TEXT

a meticillinrezisztens Staphylococcus aureus (MRSA) kezelését az antibiotikum-rezisztencia arányának növekedése bonyolította. Az MRSA törzsek expresszálják a mecA által kódolt penicillin-kötő fehérjét 2a (PBP2a), amely rezisztenciát biztosít a kb-laktámokkal szemben azáltal, hogy a reaktív szerint keskeny, hozzáférhetetlen hasadékban védi, lehetővé téve a sejtfal szintézisének folytatását antibiotikum jelenlétében (1, 2). A ceftobiprol és a ceftarolin anti-MRSA cefalosporinok, amelyek terápiásán hasznos koncentrációban gátolják a PBP2a-t. A ceftobiprol R2 csoportja a pbp2a keskeny hasadékába nyúlik, hogy hozzáférjen az aktív helyhez, míg a ceftarolin kötődése alloszterikus változást okoz a PBP2a-ban, feltárva az aktív helyet egy második molekulával való kötődéshez (3, 4). A ceftobiprolt klinikai vizsgálatokban értékelték, és a ceftarolint az FDA jóváhagyta a bőr és a Bőrszerkezet fertőzéseinek kezelésére, beleértve az MRSA (5-10) okozta fertőzéseket is.

csoportunk korábbi tanulmányai kimutatták, hogy a Col törzs átjutása a ceftobiprolban kiválasztja a rezisztens mutánsokat mutációkkal a PBP2a-ban (11). Ez a tanulmány azt vizsgálja, hogy a ceftarolin áthaladása is kiválasztja-e a hasonló mutációkat. Az átjárási kísérleteket két különböző MRSA háttérrel végezték: col, egy archaikus, homogén rezisztens izolátum 1961-ből, és SF8300, heterogén rezisztens kortárs USA300 MRSA törzs. A COLnex-et és az SF8300ex-et, a Coln és az SF8300 mecA-negatív származékos törzseit a (12) kromoszómális staphylococcus kazettás kromoszóma MEC (SCCmec) (13) kivágásával nyertük. A pyk20 plazmidon (amely paw8 plazmidból származik, és col-ból klónozott vad típusú mecA-t tartalmaz ) a vad típusú mecA-t újra bevitték a COLnex-be és az SF8300ex-be a passage vizsgálatokhoz. Ha a mecA rezisztenciát közvetített, akkor vagy a plazmid rezisztens mutánsának kikeményedése, vagy érzékeny háttérbe juttatása a fenotípus elvesztését vagy növekedését eredményezi, lehetővé téve a mecA rezisztenciához való hozzájárulásának meghatározását. Az ebben a vizsgálatban használt törzseket és plazmidokat az 1.és 2. táblázat sorolja fel. A COLnex-et(pYK20) és az SF8300ex-et (pYK20) sorozatosan adagolták a ceftarolin (Forest Laboratories) növekvő koncentrációját tartalmazó triptikus szójalevesben, amint azt korábban leírtuk (11).

28 nap elteltével a ceftarolinban átadott COLnex(pYK20) és SF8300ex(pYK20) két mutáns, a COLnexpT(pYK20COLT*) és sf8300expt(pyk208300t*) (csillag jelzi a ceftobiprol vagy ceftarolin szelekció során col vagy Sf8300 háttérben keletkező plazmidot) (1. táblázat). A ceftarolin, a ceftobiprol és az egyéb ~ laktámok (Sigma-Aldrich) mic-jeit a clsi standardok szerinti tápközeghígítási módszerrel határoztuk meg (3.táblázat) (15). A COLnexpT (pYK20COLT*) mind a ceftarolinnal, mind a ceftobiprolral szemben magas szintű rezisztenciát mutatott, MIC értéke sorrendben 64 ~ g/ml, illetve 32 ~ g/ml volt. Az SF8300expT (pYK208300T*) alacsony szintű ellenállást fejezett ki a 4.napon való áthaladáskor, a MIC értéke 4 Ft/ml volt, amely 24 további szakasz ellenére változatlan maradt (3. táblázat és ábra. 1). A COLnex(pYK20) (11), A COLnexpB(pYK20COLB*) korábban leírt ceftobiprol-passzív mutáns magas szintű rezisztenciát mutatott mind a ceftobiprollal, mind a ceftarolinnal szemben, mindegyik MIC-je 64 ~ g/ml volt.

a mecA plazmidot szekvenáltuk a passzív törzsek mutációira. Mivel a PBP-k a laktámok célpontjai, a pbp1, -2, -3 és -4 szintén szekvenálásra került. Végül a gdpP – t és az acrB-t szekvenáltuk, mivel ezen gének mutációit azonosították a Col mecA-negatív ceftobiprol-rezisztens mutánsában (16). Plasmid pyk208300t * (pyk20 származó sf8300ex passaged ceftarolin), volt egy egypontos mutáció (G A kódoló szekvencia pozíció 1339) mecA, ami egy nem szinonim aminosav változás, E447K. nem mutációk voltak jelen más PBP gének, acrB, vagy gdpP (4.táblázat).

Plasmid pYK20COLT* (Pyk20 a COLnex passaged-ből ceftarolinban) nem volt mutáció a Meca-ban. Egy pontmutációt (C-től T-ig a CDS 1327-es pozíciójában) találtunk, amely a H443y mutációt vezette be a GdpP-be, egy pontmutációt (G-től A CDS 466-os pozíciójában), amely a D156N mutációt vezette be a PBP2-be, és két pontmutációt (A-tól G-ig a CDS 601-es pozíciójában és C-től G-ig a CDS 723-as pozíciójában), amely T201A és F241L mutációkat vezetett be a PBP4-be (4.táblázat). Megjegyzendő, hogy a mecA-t tartalmazó COL ceftarolin áthaladása természetes kromoszómális helyén szintén magas szintű rezisztenciával rendelkező mutánst eredményezett, de a mecA-ban nem voltak mutációk (az adatok nem láthatók). Ennek a passzív mutánsnak a szekvenciaelemzése egy pontmutációt tárt fel a pbp2-ben (G-től A-ig az 1891-es CDS-pozícióban), ami a g631s aminosav-változást, egyet pedig a pbp4-ben (T-től A-ig a 414-es CDS-helyzetben), n138k mutációt vezetve be. Ezek az adatok azt mutatják, hogy még mecA jelenlétében is a ceftarolin kiválaszthat más gének mutációit, ami rezisztenciát eredményez.

a colnexpb(pYK20COLB*) és az SF8300expT(pYK208300T*) Plazmidjainak kikeményedése, amelyek mindegyike mecA mutációval rendelkezett, csökkentette a Mic-ket az összes vizsgált laktám esetében (5.és 6. táblázat). Plazmidjának gyógyító COLnexpT (pYK20COLT*), amelyben nem voltak mecA mutációk, nem volt hatással a Mic-kre (5.táblázat). A pyk20colb*, amely a mecA-ban 6 szubsztitúciós mutációt tartalmaz, az érzékeny Kolnex szülővé történő átalakulása, amely a transzformáns Kolnex-et(pYK20COLB*) eredményezi, magas szintű ceftarolint és ceftobiprol-rezisztenciát eredményezett. A pyk208300t*, amely a mecA egyetlen e447k mutációját tartalmazza, COLnex-vé történő átalakulása, amely a Transzformáns COLnex-et(pYK208300T*) eredményezte, magas szintű rezisztenciát eredményezett a ceftobiprollal szemben (MIC 64 6G/ml), de csak alacsony szintű rezisztenciát eredményezett a ceftarolinnal szemben (MIC 4 6G/ml) (5.táblázat). A pYK20COLB* sf8300ex-vé történő átalakítása, az sf8300ex(pYK20COLB*) transzformáns előállítása magas szintű rezisztenciát eredményezett a ceftarolinnal és a ceftobiprolral szemben (MIC 32 ~ g/ml mindegyikhez) (6.táblázat). Az SF8300ex átalakításának többszöri kísérlete a pYK208300T* segítségével sikertelen volt.