41-eGFP/APPWT-vel transzfektálták. Röviden, az idegsejteket 25 vagy 50 fővel kiegészített táptalajjal kezeltükvx-765, 5 MHz-es Casp1 inhibitor Z-YVAD-fmk, vagy DMSO. A fluoreszcens képeket 24 óránként (a kezelés utáni 72 óráig) készítették Nikon Eclipse Ti mikroszkóppal (Nikon, Mississauga, ON, CA) és Photometrics coolSNAP HQ2 CCD kamerával (Photometrics, Tucson, AZ, USA) a NIS Elements AR 3.10 szoftver (Nikon) segítségével. Az idegsejtek százalékos gyöngyözését úgy mértük, hogy megszámoltuk a gyöngyös eGFP-pozitív neuronok számát az eGFP-pozitív neuronok teljes számához képest minden időpontban. Minden feltételhez legalább 150 eGFP-pozitív neuront számoltunk. Kondicionált táptalajból vettünk mintát (1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 1 mM PMSF, 10 ~ ml ml−1 proteáz inhibitor koktéllal (Sigma-Aldrich) kiegészítve), és a neuronokat sejtlízis pufferben (50 mM HEPES, 0,1% CHAPS, 0,1 mM EDTA) gyűjtöttük elemzés céljából.

statisztikai elemzések

az állatok számát vagy a független kísérleteket, valamint az alkalmazott statisztikai elemzéseket (ANOVA és post-hoc összehasonlítások) mind az ábra legendái jelzik. Az összes érték az átlagos s.e.m. – ben van kifejezve, az F és p értékek pedig az ábra legendáiban vannak feltüntetve. Az összes statisztikai elemzést GraphPad Prism 7 szoftverrel végeztük (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA).