a CRBN-t hatékonyan lebontja a VHL-CRBN heterodimerizáló PROTACs. A) A POMALIDOMIDOT tartalmazó PROTAC és a VHL ligandum (VH032) sematikus ábrája. B) A TD-158, TD-165, TD-343 és TD-487 szerkezete. (C) A HEK293T sejteket TD-158, TD-165, TD-343 vagy TD-487 (0,1, 1 és 10) 24 órán keresztül kezeltük, és a VHL fehérje szintjét immunoblottal elemeztük. Az L. E. A Western blot hosszú expozícióját jelzi. D) A TD-158 és TD-165 vegyületek DC50 grafikonja (TD – 165, DC50 = 20,4 nM; TD-158, DC50 = 44,5 nM). E) a HA-CRBN-t és a Flag-VHL-t hek293t cellákban fejezték ki. 24 óra elteltével a sejteket TD-158-mal (500 nM) kezeltük 24 órán keresztül. A teljes sejt lizátumokat immunoblottálással elemeztük a jelzett fehérjék számára. (F) A HEK293T sejteket különböző időpontokban 500 nM-es TD-158-mal kezeltük, és a CRBN-szinteket immunoblottálással elemeztük. Az L. E. A Western blot hosszú expozícióját jelzi.

ezekkel a vegyületekkel végzett kezelés után Western blot analízissel megvizsgáltuk a VHL és a CRBN szintjét. A TD-158, TD-165 vagy TD-343 kezelés a CRBN fehérjék szintjének koncentrációfüggő csökkenését okozta (ábra. 1C, felső panel). Mind a VHL hosszú forma, mind a VHL rövid forma szintje azonban növekedett, feltehetően a kémiai-fehérje kölcsönhatás stabilizálódása miatt (ábra. 1C, felső-középső és alsó-középső panelek) 34. Abban az esetben, ha a kezelés 10 db TD-158,a CRBN szint helyreállt; ez a “horog” hatás egy tipikus jellemző,amely a nagy dózisú PROTAC által kiváltott fehérje lebontás9,35, 36, 37. A TD-487, a TD-165 sztereoizomerje azonban nem indukálta a CRBN lebomlását (ábra. 1C). A TD-343 viszonylag gyenge aktivitással rendelkezett, ami azt jelenti, hogy az oxigén beépítése a linker gátolja a PROTAC aktivitást. Kvantitatív reverz transzkripció-polimeráz láncreakció (RT-PCR) elemzés azt mutatta, hogy a VHL-CRBN heterodimerizáló Protacsok által kiváltott crbn szint csökkenése nem az mRNS változásainak eredménye (kiegészítő ábra. S1B). Az 50% – os lebomlási koncentrációt (DC50) és a maximális lebomlási értéket (Dmax) minden szintetizált vegyület esetében mértük. A számított DC50 és Dmax értékek a TD-158 esetében 44,5 nM és 97 volt.1%, illetve a TD-165 megfelelő értékei 20,4 nM, illetve 99,6% voltak (ábra. 1D és kiegészítő ábra. S1D). A rövidebb linker-tartalmú degradáló TD-156 (DC50 = 100,6 nM, Dmax = 96,9%) gyengébb aktivitást mutatott a TD-165-höz képest (kiegészítő ábra. S1C). A TD-343 (DC50 = 367,8 nM, Dmax = 85,1%), a kapcsolóba beépített oxigénnel a CRBN nem hatékony lebomlásához vezetett. A talidomiddal való kapcsolat hatásának tesztelésére megvizsgáltuk a CRBN degradációját VHL-CRBN heterodimerizáló Protacsokkal, eltérő kötéssel. TD-760 (DC50 = 367.7 nM, Dmax = 82%), glikolos kötéssel, és a TD-033 (DC50 = 2546,1 nM), amid kötéssel, csökkent CRBN lebomlást mutatott, míg a TD-759 (DC50 = 28,8 nM), glicin kötéssel, hasonló hatékonyságot mutatott, mint a TD-165. Annak megállapításához, hogy a relatív fehérjeszintek hozzájárulhatnak-e ehhez az elfogult fehérjebomláshoz, a VHL-t, a CRBN-t vagy mindkettőt túlexpresszáló sejteket TD-158-mal kezeltük, és elemeztük a CRBN-és a VHL-szinteket. A CRBN-szintek minden esetben csökkentek, míg a VHL-szintek hasonlóak vagy emelkedtek (ábra. 1E). Az idő-tanfolyam kísérletek, TD-158 lebontotta CRBN több mint 80% belül 3 h, majd teljesen lebontották után 12 h (ábra. 1F). A TD-158 által kiváltott CRBN lebomlást különböző emberi sejtvonalakban is megfigyelték (kiegészítő ábra. S2A-D).

A CRBN degradációja VHL-CRBN heterodimerizáló PROTACs által a CRL2VHL

annak igazolására, hogy a CRBN degradációja a TD-158-tól függ UPS vagy Cullin-gyűrű ubiquitin ligázok (CRL), teszteltük a bortezomibot, egy proteaszóma inhibitort és az MLN4924-et, egy neddilációs inhibitort. A TD-158-mal és bortezomibbal vagy MLN4924-gyel történő együttes kezelés megakadályozta a CRBN lebomlását (ábra. 2a és kiegészítő ábra. S3A). Ahogy az várható volt, a poli-ubiquitin láncképződés jelentősen megnőtt a TD-158 jelenlétében (ábra. 2B). Ezenkívül a VHL kis interferáló RNS (siRNS) általi leütése gyengítette a TD-158 által kiváltott CRBN lebomlást a HEK293T sejtekben (ábra. 2C). Ezzel szemben a VHL expressziója 786-O sejtekben, egy VHL-hiányos vese carcinoma sejtvonal, helyreállította a TD-158 által kiváltott CRBN lebomlást (ábra. 2D). Ezekkel az eredményekkel összhangban a crl2vhl komplex állványfehérje, a cullin2 siRNS által közvetített leütése megakadályozta a TD-158 által kiváltott CRBN lebomlást (ábra. 2E). Ezek az eredmények együttesen azt mutatják, hogy a CRBN degradációja a VHL-CRBN heterodimerizáló Protacsok által a CRL2VHL komplextől függ.

a CRBN degradációja a VHL-CRBN heterodimerizáló Protacsok által a CRL2VHL-től függ. (A) A HEK293T sejteket TD-165-tel (1 6m) kezeltük 12 órán keresztül, majd bortezomib (20 nM) vagy DMSO hozzáadásával 8 órán keresztül. (B) FLAG-tagged CRBN (CRBN-Flag) és HA-tagged Ubiquitin (ha-Ub) expresszálódtak HEK293T sejtekben. 24 óra elteltével a sejteket TD-158-mal (500 nM) és bortezomibbal (20 nM), vagy DMSO-val és bortezomibbal (20 nM) kezeltük 12 órán keresztül. a Flag m2 mágneses gyöngyökkel immunprecipitált teljes sejtes lizátumokat és fehérjéket immunoblottálással elemeztük a jelzett fehérjékre. (C) A HEK293T sejteket VHL-re specifikus siRNS-sel vagy kódolt (kontroll) siRNS-sel transzfektáltuk. 24 óra elteltével a sejteket TD-158-mal (500 nM) kezeltük 24 órán keresztül. (D) a 786-O sejteket és a VHL-expresszáló 786-O sejteket (786-O + VHL) TD-158-mal (500 nM) kezeltük 24 órán keresztül. a teljes sejtes lizátumokat immunoblottálással elemeztük a jelzett fehérjék szempontjából. (E) a HEK293T és a CUL2 – knockdowned hek293t sejteket TD-165-tel (1!) vagy TD-487-tel (1!) kezeltük 24 órán keresztül, és a teljes sejtes lizátumokat immunoblottálással elemeztük. F) A CRBN-zászlót hek293t cellákban fejezték ki. 36 óra elteltével a sejteket TD-158-mal (1!) és bortezomibbal (20 nM), vagy DMSO-val és bortezomibbal (20 nM) kezeltük 12 órán keresztül. a Flag m2 mágneses gyöngyökkel immunprecipitált teljes sejtes lizátumokat és fehérjéket immunoblottálással elemeztük a jelzett fehérjékre. G) a tisztított CRBN és VHL/ELOB / ELOC komplex fehérjéket négy csőbe kevertük és alikvotáltuk. TD – 158 és glutation gyöngyöket adtunk a jelzett módon, és 3 órán át inkubáltuk. inkubálás után a glutation gyöngyöket immunoblotting és Coomassie Kék festéssel mossuk és elemezzük.

a Protac-ok általi hatékony lebomláshoz hármas komplexet kell kialakítani a célfehérjével és az E3 ligázával9,38. Ennek tesztelésére koimmunprecipitációs kísérleteket végeztünk. Azt találtuk, hogy exogén expresszált Flag-tagged CRBN co-immunoprecipitált endogén VHL jelenlétében TD-158, de nem annak hiányában (ábra. 2F). A tisztított fehérjéket alkalmazó GST lehúzási kísérletek azt mutatták, hogy a CRBN közvetlenül kölcsönhatásba lépett a VHL-Elongatin B/C komplextel TD-158 jelenlétében (ábra. 2 g). Ezenkívül a felesleges pomalidomid vagy VHL ligandum hozzáadása gátolta a TD-158 által kiváltott CRBN lebomlást (kiegészítő ábra. S3B, C). Exogén módon expresszált CRBN Y384 / W386A (AA), egy pomalidomid-kötő–hibás mutáns16, a TD-158 nem bomlott le (kiegészítő ábra. S3D). Így ezek az adatok arra utalnak, hogy a crbn, a VHL és a TD-158 közötti hármas komplex kialakulása a CRBN lebomlásának előfeltétele.

egy globális proteomikus elemzés azt mutatja, hogy a TD-158 indukálja a CRBN lebomlását

a CRBN lebomlásának elfogulatlan vizsgálata érdekében kvantitatív proteomikai elemzést végeztünk. A crbn degradáció másodlagos hatásainak minimalizálása érdekében a Jurkat sejteket, amelyek crbn-t és IMiD neo szubsztrátokat expresszáltak, TD-158-mal vagy DMSO-val (vivőanyag-szabályozás) kezeltük 12 órán keresztül. az egyes mintákból származó fehérjéket emésztettük, és az emésztett peptideket izobár jelölésre címkéztük folyadékkromatográfia-tandem tömegspektrometriával összekapcsolva. Ez az elemzés 7148 fehérjét azonosított, amelyek több mint három nem redundáns, egyedi peptidet tartalmaznak (S1 kiegészítő táblázat). Csak három fehérje—CRBN, CNIH1 és LMBRD2-felel meg a p-érték = 0,05 és több mint 1,5-szeres változás kritériumainak. Ezek közül a CRBN volt az egyetlen fehérje, amely több mint 2-szeresére változott (ábra. 3A). A CRL4CRBN komplexek (CUL4A, CUL4B, DDB1 és RBX1) és a CRL2VHL komplexek (elongatin C, elongatin B , CUL2 és RBX1) egyéb komponenseinek szintje azonban változatlan maradt (ábra. 3B,C). Érdekes módon az imid-k korábban jelentett neo-szubsztrátjainak szintje, beleértve az IKZF1, IKZF3, ZFP91, ZNF276 és ZNF653, nem változott a TD-158 kezelés során (ábra. 3B) 39,40,41. Ezeket az eredményeket jurkat-ban és különböző myeloma multiplex sejtvonalakban végzett immunoblottolással igazolták (ábra. 3D és kiegészítő ábra. S2A-D).

globális proteomikus változások a TD-158 kezelés után. A) kvantitatív proteomikai elemzésekkel azonosított fehérjék vulkáni diagramja, összehasonlítva a 12 órán át kezelt Jurkat sejtekből származó lizátumokat 1 MHz-es TD-158-mal vagy DMSO-val. Az adatok három biológiai ismétlést képviselnek. Az x tengely a fehérje szintjének redős változását jelenti logaritmikus skála, az y tengely pedig a P-értéket képviseli logaritmikus skála. (B) A CRL4CRBN komplex, a CRL2VHL komplex és a CRBN Neo-szubsztrát relatív bősége (*P < 0,05, **P < 0,1). A piros vonal 1,5-szeres különbséget jelez. (C) A Jurkat sejteket TD-158-mal (1 ons) vagy DMSO-val kezeltük 24 órán keresztül. a teljes sejt lizátumokat immunoblottolással elemeztük CRL4CRBN komplex fehérjék. (D) A Jurkat sejteket DMSO-val vagy anélkül kezeltük, TD-158 (1 ~ m), pomalidomid (1 ~ m) vagy VHL ligandum (1 ~ m) 24 órán keresztül.

a CRBN degradációja VHL-CRBN heterodimerizáló Protacsok által összefoglalja a CRBN hiányt

a CRL4CRBN endogén szubsztrátja a glutamin szintetáz GLUL, amely kulcsfontosságú enzim a glutamin biogenezisében. Az ACETILTRANSZFERÁZ CBP / p300 acetilálja a GLUL két N-terminális lizinmaradékát magas glutaminszint mellett, és a kapott acetilezett GLULOT a CRL4CRBN rögzíti és ubiquitinálja, majd proteaszómákkal eltávolítja22. A TD-158 GLUL-szintre gyakorolt hatásának vizsgálatához a Hep3B glutamin sejteket 48 órán át éheztettük, majd TD-158 jelenlétében vagy hiányában újratöltöttük a glutamint. A TD-158 indukálta a CRBN lebomlását a glutamin státusztól függetlenül, és a GLUL szintje lassabban csökkent az idő múlásával a TD-158 jelenlétében, mint annak hiányában (ábra. 4A, B). Ezenkívül az in vivo ubiquitinációs vizsgálatok azt mutatták, hogy a GLUL ubiquitinációja csökkent a TD-158 jelenlétében (ábra. 4C). Azt is megvizsgáltuk, hogy a TD-165 kezelés celluláris rezisztenciát biztosít-e az IMiD-vel szemben. Két IMiD-érzékeny sejtvonalat, a WSU-DLCL2-t és az RPMI8226-ot TD-165-tel vagy DMSO-val előkezeltük 24 órán keresztül, majd pomalidomiddal, TD-165-tel vagy mindkettővel kezeltük 3 d-re. a TD-165-tel történő előkezelés mindkét sejtvonalban csökkentette a pomalidomid anti-proliferatív hatását (ábra. 4D, E). Ezek az adatok együttesen azt mutatják, hogy a CRBN degradációja a VHL-CRBN heterodimerizáló Protacsok által összefoglalja a CRBN hiányt.

a CRBN degradációja a VHL-CRBN heterodimerizáló Protacsok által újrafogalmazza a CRBN-hiányt. (A) A Hep3B sejteket glutamin éheztettük és TD-158-mal (500 nM) kezeltük 48 órán keresztül. a sejteket ezután glutaminnal (4 mM) kezeltük különböző időpontokban. A GLUL lebomlását immunoblottolással elemeztük. B) három független kísérlet kvantitatív eredményei. C) A GLUL-Myc-t és a V5-Ub-t hek293t sejtekben expresszáltuk. 24 óra elteltével a sejteket TD-158-mal (500 nM) vagy DMSO-val kezeltük 12 órán keresztül, majd bortezomibbal (100 nM) vagy DMSO-val kezeltük 12 órán keresztül. A (D,E) WSU-DLCL2 (D) és az RPMI8226 (E) sejteket TD-165-tel (1) vagy DMSO-val előkezeltük 24 órán keresztül, majd a begyűjtést követően négy csoportra osztottuk. Ezt követően mindegyik csoportot POMALIDOMIDDAL (1 ~ m) és DMSO-val, vagy pomalidomiddal (1 ~ m) és TD-165-tel (1 ~ m) kezeltük 3 d-re. A sejtek életképességét CellTiter-Glo alkalmazásával mértük (**P < 0,001, * P < 0,01).

a VHL-CRBN heterodimerizáló Protacsok in vivo hatásainak vizsgálatához megkíséreltük meghatározni, hogy a TD-165 képes-e indukálni a CRBN lebomlását állatmodellekben. Bár a teratogenitás szempontjából fontos egér CRBN (mCRBN) aminosavmaradékai nem konzerválódnak, az mCRBN egyértelműen lebomlott, bár kissé kisebb mértékben, a TD-165 egér embrionális fibroblasztokban (kiegészítő ábra. S4A). Ezután TD-165-et adtunk intraperitoneálisan egereknek annak meghatározására, hogy a TD-165 indukálja-e a CRBN lebomlását in vivo. A CRBN szintje azonban nem változott a lépben, a perifériás vér mononukleáris sejtjeiben (pbmc-k) vagy a májban (kiegészítő ábra. S4B). Mivel a TD-165 farmakokinetikája ésszerű (S2 kiegészítő táblázat), a hatás hiánya a TD-165 magas plazmafehérje-kötődésének (99,9%) tulajdonítható (S3 kiegészítő táblázat).

az N-terminálisan csonka CRBN nem degradálódik a VHL-CRBN heterodimerizáló Protacsokkal

annak meghatározásához, hogy a CRBN melyik doménje fontos a TD-165 által közvetített CRBN degradáció szempontjából, létrehoztunk egy sor CRBN deléciós mutánst (D1–D4), az ábrán látható módon. 5A.a teljes hosszúságú CRBN-t vagy egyedi deléciós mutánsokat expresszáló sejteket DMSO-val vagy TD-165-tel kezeltük, és a sejtlizátumokat a TD-165 kezelés után megvizsgáltuk a lebomlás szempontjából. Meglepő módon a négy CRBN deléciós mutáns egyikét sem bomlott le a TD-165, míg a teljes hosszúságú CRBN hatékonyan lebomlott (ábra. 5B). Nevezetesen, a VHL-szintek enyhén emelkedtek feltehetően a kémiai-fehérje kölcsönhatás stabilizálása miatt TD-165 jelenlétében, de a csonka CRBN mutánsok expressziója nem változott TD-165 jelenlétében (ábra. 5B). Ennek egyik lehetséges magyarázata az lenne, hogy a deléciós mutánsok képtelenek hármas komplexet alkotni. A D1 mutáns azonban hármas komplexet alkotott a TD-165-tel és a VHL-lel (ábra. 5c), és a D1 ubiquitinációja nőtt a TD-165 jelenlétében (ábra. 5D). Ezután feltételeztük, hogy a CRBN amino-terminális lizinmaradványai szükségesek az ubiquitinációhoz. Ennek az elképzelésnek a teszteléséhez a CRBN (a.a. 1-80) N-terminálisán belül mindhárom lizinmaradékot argininnel helyettesítettük, külön-külön és kombinációban, majd megvizsgáltuk a sejtlizátumokat a CRBN lebomlása szempontjából. A TD-158 hatékonyan lebontotta az összes mutánst ugyanolyan mértékben, mint a vad típusú CRBN (ábra. 5E), jelezve, hogy a CRBN N-terminálisán lévő három lizinmaradék nem szükséges a VHL-CRBN heterodimerizáló Protacsok által indukált lebomláshoz.

a CRBN N-terminális rendezetlen régiója szükséges a degradációhoz, de nem az ubiquitinációhoz a VHL-CRBN heterodimerizálásával protacs. A) A CRBN csonkolási mutánsokat bemutató sematikus ábra. LON, lon proteáz domén; TB, talidomid kötő domén. (B) Xpress-tagged teljes hosszúságú CRBN vagy D1, D2, D3, vagy D4 deléciós mutánsokat expresszáltunk HEK293T sejtekben. 24 óra elteltével a sejteket TD-165-tel (3 db) vagy DMSO-val kezeltük 24 órán keresztül. A teljes sejtes lizátumokat immunoblottálással elemeztük a jelzett fehérjék számára. (C) az Xpress-tagged D1-et és az His–SBP-tagged VHL-t kódoló plazmidokat transzfektáltuk HEK293T sejtekbe. 48 óra elteltével a sejteket TD-165-tel (1 6m) vagy DMSO-val kezeltük 24 órán keresztül. a teljes sejtes lizátumokat és a sztreptavidin gyöngyökkel lehúzott fehérjéket immunoblottálással elemeztük a jelzett fehérjékre. (D) az Xpress-tagged crbn, K39R, K42/43 R vagy K39/42/43 r mutánsokat kódoló plazmidokat transzfektáltuk HEK293T sejtekbe. 24 óra elteltével a sejteket TD-158-mal (2 MHz) vagy DMSO-val kezeltük 24 órán keresztül. A teljes sejtes lizátumokat immunoblottálással elemeztük a jelzett fehérjék számára.

a megcélzott fehérje rendezetlen régiója szükséges a protac által kiváltott hatékony lebomláshoz

ezután a teljes hosszúságú CRBN és a CRBN D1 deléciós mutáns közötti szerkezeti különbségeket igyekeztünk meghatározni. Az előrejelzések szerint a CRBN N-terminálisa (a.a. 1-80) egy kibontott vagy eredendően rendezetlen régiót tartalmaz, egy IUPred2A elemzés alapján (kiegészítő ábra. S5A). Ez a rendezetlen régió (a.a. 1-48) valóban felismerhetetlen volt a CRL4CRBN kristályszerkezetében rugalmassága miatt (PDB bejegyzés; 6BN7). Kimutatták, hogy az eredendően rendezetlen régió a proteaszomális degron egyik fő összetevője, és a proteaszomális proteolízis iniciátoraként működik25. Alternatív megoldásként a rendezetlen régió nélküli globuláris fehérjék esetében a P97 / valozintartalmú fehérje (p97/VCP) komplex kibonthatja a másodlagos szerkezetet, megkönnyítve a fehérjék proteaszomális lebomlását. A PROTAC által indukált fehérje lebomlás és a p97/VCP komplex közötti kapcsolat vizsgálatához az N2,N4-dibenzil-kinazolin-2,4-diamin (DBeQ), egy p97/VCP inhibitor hatását vizsgáltuk a TD–165 által indukált CRBN lebomlásra. Ezek a kísérletek azt mutatták, hogy a CRBN lebomlását nem befolyásolta a DBeQ kezelés (ábra. 6A). A pozitív kontrollként használt DNS-károsodást indukáló transzkriptum 3 (DDIT-3; CHOP) és lipidált LC-3II szintje emelkedett volt a DBeQ-kezelés során. A p97 leütése siRNS vagy DBeQ kezelés által károsodott ERAD és autofágia utak, ami a Chop, egy jól megalapozott UPR marker, illetve az LC-3II, egy reprezentatív autofágia marker felhalmozódásához vezet (ábra. 6A) 42. Ezért annak vizsgálatához, hogy a CRBN rendezetlen régiója elősegíti-e a PROTAK által kiváltott proteaszomális lebomlást, a CRBN rendezetlen régióját (a.a. 1-80) D2, D3 és D4 mutánsokhoz kapcsoltuk, és megvizsgáltuk a kiméra fehérjék lebomlását. Az összes kiméra fehérjét, különösen a D4 kimérát, a TD-165 lebontotta koncentrációfüggő módon (ábra. 6B). A CRBN rendezetlen régió bevezetése a VHL N – vagy C-terminálisába azonban nem indukálta a fúziós fehérje lebomlását (ábra. 6C), jelezve, hogy a rendezetlen régió kötődése nem elegendő az összes megcélzott fehérjéhez. Hogy ezt az elképzelést kiterjesszük más Protac-ok által kiváltott degradációra, teszteltük az ARCC4-et, egy korábban bejelentett androgénreceptor (AR) PROTAC43-at, mert az AR egy kibontott régiót is tartalmaz az N-terminálisnál (a.A. 1-330), az IUPred2A elemző eszköz segítségével meghatározva (kiegészítő ábra. S5B). Az ARCC4 kezelés után az AR az N-terminális rendezetlen régió nélkül (XHAMN330) kevésbé volt hatékonyan lebomlott, mint a teljes hosszúságú AR. Érdekes módon a CRBN rendezetlen régiójának (a.a. 1-80) az AR XHAMN330-hoz való kötődése növelte a lebomlás hatékonyságát (ábra. 6d és kiegészítő ábra. S5C). Ennek megfelelően az AR rendezetlen régió (a.a. 1-170) kötődése a CRBN D1 mutánshoz szintén elősegítette a TD-165 proteolízisét (ábra. 6E és kiegészítő ábra. S5D).

a megcélzott fehérje rendezetlen régiója szükséges a Protacsok általi hatékony lebomláshoz. (A) A HEK293T sejteket TD-165-tel kezeltük (1 db), a p97/VCP inhibitor DBeQ-vel (10 db), vagy mindkettővel 6 h. A teljes sejtes lizátumokat immunoblottálással elemeztük a jelzett fehérjékre. (B) az N-terminális CRBN – t (a.A. 1-80) a HIS-SBP-vel jelölt VHL plazmid N–vagy C-terminálisába helyeztük, és a plazmidokat hek293t sejtekben expresszáltuk. 8 óra elteltével a sejteket összegyűjtöttük és négy csoportra osztottuk. Mindegyik csoportot ezután növekvő TD-165 koncentrációval kezeltük 48 órán keresztül. (C) A CRBN (a.a. 1-80) n-terminálisát expresszáló plazmidokat D2, D3 vagy D4-re fuzionálva transzfektáltuk HEK293T sejtekbe. 8 óra elteltével a sejteket összegyűjtöttük és négy csoportra osztottuk. Mindegyik csoportot ezután növekvő TD-165 koncentrációval kezeltük 48 órán keresztül. (D) A teljes hosszúságú AR-t, az N-terminálisan törölt AR-t (XHAMN330) vagy a CRBN (a.a. 1-80) N-terminálisát (a.A. 1-80) fuzionálva) expresszáló plazmidokat TRANSZFEKTÁLTUK HEK293T sejtekbe. 8 óra elteltével a sejteket összegyűjtöttük és négy csoportra osztottuk. Mindegyik csoportot ezután az ARCC4 növekvő koncentrációival kezeltük 24 h. a teljes sejtes lizátumokat immunoblottálással elemeztük a jelzett fehérjék számára. (E) a teljes hosszúságú CRBN-t, a D1 deléciós mutánst vagy az AR (a.a. 1-170) N-terminálisát expresszáló plazmidokat D1-re (AR (1-170) +D1) transzfektáltuk HEK293T sejtekbe. 8 óra elteltével a sejteket összegyűjtöttük és négy csoportra osztottuk. Mindegyik csoportot ezután növekvő TD-165 koncentrációval kezeltük 48 órán keresztül.

ezen eredmények további megerősítése érdekében nagy hatékonyságú Protac-okat választottunk ki (DC50 < 1 ons) irodalmi keresés alapján, majd elemeztük őket egy belső rendezetlen régióra az IUPred2A eszköz segítségével. Érdekes módon a kiválasztott PROTAC célzott fehérjék kétharmada több mint 40 aminosavból álló rendezetlen régióval rendelkezik, akár az egyik végükön, akár belsőleg (1.táblázat)44, bár a rendezetlen vagy strukturálatlan régiók aminosav-szekvencia-alapú előrejelzése nem vesz figyelembe más tényezőket, mint például a fehérje-fehérje kölcsönhatás vagy a transzláció utáni módosítások,44,45, 46. Ennek megfelelően kimutatták, hogy a VHL-Homo-PROTAC a VHL hosszú formájának lebomlását indukálja, amely rendezetlen régiót rejt magában N-terminális, de nem a VHL rövid forma47. Így ez alátámasztja azt az elképzelésünket, hogy a célzott fehérjék rendezetlen régiója szükséges a Protacsok hatékony lebomlásához.