A feloldáshoz szükséges fehérjekomponensek előkészítése

Az E. coli transzlációs készülék komponenseit, beleértve a transzlációs faktorokat és az AAR-okat, a korábban leírtak szerint készítettük el46. Az rnasep komponensek, az M1 RNS és a C5 fehérje előállítását szintén az előzőekben leírtak szerint készítettük29. A C5 fehérje protokollját úgy módosítottuk, hogy 80% telített ammónium-szulfáttal kicsaptuk, majd az a pufferrel (50 mM nátrium-acetát pH 6,5, 5 mM EDTA, 0,25 M NaCl és 7 mM 2-merkaptoetanol) dializálva oldottuk fel. A kapott csapadékot centrifugálással visszanyerjük, majd dializálással feloldjuk az 50 mM HEPES-KOH pH 7,6, 100 mM NH4Cl, 6 M karbamid és 10 mM ditiotreit (DTT) tartalmú b pufferrel szemben. Az oldott fehérjéket egy 5 mL-es HiTrap SP HP oszlopra (#17115101, GE Healthcare, USA) felvittük, 7 mM-es 2-merkaptoetanolt tartalmazó B pufferrel mossuk 10 mM-es DTT helyettesítésére, és 100 mM-től 2 M NH4Cl-ig terjedő lineáris gradienssel Eluáltuk a B pufferben.a C5 fehérjét tartalmazó frakciókat SDS-PAGE-vel elemeztük, visszanyertük, dializáltuk a D puffer ellen (50 mM HEPES-KOH pH 7,6, 0,8 m NH4Cl, 10 mM MgCl2, 2 m karbamid, 7 mm 2-merkapto-etanol), majd karbamid nélkül tovább dializálják a D pufferrel szemben. A kapott oldatokat Amicon Ultra 3 kDa (#UFC800324, Merck Millipore, USA) alkalmazásával koncentráltuk, és D pufferrel dializáltuk, 50% glicerint tartalmazó karbamid nélkül. A tisztított C5 fehérjét -30-on tároltuk C. megjegyezzük, hogy kérésre meg tudjuk osztani az összes plazmidot.

módosító enzimek előkészítése ivttrns-ekhez

módosító enzimek ivttrns-ekhez az alábbiak szerint állítottuk elő. A TsaB, TsaC, TsaD, TsaE, TrmD, GlyA, MnmC, MnmE és GidA E. coli génjeit megfelelő primerek alkalmazásával amplifikáltuk az E. coli A19 genomjából (5.Kiegészítő adatok). A TsaC, TsaD, TsaE, Glya, MnmC, MnmE és GidA amplifikált génjeit pet15b-be (#69661, Merck Millipore, USA) klónozták kis ubiquitin-szerű módosító (SUMO) fehérje-fúziós fehérjékként, ahol a HIS-tag, a SUMO fehérje és a módosító enzimek tandemly elrendeződtek. A TsaB és a TrmD génjeit pet15b-be klónozták his-tag fúziós fehérjeként. Az összes gént Gibson összeszerelési technikával klónozták (#E2611, New England Biolabs, USA). A kapott plazmidokat E. coli BL21(DE3) törzsgé alakítottuk át, és 1 L LB táptalajon OD660–ra növeltük 0,6-1,0-ra 37cc-nél. A túlzott expressziót az IPTG hozzáadása okozta a TsaB, TsaC, TsaD, TsaE és TrmD végső koncentrációjához, vagy 0,1 mM A GlyA, MnmC, MnmE és GidA esetében. 3 óra termesztés után 37cc-nél a sejteket betakarítottuk. TsaB, TsaC, TsaE, TrmD, és MnmE-overexpresszált sejteket reszuszpendáltuk 40 mL lízis puffer (50 mM Hepes-KOH, pH 7,6, 1 M NH4Cl, 10 mM MgCl2, és 7 mM 2-merkaptoetanol), és megzavarta szonikáció. A kapott lizátumot centrifugáltuk, majd a felülúszót kinyertük, és 5 mL teljes his-tag tisztító gyantával (#05893801001, Roche, Svájc) 1 órán át forgatóval elegyítettük. A gyantát 100 mL Lízispufferrel mossuk, majd a fehérjét 25 mL elúciós pufferrel (50 mM Hepes-KOH, pH 7,6, 400 mM KCl, 10 mM MgCl2, 400 mM imidazol és 7 mM 2-merkaptoetanol) eluáljuk. A TsaB-t és a TrmD-t az Amicon Ultra 3 kDa (#UFC800324, Merck Millipore, USA) koncentrálta, majd a Készletpuffer ellen dializálta (50 mM Hepes-KOH, pH 7.6500 mM KCl, 10 mM MgCl2, 7 mM 2-merkapto-etanol és 30% glicerin). Folyékony nitrogénnel gyorsan lefagyasztottuk és -80 ft-on tároltuk. a TSAC, TsaE és MnmE esetében Ulp1-et (#12588018, Thermo Fischer Scientific, USA) adtunk a kinyert frakciókhoz 23 Ft/ml végső koncentrációban, hogy eltávolítsuk a HIS-tagged SUMO fehérjét. A frakciókat Dializáltuk a hasítási pufferrel szemben (50 mM Hepes-KOH, pH 7,6, 100 mM KCl és 7 mM 2-merkaptoetanol) egy éjszakán át, míg a hasítási puffer 500 mM KCl-t tartalmazott az MnmE előkészítéséhez. A dializált mintákat ismét összekeverjük 5 mL teljes his-tag tisztító gyantával forgatóval. Ezután összegyűjtöttük a módosító enzimeket tartalmazó átfolyó frakciókat. A visszanyert mintákat az Amicon Ultra 3 kDa koncentrálta a TsaE vagy az Amicon Ultra 10 kDa (#UFC901024, Merck Millipore, USA) A TsaC és az MnmE számára. A Készletpufferrel szemben dializálták őket, folyékony nitrogénnel gyorsfagyasztották, és -80 C-on tárolták. a GlyA előkészítéséhez az összes puffer 10% glicerint tartalmazott, és a többi eljárás megegyezett az MnmE előkészítésével. A TsaD-t szonikálás után oldhatatlannak találták. Ezért a fehérjét 20 400 Ft-os centrifugálással pelletáltuk 4 ft-os 45 percen keresztül, majd 4% – os Triton X-100-mal kiegészített Lízispufferben reszuszpendáltuk. A szuszpenziót ismét 20 400 Ft-os centrifugálással pelletáltuk 45 percig. A pelletet 6 M karbamiddal kiegészített Lízispufferrel oldottuk fel. A másik eljárás ugyanaz volt, mint az MnmE készítmény, azzal a különbséggel, hogy az összes puffer 2 M karbamidot tartalmazott. Az MnmC előkészítéséhez a His-tagged SUMO fehérje eltávolításáig minden lépés megegyezett a GlyA készítménnyel. Mivel az MnmC nem specifikusan kötődik a His-tag tisztító gyantához, az anioncserélő kromatográfiával történő tisztítást választottuk. Az Ulp1 kezelés után az oldatot IEX pufferrel (50 mM Hepes-KOH, pH 7,6, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2 és 7 mM 2-merkaptoetanol) dializáltuk, majd egy 5 mL-es HiTrap Q HP oszlopra helyeztük (#17115401, GE Healthcare, USA). Az oszlopot 25 mL IEX pufferrel mostuk, majd az MnmC-t 100 mM-től 1 M KCl-ig terjedő bélésgradienssel eluáltuk IEX pufferben. Az MnmC-t tartalmazó frakciókat az Amicon Ultra 30 kDa (#UFC903024, Merck Millipore, USA) koncentrálta, készletpuffer ellen dializálta, folyékony nitrogénnel gyorsfagyasztotta és -80 C-on tárolta.

ivttrns előkészítése

minden ivttrns génjét (kiegészítő adatok 1) klónoztuk a pGEMEX-1 vektorba (#P2211, Promega, USA) az XbaI és a BamHI restrikciós helyek között. A kapott plazmidokat mint sablonokat használva az in vitro transzkripció DNS-sablonjait PCR-amplifikáltuk egy T7 promoter primer forward primer és megfelelő reverz primerek alkalmazásával minden ivttrns – hez (1.Kiegészítő adatok). Mindegyik reverz primer tartalmazott egy 2′-Metoxi módosítást az 5 ‘ – terminális második nukleotidján, hogy megakadályozza a templátfüggetlen extra nukleotid hozzáadását28. A termékeket fenol/kloroform/izoamil-alkohol (25:24:1) extrakcióval tisztítottuk, majd etanolos kicsapással, majd a kicsapódókat vízben oldottuk. Run-off transcription of precursor iVTtRNAs with 27 extra nucleotides introduced at the 5′-terminus (5′-GGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGA-3′) was performed using the resultant DNA templates for 3 h at 37°C in 20 mL reaction mixtures containing 30 nM T7 RNA polymerase, 1 mM each ATP, GTP, CTP, and UTP, 40 mM HEPES-KOH pH 7.6, 20 mM MgCl2, 1.5 mM spermidine, 5 mM DTT, 20 μg PCR products, and 0.2 U/mL inorganic pyrophosphatase (#10108987001, Roche, Switzerland). A C5 proteinből és M1 RNS-ből álló RNáz p komponenseket ezután 150 nM-es reakcióelegyekhez adtuk a 27 extra nukleotid eltávolítása céljából, majd a reakciókat 1 órán át inkubáltuk 37 Kb-n.az átírt ivttrns-eket ezután savas fenol extrakcióval, majd kloroform/izoamil-alkohol (10:1) extrakcióval dolgoztuk fel, majd anioncserélő kromatográfiával tisztítottuk. Az ivttrns-eket tartalmazó mintákat 10 mL HiTrap Q HP oszlopokra (#17115401, GE Healthcare, USA) töltöttük, és Q pufferrel (20 mM HEPES-KOH pH 7,6 és 200 mM KCl) mostuk. az ivttrns-eket 200 mM-től 1 M KCl-ig terjedő lineáris gradienssel eluáltuk Q pufferben. A cél ivttrns-eket tartalmazó, karbamidoldallal meghatározott frakciókat izopropanol-kicsapással nyertük vissza,majd a kicsapódott ivttrns-eket vízben oldottuk, és felhasználásig -80 ft-on tároltuk. Megjegyezzük, hogy meg tudjuk osztani az összes plazmidok kérések.

az ivttrns módosítása

t6A37 módosítást végeztünk az 50 mM Hepes-KOH, pH 7-et tartalmazó reakcióelegyben.6, 300 mM KCl, 20 mM MgCl2, 5 mM DTT, 50 mM NaHCO3, 1 μM CaCl2, 1 mM ATP, 1 mM Thr, 5 μM TsaC, 5 μM TsaB, 5 μM TsaD, 5 μM TsaE, 4 A260 unit/mL tRNAIleGAU or tRNAAsnGUU or tRNAPheGAA. m1G37 modification was performed in the reaction mixture containing 50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 200 mM KCl, 10 mM MgCl2, 36.4 μM S-adenosyl methionine (SAM), 1.5 μM TrmD, 10 A260 unit/mL tRNAProGGG or tRNAPheGAA. mnm5U34 was performed in the reaction mixture containing 50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 150 mM KCl, 12.5 mM MgCl2, 5 mM DTT, 500 μM FAD, 1 mM tetrahydrofolate, 4 mM GTP, 2.5 mM NADH, 0.2 mM pyridoxal-5′-foszfát, 1 mM Ser, 1 mM Glicin, 36.4 µM SAM, 0.1 egység/µL rekombináns RNase gátló (#2313 Egy, TaKaRa, Japán), 10 µM GlyA, 3 µM GidA, 3 µM-MnmE, 2.5 µM MnmC, 6 A260 egység/mL tRNAGluUUC vagy tRNAGluCUC. A t6a37 és m1G37 módosítás esetén 37cc-n 2 órán át, az mnm5U34 módosítás esetén 4 órán át tartó inkubálást követően a tRNS-eket savas fenol extrakcióval, majd kloroform/izoamil-alkohol (10:1) extrakcióval dolgozták fel, majd izopropanol kicsapással nyerték vissza. A kicsapódott tRNS-eket vízben oldottuk és -80 C-on tároltuk. Az mnm5U34 módosításához a reakciót ismét visszanyert tRNS-ekkel hajtottuk végre. Savas fenol extrakcióval dolgozták fel őket, majd kloroform / izoamil-alkohol (10: 1) extrakcióval, Sótalanítva MicroSpin G-25 oszlopokkal (#27532501, GE Healthcare, USA), majd izopropanol kicsapással nyerték vissza. A kicsapódott tRNS-eket vízben oldottuk, és -80 ft-on tároltuk. a módosítás hatékonyságának számszerűsítéséhez 57,1 Ft thr-t használtunk 1 mM Thr helyett, és a TsaD nélküli keveréket használtuk a t6A37 módosítás kontrolljaként. 36.4 6 ml S — adenozil-metionint használtunk, és a trmd nélküli keveréket az M1G módosításának kontrolljaként, a gida nélküli keveréket pedig az mnm5U34 módosításának kontrolljaként használtuk. A 37 (60) C) számú inkubációt követően az alikvotákat (10 (10) C) visszavonták, és a Whatman 25 mm-es GF/C szűrőlemezeken észlelték (#1822-025, GE Healthcare, USA). A szűrőlemezeket kétszer mossuk 10% TCA-val, majd etanollal, majd a radioaktivitás mérését folyékony szcintillációs számlálóval. Az mnm5U módosítás számszerűsítéséhez a tRNS-eket a fentiek szerint tisztítottuk, majd helyette 0,02 A260 egységet észleltünk a szűrőlemezeken.

Aminoacilációs

Aminoacilezési kísérleteket végeztek egy korábbi jelentés szerint47. A reakcióelegyek (10 6L) tartalmaztak 100 mM HEPES-KOH pH 7,6-ot, 15 mM MgCl2-T, 40 mM KCl-t, 1 mM DTT-t, 4 mM ATP-t, 1 egység/6L rekombináns RNáz inhibitort (#2313 A, TaKaRa, Japán), 50 nM-t vagy 1,5 km-t az egyes aminosavaknak megfelelően, aszparagin-aminoacilezéshez 20 ml aminosavat vagy 68 ml Asn-t és 2 A260 egység/mL tRNS-t. A metilezés méréséhez 0,6 MHz MET és 3,4 km hideg L-metionin keverékét használtuk. A Cys-t úgy kaptuk, hogy 50 mM-es DTT-vel redukáltuk a cisztint 37cc-n 15 percig. A ciszteinilezés méréséhez a DTT-koncentráció 5 mM volt. natív tRNS-keverékek alkalmazásakor 40 A260 egység/mL tRNS-keveréket (#10109541001, Sigma-Aldrich, USA) adtunk hozzá. A 37-30 perces inkubálás után az alikvotokat (8 ~ ~ l) kivonták és a Whatman 25 mm-es GF/C szűrőlemezeken észlelték (#1822-025, GE Healthcare, USA). A szűrőlemezeket kétszer mossuk 10% TCA-val, majd etanollal, majd a radioaktivitás mérését folyékony szcintillációs számlálóval.

Oktapeptidszintézis a PURE rendszerrel

oktapeptideket kódoló DNS-sablonokat PCR-amplifikáltunk megfelelő primerekkel (kiegészítő adatok 2) a pURE1 vektor (#PUREV001, BioComber, Japán) felhasználásával, amely egy T7 promoter szekvenciát és a riboszóma kötőhelyet (Shine-Dalgarno szekvencia) tartalmazta sablonként. Az amplifikált DNS-sablonokat qiaquick PCR tisztítókészlettel tisztítottuk (#28104, QIAGEN, Németország). Az oktapeptid szintézis reakciók 50 mM HEPES-KOH pH-t tartalmaztak 7.6, 100 mM kálium-glutamát, 13 mM magnézium-acetát, 2 mM spermidin, 1 mM DTT, 2 mM ATP, 2 mM GTP, 1 mM UTP, 1 mM CTP, 20 mM kreatin-foszfát, 10 6G/mL 10-formil-5,6,7,8-tetrahidrofolsav, 0,2 6 mm riboszóma, 4 nM DNS-sablon, fehérjetartalmú tiszta rendszerkomponensek, beleértve a transzlációs faktorokat és enzimeket, aminosavakat és tRNS-eket. A fehérjetartalmú tiszta rendszerkomponensek koncentrációja megegyezett egy korábbi protokollban46 leírtakkal. Megjegyezzük, hogy mind a 20 aaRSs részt vett ebben a kísérletben, függetlenül a DNS-sablonoktól és a teszt kodonoktól. A vizsgált kodonoktól függő aminosavak összetételét és koncentrációját a 2.Kiegészítő adatok sorolják fel. Az ivttrns-ek összetétele a sablontól függ, és a reakciókat bazális ivttrns-ekkel végeztük (2.Kiegészítő adatok) teszt ivttrns-ek jelenlétében vagy hiányában (2. Kiegészítő adatok). Az egyes ivttrns-ek koncentrációját 6 MHz-ben határoztuk meg. Natív tRNS-keverékek alkalmazásakor 56 A260 egység/mL tRNS-keveréket (#10109541001, Sigma-Aldrich, USA) adtunk hozzá. A reakciókat 60 percig végeztük 37 Ca-n, és az alikvotokat visszavonták, Whatman 3 MM-es szűrőpapírokra (#1822-025, GE Healthcare, USA) észlelték, 10% TCA-ban forralták 90 Ca-n 30 percig az aminoacil-RNS-ek dezacilálására. A 10%-os TCA-oldhatatlan frakció radioaktivitását folyékony szcintillációs számlálóval mértük.

fehérjeszintézis a PURE rendszerrel

a fehérjeszintézis kísérleteket PUREfrex 2.0 készlettel (#PF201, GeneFrontier Corporation, Japán) végeztük tRNS keverékek nélkül az I. oldatban (puffer keverék). Mi is hozzá 0.2 6 nm-es met, 4 nM-es PCR-amplifikált DNS-sablon DHFR vagy sfGFP expresszióhoz (3. Kiegészítő adat), valamint meghatározott mennyiségű ivttrns-keverék vagy natív tRNS-keverék. A reakciókat 30 vagy 37cc-n végeztük 12 órán át, és a szintetizált fehérjéket elemeztük.

szintetizált fehérjék elemzése

szintetizált DHFR és sfgfp radioaktív Met-et tartalmazó 15%-os SDS-PAGE-vel elemeztük, és a gél képét bas-5000 bio-képalkotó analizátorral (GE Healthcare, USA) vizualizáltuk. Az sfgfp expresszió idő-tanfolyam elemzését az sfGFP fluoreszcencia mérésével végeztük 3 percenként StepOne qRT-PCR rendszer alkalmazásával (#4376373, Applied Biosystems, USA). A reakciókeverékekben szintetizált sfGFP fluoreszcens képeit LAS-4000 műszerrel (GE Healthcare, USA) kaptuk. A szintetizált DHFR aktivitását a korábban leírtak szerint mértük. 44. A reakcióelegyekben (2 mL) 50 mM MES-KOH pH 7,0, 25 mM trisz-HCl pH 7,0, 25 mM etanol-amin, 100 mM NaCl, 10 mM 2-merkaptoetanol, 0 volt.1 mM EDTA-t, 100 ml dihidrofolsavat és 10 ml alikvot tiszta reakcióelegyet, és 37 ml C hőmérsékleten inkubáltuk 15 percig. Ezután 20 mM-es NADPH-t adtunk a 200 MHz-es végső koncentrációhoz, majd az abszorbancia csökkenését 340 nm-nél 10 perc alatt mértük egy V-550 spektrofotométerrel (Jasco, Japán). A DHFR egy egységét úgy határoztuk meg, mint az enzim mennyiségét, amely szükséges 1 db dihidrofolsav 1 perc alatt történő feldolgozásához 37 dB C.

szintetizált fehérjék LC-MS analízise

DHFR FLAG szekvenciával a terminálisán (3.Kiegészítő adatok) PUREfrex 2-vel szintetizáltuk.0 készlet (#PF201, GeneFrontier Corporation, Japán) tRNS keverékek nélkül az I. oldatban (Pufferkeverék). Ezenkívül 4 nM-es PCR-amplifikált DNS-sablont adtunk hozzá a DHFR-hez, amelyet a C-terminálisán FLAG szekvenciával jelöltek meg (Kiegészítő adatok 3), valamint egy meghatározott mennyiségű ivttrns-keveréket vagy natív tRNS-keveréket. A reakciókat 30cc-n végeztük 12 órán át. a szintetizált DHFR-t Anti-FLAG m2 mágneses gyöngyökkel tisztítottuk (#M8823, Sigma-Aldrich, USA). A reakcióelegyek alikvotjait (55 ~ ~ l) 245 ~ ~ ~ l ZÁSZLÓMOSÓ pufferrel (50 mM Hepes-KOH, pH 7) kevertük el.6, 150 mM NaCl, 20 mM Mg(OAc)2), majd tovább keverve 30 6L gyöngyökkel 1 órán át. a gyöngyöket 210 6L zászlómosó pufferrel mostuk, majd kétszer(210 és 180)2 mg (OAc) nélküli pufferrel mostuk. Ezután a DHFR – t Eluáltuk 50 a flag mosópuffer mg(OAc)2 nélkül, de 100-mal kiegészítettük 6xflag peptid (#F4799, Sigma-aldrich, USA) 1 órán át történő kíméletes keverés után. az LC-MS elemzéshez a minták előkészítését fázistranszfer felületaktív anyaggal (PTS) támogatott protokoll szerint végeztük48. A sűrű PTS-puffert (100 mM-es nátrium-dezoxikolát, 100 mM-es nátrium-n-lauroil-szarkozinát és 500 mM-es NH4HCO3) 40 eluált mintához adtuk hozzá. Ezeket 10 mM-es TCEP-vel redukáltuk 37 Kb-on 30 percig, 20 mM-es jódacetamiddal alkileztük 37 Kb-on 30 percig, majd 20 mM-es Cys-vel leállítottuk. Mindegyik reakcióoldatot két részre osztottuk. Egy volt megemészteni 10 ng/µl-Lys-C (#90051, Thermo Fisher Tudományos, USA), valamint a 10 ng/µl tripszin (#90057, Thermo Fisher Tudományos, USA), 37 °C-egyik napról a másikra. A másikat megemésztette 10 ng/6L ASP-N (#90053, Thermo Fisher Scientific, USA) 37 oc-on egy éjszakán át. Az emésztést követően 10% – os trifluorecetsavat (TFA) adtunk 1% – os végső koncentrációhoz, majd a reakcióoldatokat 15 000 Ft-on 5 percig centrifugáltuk, hogy kicsapjuk a mosószereket. A felülúszókat saját készítésű szakaszcsúcsokkal sótalanították49 majd SpeedVac-kal szárítottuk. Az LC-MS analízist Orbitrap tömegspektrométerrel (LTQ Orbitrap Velos Pro, Thermo Fisher Scientific, USA), nanospray ionforrással (Nanospray Flex, Thermo Fisher Scientific, USA) és nano-LC rendszerrel (UltiMate 3000, Thermo Fisher Scientific, USA) szerelték fel. A szárított peptidkeverékeket 5% acetonitril és 0,1% TFA tartalmú oldatban oldottuk fel, és minden mintát nano-LC rendszerre vittünk. A peptideket csapdaoszlop segítségével koncentráltuk (#164535, 0.075 (20 mm), 3 (3), acclaim PepMap 100 C18, Thermo Fisher Scientific, USA), majd Nano kapilláris oszlop segítségével (#NTCC-360/100-3-153, 0.1 × 150 mm, 3 ons, C18, Nikkyo Technos, Japán) két mozgófázist használva a (0,1% hangyasav) és B (acetonitril és 0,1% hangyasav) gradienssel (5% B 5 percig, 5-45% B 45 perc alatt, 45-90% B 1 perc alatt és 90% B 4 perc alatt) 500 nL/perc áramlási sebességgel. Az elúciót közvetlenül elektrosprayed (2,2 kV) az MS-Be (pozitív mód, szkennelési tartomány 200-1500 m/z, 60 000 FWHM felbontás)50.