absztrakt
a Karbendazimot, mint gombaölőt, általában a mezőgazdaságban, az erdészetben és az állatgyógyászatban alkalmazott gombás betegségek kezelésére használták. Ebben a vizsgálatban a karbendazim akut és reprodukciós toxicitását Caenorhabditis elegans (C. elegans) modellként értékelték annak érdekében, hogy előzetesen értékeljék a gombaölő szer lehetséges kockázatait a mezőgazdasági termelésben és alkalmazásban. Az eredmények azt mutatták, hogy a C. elegans növekedését 0,01 6G/l karbendazim gátolta. A 0,1 Ft/L karbendazim kezelés a mozgási viselkedés jelentős csökkenését, valamint a reproduktív és antioxidáns rendszer jelentős károsodását okozta, ami drasztikusan lerövidítette a fonálférgek élettartamát. Ezek az eredmények jobban megértik a karbendazim környezeti kockázatát, és új biztonsági aggályokat vetnek fel.
1. Bevezetés
a növényvédő szereket, egyfajta kémiai vagy biológiai reagenseket széles körben használják a mezőgazdaságban a növények növekedésének szabályozására és a betegségek és rovarkártevők ellenőrzésére, amelyek elősegíthetik a növények növekedését és javíthatják a terméshozamot . A peszticidek széles körű használata azonban a növényekben vagy az élelmiszerekben különböző mértékű szermaradványokhoz vezet, és így befolyásolja az emberi egészséget . A peszticid-szermaradványok problémái nemcsak a fogyasztók nagy figyelmét keltették fel, hanem az élelmiszerbiztonságot befolyásoló egyik kulcsfontosságú tényezővé is váltak .
a karbendazim széles spektrumú gombaölő szerként a mezőgazdaságban, az erdészetben és az állatgyógyászatban használt gombás betegségek kezelésére szolgál . A karbendazimot azonban az Egészségügyi Világszervezet a veszélyes vegyi anyagok kategóriájába sorolta, és az Európai Bizottság az endokrin rendszert károsító vegyi anyagok prioritási listájába sorolta . Az utóbbi években nyilvánvaló, hogy a karbendazim széles körű alkalmazása a túlméretezett és túladagolt karbendazim esetében, valamint az a tény, hogy a karbendazim nehezen lebontható, mind a karbendazimmaradványok problémájához vezetett a mezőgazdaságban . Bár a karbendazim toxikus hatásáról az 1980-as évek óta számoltak be, a karbendazim toxicitása forró témává válik a környezeti endokrin károsítók iránti növekvő aggodalom miatt . A karbendazimot számos országban betiltották a környezetre és az egészségre gyakorolt negatív hatásai miatt, mint például a fejlődési és reprodukciós zavarok, a toxicitás és a mutagenitás . A karbendazimnak a máj, a vese és a belső elválasztású mirigyek biokémiai, kórszövettani és hematológiai paramétereire, valamint azok hormonszintjére gyakorolt káros hatásait patkányokban mutatták be . Ezenkívül további vizsgálatokat igényel az alacsony koncentráció miatt a karbendazim maradékai miatt.
Caenorhabditis elegans (C. elegans), mint fontos kutatási modell, széles körben használják, hogy némi értékelést. Amrit et al. , A C. elegans számos előnnyel rendelkezik, mint például a kis méret, a gyors generációs idő, a laboratóriumi tenyésztés egyszerűsége és a rövid felnőtt élettartam. Ebben a tanulmányban a C. elegans-t választották modellszervezetként a karbendazim alacsony koncentrációjának toxicitásának értékelésére, amely referenciaértéknek tekinthető a karbendazim mezőgazdaságban történő alkalmazásához.
2. Anyagok és módszerek
2.1. Vegyszerek és törzsek
karbendazim (tisztasága = 99%; Aladdin = biokémiai Technológiai Co., LTD, Shanghai, Kína) feloldjuk N, N-dimetil-formamid (DMF; Sinopharm kémiai reagens Co., LTD, Shanghai, Kína) 1 g/L karbendazim eredeti oldat előállításához. A DMF koncentrációja 0,1% volt a végső expozíciós oldatokban (0.01, 0.1, 1, 10, 100 6G / L). 0,1% DMF karbendazim nélkül volt a kontroll csoport. A C. elegans (vad típusú N2) eredetileg a Caenorhabditis genetikai központból (Minnesotai Egyetem, MN, USA) származik. A fonálférgeket fonálféreg növekedési táptalaj (NGM) lemezeken termesztettük, amelyeket Escherichia coli OP50-vel vetettünk be 20cc-n a leírtak szerint . Az L1-lárva C. elegans-t úgy gyűjtöttük össze, hogy a gravid fonálférgeket fehérítő keverékkel (1 M NaOH, 10% NaHOCl) mostuk.
2.2. Letalitás
a karbendazim eredeti oldatait (1 g / L) S folyékony közeggel hígítottuk (1,12 g K2HPO4, 5,92 G KH2PO4 és 5,85 g NaCl-t hígítottunk 1 liter vízzel), hogy megkapjuk a karbendazim végső koncentrációját 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1 mg / L, amely 0,1% DMF-et tartalmazott. S folyékony közeg 0,1% DMF volt a kontroll csoport. 30 fonálférget (L4) teszteltünk 96 lyukú lemezeken minden koncentrációra. A fonálférgek túlélését mikroszkóp alatt számoltuk, miután 24 órán át tenyésztettük az inkubátorban. A teszt folyamata Xiang et al. . Három párhuzamos kísérletre volt szükség.
2.3. Mozgás viselkedése
legalább 10 C. elegans (L4) véletlenszerűen választottuk ki az egyes koncentrációkból a mozdony viselkedésének meghatározásához, amelyet mind a fej-ütés gyakorisága, mind a test hajlítási ideje rögzített . A fej-thrash frekvencia számát A C. elegans középső testének hajlítási irányának változásával számoltuk 1 perc alatt. A testhajlás mérését az NGM-ben tenyésztett fonálférgek E. coli OP50 nélküli részének irányváltozásainak idejeként határoztuk meg a 30 s-ban.
2.4. Növekedési és fejlődési vizsgálatok
C. elegans 24 órán át karbendazimnak volt kitéve. A karbendazimnak kitett fonálférgek testhosszát az Image J szoftver értékelte. Az egyes C utódai. az elegans az L4 lárváktól az 1. napig az L3 szakaszban került rögzítésre, miután minden nap külön-külön áthelyezték egy új lemezre, amíg a szaporodás meg nem szűnik . Legalább három párhuzamos vizsgálatot végeztek.
2, 5. Élettartam elemzés
az összes élettartamra tesztelt C. elegans-t ugyanabban az állapotban tenyésztettük 20 C. a szinkronizált C. elegans-t NGM-lemezeken tenyésztettük, különböző koncentrációjú karbendazimokkal a 4.napig. A tesztelt fonálférgeket ezután 2 naponta új NGM lemezekre helyezik át. Túlélő és halott C. az elegánokat naponta rögzítették (a felnőttkor első napjától kezdve), amíg az egyes koncentrációkhoz tartozó összes fonálféreg el nem pusztult . Legalább három párhuzamos vizsgálatot végeztek.
2.6. Az oxidatív károsodás meghatározása
az intracelluláris ROS-T 2′,7′-diklór-dihidrofluoroszcin-diacetáttal (H2DCFH-DA) mértük, amely messze a leggyakoribb és legérzékenyebb reaktív oxigén detektáló szonda. A vad típusú N2 C. elegans-t M9 pufferben mostuk, majd ultrahanggal megszakítottuk. A felülúszót a Ros kit utasításait követve elemeztük a ROS szinten. A h2dche-DA végső üzemi koncentrációja 10 db volt . A gerjesztési és emissziós abszorbancia hullámhossza 485 nm, illetve 535 nm volt. Legalább három párhuzamos vizsgálatot végeztek.
az intracelluláris teljes szuperoxid-diszmutázt (T-SOD) a Nanjing Jiancheng Biomérnöki Intézettől vásárolt T-SOD készlet utasításai szerint határoztuk meg. Az M9-Tel háromszor történő mosás után a vizsgált fonálférgeket ultrahanggal megszakították, és egy T-SOD készlettel reagáltak. Az abszorbancia hullámhossza 550 nm volt. Ezenkívül a felülúszót használtuk a fehérje szintjének kimutatására minden koncentrációra, amelyben az abszorbancia hullámhossza 595 nm volt. Legalább három párhuzamos vizsgálatot végeztek.
2.7. Adatelemzés
az összes adatot az átlag átlagos (sem) standard hibájaként adták meg egyirányú ANOVA alkalmazásával. A grafikonokat az Origin 8.5 és a GraphPad Primer 7 segítségével mutattuk be, a statisztikai elemzést pedig az SPSS 19.0 szoftver segítségével végeztük. A statisztikai szignifikancia szintet Az and segítségével végeztük .
3. Eredmények
3.1. A C mozgás viselkedésének meghatározása. elegans after Carbendazim Acute Exposures
LC50C. elegans were exposed to carbendazim for 24 hours to assess its acute toxic effects. Data are represented as shown in Table 1, and the obtained linear fitting equation was y = 2.180x − 0.223 through data analysis. The obtained LC50 is 0.867 mg/L.
|
||||||||||||||||||||||||||||||
Next, we assayed the determination of the locomotive behavior of C. elegans karbendazim akut expozíció után a fonálférgek fejverési gyakoriságára és testhajlítási idejére vonatkozó adatok elemzésével (1.A) és 1. b) ábra). Mindkettő szignifikáns csökkenést mutatott a karbendazim-koncentrációknál, 0,01 6G/l-től 100 g/L-ig (). Ezenkívül a 100 főnek kitett fonálférgek fejdobása 68,27% – ra csökkent. A body bends teszt esetében, amikor a karbendazim-koncentráció 10 ~ g/L és 100 ~ g/L volt, szignifikáns gátló hatást gyakorolt a C. elegans testhajlításaira 36,77% – kal, illetve 35,48% – kal a kontrollhoz képest.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
3.2. A C növekedésének és fejlődésének meghatározása. elegans a karbendazim akut expozíciója után
a kontroll csoporthoz képest (1(c) és 1(d) ábra) a testhossz és a testfelület jelentősen () csökkent az expozíciós csoportokban 0,01 (6) g/L-ről 100 (1) g/l-re.mindkettő 19,16% – kal, illetve 22,15% – kal csökkent 0,01 (XNUMX) g/L-rel a kontroll csoporthoz képest. A 10 db/l koncentráció mutatta a legtöbb negatív hatást, a C. elegans testhossza és testfelülete 35,21% – kal, illetve 65,22% – kal csökkent a kontroll csoporthoz képest.
3.3. A C. elegans Fiasításméreteinek meghatározása a karbendazim akut expozíciója után
A 2.ábra szerint a fonálférgek fiasításméretei szignifikánsan csökkentek () a kezelési csoportokban 0,1 ~ g/L-ről 100 ~ g/l-re. a C. elegans fiasításméretei csökkentek a legjelentősebben, ami 43,71% – ra csökkent 10 ~ g/L kezelés mellett a kontroll csoporthoz képest.
3.4. A C. elegans élettartamának meghatározása a karbendazim akut expozíciója után
A C. elegans élettartamát szignifikánsan gátolta 0,01 ~ g/L-100 ~ g/L karbendazim a 3.ábrán látható élettartamgörbe szerint. Az eredmények azt mutatták, hogy a C. elegans élettartama 24-ről 20 napra csökkent 0,01 6G/l karbendazim kezelésével. A 0,01 Ft/L karbendazimmal kezelt fonálférgek élettartama 20,00% – kal csökkent. Amikor a karbendazim expozíciókoncentrációja 100 ~ g/L volt, a C. elegans élettartama csökkent a legnagyobb mértékben, 45,83% – kal.
3.5. Az akut karbendazim-expozíció hatásai A C. elegans antioxidáns rendszerére
a kontroll ros szintjei és a kezelt C. elegans karbendazim-expozíció különböző koncentrációkban a 4(a) ábrán látható. Azt jelezték, hogy az intracelluláris ROS szintje szignifikánsan emelkedett () 0,01 ~ g/L-től 100 ~ g/l karbendazimig. A kontrollhoz képest a ROS-szintet legfeljebb 70,60% – kal növelték 10 6G/l kezeléssel.az intracelluláris SOD-szintek eredményei szerint a kezelésnél 0-ról nőtt.01 6-100 g / l karbendazim (4. B) ábra). A SOD-szint 10,70% – kal nőtt 0,1 ~ g/l karbendazim mellett a kontroll csoporthoz képest.
(a)
(b)
(a) (b)
4. Vita
a Karbendazimot, mint gombaölő szereket, széles körben használják a mezőgazdaságban a gomba növekedésének gátlására. A karbendazim alkalmazását Ausztráliában, az Európai Unió nagy részében és az USA-ban tiltották súlyos toxikológiai és tartós jellege miatt . Ehhez a tanulmányhoz, ez volt az első alkalom a C használatára. elegans mint modellszervezetek a karbendazim mozdonyok viselkedésére, növekedésére és fejlődésére, szaporodására, élettartamára és antioxidáns rendszereire gyakorolt hatásainak értékelésére. Sőt, az eredmények azt mutatták, hogy negatív hatással volt a C. elegansra.
a 24 h-LC50 szerint a karbendazim különböző koncentrációinak kitett C. elegans akut toxicitási koncentrációja 0,867 mg/L. a karbendazim 96 h LC50-je a zebrafish-re adott válaszként 1,75 mg/L . A porosz ponty Carassius gibelio tojása 0,036 mg/L koncentrációban mutatta a toxicitási hatásokat . Tanulmányok kimutatták, hogy a növekedés és fejlődés a Navicula sp. a karbendazim gátolja a 24 h-EC50 érték 2,18 mg/L. bár az alga növekedésének sebessége 72 órás expozíció után helyreáll, a klorofill-A tartalom továbbra is jelentősen csökkent, ha a karbendazim kezelése meghaladta a 0,5 mg / L-t . Ebben a jelenben a karbendazim alacsony koncentrációjának kitett C. elegans-t választottuk ki annak hatásainak értékelésére az emberi napi expozíció tényleges koncentrációjától függően. A karbendazim alacsony koncentrációja nem jelenti azt, hogy biztonságos. A karbendazim negatív biológiai hatásokat mutat sokkal alacsonyabb dózisokban egyes vizsgálatokban.
a mozdony viselkedését a C. elegans (L4 lárva) neurotoxicitásának értékelésére értékelték 24 órás karbendazim-expozíció után. Az eredmények azt mutatták, hogy a karbendazim negatív hatással lehet a mozdony viselkedésére a C. elegans fejverésének és testhajlításának észlelése révén, amelyek mindkettő érzékenyebb volt a magasabb expozíciós csoportban. A karbendazimnak kitett zebrafish embriók mozdony viselkedése érzékeny . Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a halak rendellenes viselkedést mutatnak, ha a karbendazim szubletális koncentrációja 0,22–0,43 mg/L .
a fejlődési rendellenességek szintén a rendellenes mozgás egyik oka lehetnek . A C. elegans növekedését és fejlődését tanulmányoztuk tanulmányunkban. Az eredmények azt mutatták, hogy a C. elegans testhossza és testfelülete szignifikánsan szűkült a kezelés során, meghaladva a 0,01 GB/l karbendazimot. A gerincesek normális növekedése a metabolikus pajzsmirigyhormon homeosztázishoz kapcsolódik . Williams et al. jelezték, hogy a karbendazim spermiumvesztést okozhat a beültetés után, magzati malformáció, lassú növekedés és fejlődés.
a karbendazim reprodukciós toxicitását kimutatták, hogy a karbendazim gátolhatja a gomba-és emlőssejtek mikrotubulus polimerizációját, ami a mikrotubulus összeállításának megszakadását okozza azáltal, hogy a sejtosztódás folyamatában a kromoszómák szegregációját rontja . A mikrotubulusok nem kovalens kötésekkel történő kialakulása a mitózis és a meiózis folyamatában felelős a kromoszóma szegregációért . A C. elegans fiókamérete szignifikánsan csökken 0,1 ~ g / l karbendazim koncentrációnál. Megállapították, hogy a karbendazim befolyásolja a japán fürjek és hörcsögök szaporodási rendszerét . Arra a következtetésre jutottak, hogy a C. elegans élettartama szignifikánsan csökkent a karbendazim koncentrációja 0,01 0g/L vizsgálatunk alapján. Tanulmányok kimutatták, hogy a karbendazim meddőséghez és fejlődési toxicitáshoz vezetett, és embriótoxicitást, csírasejt-apoptózist és teratogenezist mutat különböző emlősfajokban .
az apoptózis egy komplex programozott sejthalál, amely egy erősen szabályozott jelenség, amelyet sejtes folyamatok sorozata jellemez . Számos tanulmány kimutatta, hogy az oxidatív stressz által kiváltott ROS termelése összefügg az apoptotikus sejthalállal . Tanulmányunk megállapította, hogy a karbendazim a ROS értékek szintjének jelentős növekedését és a SOD értékek szintjének kis növekedését idézheti elő. A környezetszennyezés által okozott oxidatív stressz indukálja a ROS fokozott expresszióját, majd károsítja az antioxidáns védelmi rendszert . A SOD felelős a mérgező szabad gyökök méregtelenítéséért és azok tevékenységéért, amelyet az oxidatív stressz szintjének és a sejtek antioxidáns állapotának értékelésére használnak . A metalloenzim SOD felgyorsítja az endogén citotoxikus szuperoxid gyökök H2O2-vé történő átalakulását, és a SOD expressziós szintjének növekedése hozzájárulhat az enzimaktivitás javításához a karbendazim által indukált szuperoxid gyökök eltávolítása és a karbendazim expozíciója során fellépő sejtes diszfunkció előfordulásának megelőzése érdekében . A karbendazim magasabb expozíciós koncentrációja súlyos oxidatív stresszt okozhat, amely ezt követően tönkreteszi a sejtek homeosztázisának egyensúlyát és elősegíti az apoptózist . Az alacsony koncentrációjú karbendazim azonban eredményeink szerint továbbra is jelentősen károsíthatja a reproduktív rendszert.
5. Következtetés
amennyire tudjuk, ez a tanulmány először értékelte a C. elegans-nak kitett karbendazim biztonságosságát. Kimutatta, hogy a karbendazim káros hatással lehet A C. elegans mozdony viselkedésére, fejlődésére és növekedésére, szaporodására, élettartamára és antioxidáns rendszerére. Remélem, hogy az eredmények alapján nagyobb figyelmet kell fordítania a carbendazim alkalmazására. Ezenkívül a karbendazim alkalmazásának biztonságosságát tovább kell értékelni, különös tekintettel a Bioakkumulációs toxicitásra és a lehetséges genotoxikus hatásokra.
adatok elérhetősége
A tanulmány során generált vagy elemzett összes adat szerepel ebben a cikkben.
összeférhetetlenség
a szerzők kijelentik, hogy nincs összeférhetetlenségük.
elismerések
ezt a kutatást a kínai Nemzeti Természettudományi Alapítvány támogatta (31501569).
