amikor a fehérjék oldására és denaturálására kerül sor az izoelektromos fókuszálás és a 2-D gélelektroforézis előtt, a legtöbb kutató a karbamidot választja. Ez nem meglepő, mivel ez az enyhe kaotróp szer teljesen megzavarhatja a fehérjemolekulák közötti kölcsönhatásokat és növelheti a proteázaktivitás hatékonyságát a fehérjék emésztésében, miközben hatékonyan megakadályozza a fehérjék aggregálódását és/vagy kicsapódását. Ezenkívül a karbamidot a korábban denaturált mintákból származó fehérjék renaturálására is használják.

annak ellenére, hogy hatékony fehérje denaturálószerként népszerű, a karbamidoldat használata a fehérjék emésztésében különös kihívást jelent-növeli a karbamilezés kockázatát. Miért érdekelne ez téged? Íme néhány ok, amiért a karbamilezés káros lehet a kísérletre, és miért kell elkerülni minden áron.

1. a fehérjemolekulák N-terminális végeinek blokkolásán kívül a karbamilezés zavarja a fehérjék jellemzését, és nem teszi lehetővé a további felhasználást.
2. agresszíven támadja meg az arginin és lizinmaradványok oldalláncait, és alkalmatlanná teszi a fehérjét enzimes emésztésre.
3. gátolja a fehérjék enzimatikus emésztését, és hátrányosan befolyásolja a fehérjék azonosítását és mennyiségi meghatározását az SM analízisben.
4. összekeveri a peptidekből kapott eredményeket váratlan retenciós idővel, és növeli a minta összetettségét.
5. csökkenti az ionizációs hatékonyságot és negatívan befolyásolja a detektált csúcsok jelintenzitását.
6. megváltoztatja a fehérjék izoelektromos pontját, és mesterséges eredményekhez vezet.
7. befolyásolhatja az in vivo karbamilezési vizsgálatok eredményeit.

mi okozza a Karbamilezést?

definíció szerint a karbamilezés a poszttranszlációs módosításra utal, amely megváltoztatja a fehérjék szerkezeti és funkcionális tulajdonságait. Ezt az izociánsav és a szabad aminocsoportok közötti nem enzimatikus reakció okozza.

vizes oldatokban a karbamid egyensúlyban van az ammónium-cianáttal. Fontos megjegyezni, hogy (1) az oldatban lévő karbamid spontán módon disszociál, cianát-és ammóniumionokat termel, (2) izociánsavvá (CNOH) bomlik, amely a fehérje aminocsoportokkal aktívan reagál és karbamilezést indukál, és (3) a karbamid disszociációjának sebessége és a karbamilezés mértéke függ a hőmérséklettől, a pH-tól és az inkubációs időtől.

A Karbamilezés megelőzése: néhány hasznos tipp, amelyet figyelembe kell venni

semmi sem változtathatja meg azt a tényt, hogy a karbamid hő és fehérjék jelenlétében mindig karbamilezéshez vezet. Használhatja a rendelkezésre álló legmagasabb minőségű karbamidot, és továbbra is fennáll a karbamilezés veszélye.

szerencsére számos módon lehet megvédeni a peptideket a karbamilezéstől. Íme néhány hatékony stratégia, amely felhasználható e cél elérésére.

• mindig frissen készített karbamid alapú reagenseket használjon proteomikus eljárások során. Használjon megbízható forrásból származó, kiváló minőségű száraz karbamid alapú, előre kevert és használatra kész puffereket, és a minták előkészítése során különös óvatossággal járjon el. Megjegyzés: a szilárd anyagot szobahőmérsékleten kell tárolni, és a kezelést a lehető legkisebbre kell csökkenteni.
• az emésztés előtt dialízissel és / vagy gyors fordított fázisú kromatográfiával vagy spin oszlopokkal távolítsuk el a karbamidot a fehérjemintából.
• tartsa a mintát viszonylag alacsony hőmérsékleten a karbamid bomlási sebességének csökkentése érdekében. A karbamilezés kockázatának csökkentése érdekében kerülje a karbamidtartalmú pufferek 37oc feletti melegítését.
• ioncserélő gyantával Ionmentesítjük a karbamidoldatot a cianátkoncentráció csökkentése érdekében.
• savanyítsa meg a karbamid oldatot (100 mM HCl), hogy megakadályozza az izociánsav képződését.
• használjon reagenseket, például etanol-amint, etilén-diamint, metilamint és trisz-HCl-t a fehérje/peptid karbamilezés minimalizálása érdekében. Ezek a reagensek segítenek a cianátmolekulák eltávolításában, ezáltal elérhetetlenné téve őket a peptidek számára.

kétségtelen, hogy ezeknek a stratégiáknak megvannak a maguk hátrányai (pl., hosszabb kezelési időt igényel, könnyen denaturált fehérjék kicsapódását idézi elő, és számos enzimatikus emésztési technikára alkalmatlan lehet), de mivel az enzimemésztéseket magas hőmérsékleten, hosszú ideig végzik, nincs más választása, mint eltávolítani a karbamidot az emésztett keverékből. Ellenkező esetben mindig fennáll a karbamilezés veszélye. Ez egy olyan kockázat, amit nem akarsz vállalni.