absztrakt
a HIV-1 transzkripciót a CDK9/ciklin T1 szabályozza, amelyet a tipikus sejtciklus-függő kinázzal ellentétben a 7sk kis nukleáris ribonukleáris fehérje komplex (snRNP). Míg ennek a komplexnek a fehérje komponenseit jól tanulmányozták, a komplex képződésének mechanizmusa még mindig nem teljesen ismert. A CDK9/ciklin T1 társulását a 7SK snRNP-vel részben reverzibilis CDK9 foszforiláció szabályozza. Itt bemutatjuk a cdk9 foszforilációjában részt vevő kinázok és foszfatázok átfogó áttekintését, és megvitatjuk szerepüket a HIV-1 replikáció szabályozásában és a gyógyszerfejlesztés céljának lehetőségét. Javasoljuk a HIV-1 transzkripciós szabályozás új útját CDK9 Ser-90 foszforiláció útján CDK2 és CDK9 Ser-175 defoszforiláció fehérje foszfatáz-1 segítségével.
1. Bevezetés
a HIV-1 fertőzés teljes felszámolása újszerű megközelítéseket igényel az integrált HIV-1 provírus indukálásához, amelyet a meglévő antiretrovirális gyógyszerek nem befolyásolnak, és amely az antiretrovirális terápia befejezésekor visszapattan . A HIV-1 késleltetés számos tényező következménye lehet, mint például a HIV-1 transzkripciós aktivátor fehérje (tat) vagy sejtes transzkripciós aktivátorok hiánya, transzkripciós interferencia a celluláris promoterekkel, kedvezőtlen integrációs hely, epigenetika és valószínűleg más tényezők . Így a HIV-1 transzkripció aktiválásának mechanizmusainak jobb megértése fontos az indukcióra, valamint a HIV-1 transzkripció gátlására irányuló új terápiák megtervezéséhez. Itt áttekintjük a cdk9/ciklin T1 aktiválásában részt vevő kinázokat és foszfatázokat, és megvitatjuk, hogyan lehet ezeket az enzimeket potenciálisan felhasználni a HIV-1 gátlására vagy aktiválására a HIV-1 fertőzések kezelésére szolgáló jövőbeli terápiás beavatkozások kidolgozásához.
2. A HIV-1 transzkripció P-tefb általi aktiválása
a HIV-1 transzkripciót a HIV-1 Tat fehérje aktiválja, amely kötődik a tar RNS kidudorodásához, egy hajtű-hurok szerkezet, amely az összes születő HIV-1 transzkripció 5′-végén helyezkedik el, és a CDK9/ciklin T1-et, a pozitív transzkripciós nyúlási faktor B (P-tefb) komponensét toborozza a HIV-1 promóterhez (részletesen áttekintve ; Lásd még az 1.ábrán látható ábrát). A transzkripciós iniciáció során a TFIIH-asszociált CDK7 / ciklin H foszforilálja a Ser-5-öt az 1YSPS7 heptapeptidszekvencián belül 52-szer megismételve az RNAPII C-terminális doménjében (CTD). A Ser-5 foszforilezett RNAPII 20-40 nukleotidnál (nt) halmozódik fel a transzkripció kezdő helyétől lefelé, részben a negatív hatású megnyúlási faktor komplex, NELFÉS a DRB-érzékenységet indukáló komplex, DSIF . A közelmúltban kimutatták , hogy a TFIIH-asszociált CDK7 foszforilálja a CTD Ser-7 maradványokat is, amelyek a Ser-2 foszforilezését p-TEFb-vel alapozhatják meg . A P-TEFb toborzását az U3-R-U5 régióban található HIV-1 promoterbe az 5′ LTR-t megkönnyíti Tat amely a CDK9/ciklin T1-et célozza meg TAR RNS ahol a ciklin T1 kötődik a G-gazdag hurok TAR RNS . A CDK9/ciklin T1 toborzása elősegíti a transzkripció megnyúlását RNS polimeráz II (RNAPII) által, amely egyébként szünetel a tar RNS szintézise után . Az RNAPII felszabadulása a szünetből a P-TEFb komplex által mRNS-záródással és a NELF elvesztésével jár . A P-TEFb az RNS polimeráz II (RNAPII) transzkripció megnyúlását váltja ki a negatív megnyúlási faktor (NELF) és a DRB-érzékenységet indukáló komplex (DSIF/Spt4/Spt5) foszforilálásával, ezáltal elősegítve a NELF felszabadulását és a Ser-2 maradványok foszforilálását az RNAPII CTD-ben (áttekintve ). A nelf disszociációja után a dsif pozitív megnyúlási tényezővé válik, és növeli az rnapii folyamatosságát . Bár a P-TEFb a megnyúlási komplexummal utazik, CTD-kináz aktivitására már nincs szükség, ha a komplex felszabadul a szünetből .
A P-tefb fontossága miatt a szabályozást fenn kell tartani a megfelelő működés biztosítása érdekében. A CDK9 specifikus helyeinek foszforilációjának és defoszforilációjának a transzkripciós folyamat során meg kell történnie, és szigorúan ellenőrizni kell. Ez a felülvizsgálat a CDK9 szabályozására összpontosít foszforilációs módosítások révén.
3. A P-TEFb összetétele és szerepe a HIV-1 transzkripció aktiválásában
A P-TEFb egy heterodimer, amely ciklinfüggő kináz 9-ből (CDK9) és az egyik C-típusú T1, T2a vagy T2b ciklinből áll, amelyek közül a ciklin T1 A leggyakoribb partner . Cyclin K, amely eredetileg úgy gondolták, hogy egy kisebb ciklin CDK9 ma már elismert, hogy egy ciklin partnere CDK12 és CDK13 . Csak a ciklin T1 fehérje hatékonyan képez komplexet a HIV-1 Tat-val, amely kötődik a TAR RNS-hez . Ez annak köszönhető, hogy a ciklin T1-ben a 261-es pozícióban cisztein maradvány található, nem pedig a ciklin T2a és T2b fehérjékben található aszparagin. A mutált Cys-261-gyel rendelkező ciklin T1 kötődik a Tat-hoz, de nem képes tat-ot toborozni a TAR RNS-be. A tat és a tar RNS és a ciklin T1 kölcsönhatása a cinkionoktól függ, ami szintén megköveteli a Cys-261 jelenlétét .
a CDK9-nek két funkcionális izoformája van: egy 42 kDa-s forma, amely túlnyomórészt a lépben, a csecsemőmirigyben és a herében expresszálódik, és egy 55 kDa-s forma, amely különböző szövetekben expresszálódik, de lényegesen alacsonyabb szinten, ez a 42 Kd-s izoform . Az összes ciklin a CDK9 mindkét izoformájához kapcsolódik, és kináz aktivitást mutat a CTD felé az RNAPII – ban . A P-TEFb nagyjából fele inaktív nagy komplexben van, amelyet a 7SK snrns és számos további fehérje köt össze, beleértve a hexametilén-biszacetamid-indukálható protein 1-et (HEXIM1) , az La-hez kapcsolódó LARP7 fehérjét és a metilfoszfatáz-kupakoló mepce enzimet . A P-TEFb kisebb molekulatömegű formája CDK9-ből és ciklin T1-ből áll, és enzimatikusan aktív . A nagy molekulatömegű P-TEFb inaktív a HEXIM1 miatt, amely gátló PYNT szekvenciáját bevezeti a CDK9 aktív helyére .
a nagy molekulatömegű P-TEFb komplex a CDK9/ciklin T1 forrásaként szolgál a HIV-1 tat általi toborzáshoz . A stressz által indukált sejtekben a CDK9 / ciklin T1 komplex disszociál a 7 SK RNS / HEXIM1 fehérjéből, majd megköti a BRD4-et, és transzkripciósan aktív kis komplexet képez, amelyet különféle sejtpromoterekbe toboroznak . A nagy P-TEFb komplex in vitro inaktivitása ellenére a nagy komplex, nem pedig a kicsi komplex fontos a HIV-1 transzkripció HIV-1-ként történő aktiválásához. A Tat verseng a HEXIM1-rel a T1 ciklinhez való kötődésért, elősegítve a P-TEFb disszociációját a nagy komplexből . Kimutatták, hogy a HIV-1 Tat fehérje nagy P-TEFb komplexet toboroz a HIV-1 promoterbe, ahol a TAR RNS képes volt kiszorítani a 7 SK RNS-t és aktiválni a P-TEFb-t .
A Tat elősegíti az aktív P-TEFb-t és további nyúlási faktorokat és transzkripciós koaktivátorokat tartalmazó szuper nyúlási komplex (sec) kialakulását is . Ezek a tényezők közé tartozik az AFF4, ENL, AF9ÉS ell2 nyúlási tényező . Az AFF4 fehérje központi állványként jelenik meg, amely közvetlen kölcsönhatások révén más tényezőket toboroz. AFF4 kötődik ciklin T1, ELL2ÉS ENL vagy AF9 hídként működik, amely összeköti ezt a komplexet a P-TEFb-vel . A Tat és az AFF4 áthidaló funkciói révén a P-TEFb és az ELL2 egy bifunkcionális megnyúlási komplexet képez, amely nagymértékben aktiválja a HIV-1 transzkripciót . Tat nélkül az AFF4 közvetítheti az ELL2-P-TEFb interakciót, bár nem hatékonyan. A Tat legyőzi ezt a korlátozást azáltal, hogy több ELL2-t hoz a P-TEFb-be, és stabilizálja az ELL2-t egy olyan folyamatban, amely aktív P-TEFb-t igényel .
4. CDK9 foszforiláció
A P-TEFb aktivitása számos szerin és treonin maradék foszforilációjától függ, és ezt az alábbiakban tárgyaljuk, amelyeket a CDK9/ciklin T1/Tat modell mutat be a 2.ábrán.
4.1. C-terminális CDK9 foszforiláció
A CDK9 C-terminális maradékainak egy csoportja (Ser-347, Ser-353 és Ser-357; Thr-350 és Thr-354) autofoszforilált, és ez a foszforilezés fontos a CDK9/ciklin T1 tar RNS-hez való kötődéséhez . Ezt bizonyította az enzimatikusan aktív C-terminálisan csonka CDK9 képtelensége a tar RNS megkötésére . Az in vitro autofoszforilált rekombináns CDK9/ciklin T1-et a foszfatáz 2A fehérje (PP2A) hatékonyan defoszorilálta, a foszfatáz-1 fehérje (PP1) azonban nem . Szintén a PP2A-kezelés megakadályozta a CDK9 / ciklin T1 kötődését a Tat és a TAR RNS-hez in vitro . Ezek a megfigyelések arra utaltak, hogy a PP2A megcélozhatja a CDK9 C-terminálisát, és potenciálisan szabályozhatja a P-TEFb és a TAR RNS kölcsönhatását. A cdk9 autofoszforilációját a preiniciációs komplexhez társítva in vitro gátolta a TFIIH . A PP2A később elengedhetetlennek bizonyult a bazális HIV-1 transzkripcióhoz in vitro, mivel a PP2A kimerülés gátolta a bazális HIV-1 transzkripciót, és a pp2a hozzáadása a kimerült kivonatokhoz helyreállította a transzkripciót . Úgy gondolták, hogy a PP2A célpont Thr-29 (lásd alább), de ezt nem bizonyították teljes bizonyossággal, és a hatást in vivo nem reprodukálták. Egy korai vizsgálatban megfigyeltük a bazális, de nem Tat által kiváltott HIV-1 transzkripció enyhe indukcióját PP2A-gátló alacsony koncentrációjú okadainsavval . Azt is megfigyeltük, hogy a bazális és nem a Tat-aktivált HIV-1 transzkripció indukálódik a LIS1 fehérje túlzott expressziójával, amely In vitro kötődik és gátolja a PP2A-t, és kölcsönhatásba lép a HIV-1 Tat fehérjével . Ezek a vizsgálatok együttesen azt mutatják, hogy a PP2A szabályozhatja a bazális HIV-1 transzkripciót, valamint szabályozhatja a P-TEFb és a tar RNS kölcsönhatását a CDK9 C-terminálisának defoszforilezésével.
4.2. N-terminális Thr-29 foszforiláció
kimutatták, hogy a CDK9 Thr-29 Foszforilezését HTLV-1 adó fehérje indukálja . A CDK9 / ciklin T1-et kromatinizált HIV-1 LTR-be és más promoterekbe toborozzák a BRD4 által . Ez a BRD4 toborzás A CDK9 Thr-29 foszforilációjához és a PP2A defoszforiláció követelményéhez kapcsolódott John Brady csoportja . Qiang Zhou csoportja azonban arról számolt be , hogy a CDK9-et foszforilezni kell a Ser-175-en, hogy kötődjön a BRD4-hez, amit Jonathan Karn csoportja nemrégiben megerősített (lásd a részletes vitát alább). A CDK9 Thr-29 homológ a THR-15-tel a CDK2-n, amelyben a foszforilezés gátolja a CDK2 aktivitását . Valójában a Thr-29 foszforilezése gátolta a CDK9 aktivitást és a HIV-1 transzkripciót . Azonban nem sikerült kimutatni a CDK9 Thr-29 foszforilációt az okadainsavval kezelt sejtekben, amelyek gátolták mind a PP2A-t, mind a PP1-et Hunter 2D vékonyréteg elektroforézis és nagy felbontású tömegspektrometria kombinációjával, amely csak a C-terminális Ser/Thr klaszter foszforilációját mutatta, és a Ser-175, amelyek közül csak a Ser-175 foszforilációt indukálta okadainsav . Így a CDK9 Thr-29 foszforiláció nem szabályozható PP2A-val, ezért tovább kell validálni annak tisztázása érdekében szerepe a HIV-1 transzkripció során.
4.3. A CDK9 T-hurok Thr-186 foszforilációs
A CDK9 t hurok számos foszforilációs helyet tartalmaz, köztük a Ser-175 és a Thr-186 (2.ábra). A konzervált Thr-186 foszforilezése szükséges a CDK9 enzimatikus aktivitásához . A CDK9/ciklin T1 társulása a 7SK RNS snRNP-vel a CDK9 Thr-186 foszforilációját igényli . A CDK-kben a T-hurok foszforilezése jelentős konformációs változásokat vált ki, amelyek megnyitják az ATP kötő zsebét és a szubsztrát kötőhelyét, így a CDK-k kinázként teljesen aktívak .
a közelmúltban a CDK7 szelektív kémiai gátlását alkalmazó kémiai-genetikai elemzés kimutatta, hogy kizárólag a CDK9 Thr-186 foszforilációért, valamint a P-TEFb-függő CTD Ser-2 foszforilációért és a hiszton H2B ubiquitilációért felelős in vivo . Így a CDK7 / ciklin H, amelyet korábban CDK-aktiváló kinázként (CAK) azonosítottak a sejtciklusban részt vevő CDK-k számára, mint például a CDK1, 2 és 4, szintén CAK-ként működik a transzkripció szabályozásában részt vevő CDK-k számára, amelyek magukban foglalják a CDK8, 9, 12 és 13 (áttekintve ). A cdk9 T-hurkot foszforiláló kinázok globális elemzése siRNS segítségével azonosított Ca(2+)/kalmodulin-függő kináz 1D (CaMK1D) leütése az siRNS által csökkent Thr-186 foszforiláció . Ennek megfelelően a Ca(2+) jelátviteli út kis molekulájú gátlása csökkentette a Thr-186 foszforilációt és gátolta a TAT által indukált HIV-1 transzkripciót, de nem a Tax által közvetített HTLV-1 transzkripciót . Mivel az adó által közvetített transzkripciót a P-TEFb vezérli, tovább kell vizsgálni, hogy miért csak a HIV-1 transzkripciót befolyásolta.
a CDK9 Thr-186 foszforilációt celluláris foszfatázokkal is szabályozhatjuk. Az elmúlt évtizedben végzett tanulmányaink a PP1-re összpontosítottak, amelyet kezdetben megfigyeltünk a Tat-függő HIV-1 transzkripció in vitro stimulálására . Amikor túlexpresszáltuk a PP1 egyik fő nukleáris szabályozó alegységét, a NIPP1-et (PP1 nukleáris inhibitora), megfigyeltük a HIV-1 transzkripció PP1-specifikus gátlását és a vírusreplikációt . Megfigyeltük, hogy a Tat olyan szekvenciát tartalmaz, amely hasonló a konzervált PP1-kötő RVxF motívumhoz, és kimutatta, hogy ez a motívum közvetíti a TAT kötődését a PP1-hez in vitro és in vivo, és hogy a PP1-kötő motívum (V36A és F38A) maradékainak mutációja megakadályozta a TAT-ot a HIV-1 transzkripció indukálásában . A (32P)ortofoszfáttal kezelt tenyésztett sejtekben foszforilált CDK9 – et in vitro hatékonyan depofoszforilálta PP1, de nem PP2A, szemben az in vitro autofoszforilált CDK9-tel, amelyet PP2A defoszforilált, nem pedig PP1 . Ezek az eredmények arra utaltak, hogy a PP1 szabályozhatja a CDK9 foszforilációját a HIV-1 transzkripció során. Kimutatták, hogy a PP1 alfa-katalitikus alegysége, a PP1a kooperatív módon és egymás után hat (Ca2+)-kalmodulin-fehérje foszfatáz 2b (PP2B) UV besugárzott vagy hexametilén-biszacetamid (HMBA) kezelt sejtekben, amelyekben a P-TEFb felszabadul a 7SK snRNP komplexből . Míg a PP2B konformációs változást indukál a 7sk snRNP-ben, a PP1a defoszforilálja a CDK9 Thr-186-ot, és megkönnyíti a P-TEFb felszabadulását a 7sk snRNP-ből . A CDK9 defoszforilált maradt, miközben a BRD4-hez kapcsolódott, és a preiniciációs komplexbe toborozták, ahol a TFIIH-asszociált CDK7 újraaktiválhatja. Ezzel a vizsgálattal összhangban megnövekedett CDK9 Thr-186 foszforilációt figyeltünk meg azokban a sejtekben, amelyek stabilan expresszáltak egy PP1-gátló peptidet, a nipp1 központi doménjét, valamint megfigyelték a CDK9/ciklin T1 fokozott asszociációját a 7sk RNS-sel . A cdNIPP1 stabil expressziója megzavarta a tat és a PP1 közötti kölcsönhatást , és gátolta a HIV-1 transzkripciót, ami arra utal, hogy egyensúlyt kell fenntartani a CDK9 Thr-186 foszforilációja és defoszforilezése között, és hogy ez az egyensúly a foszforiláció felé történő eltolása gátolja a HIV-1 transzkripciót. A cdNIPP1 fiziológiailag releváns módon történő expressziója a HIV-1 Genom részeként a NEF helyett erőteljesen gátolta a HIV-1 replikációt , ami arra utal, hogy a PP1-célzott inhibitorok felhasználhatók potenciális anti-HIV-1 terápiaként. Míg a PP1 jelölt a Thr-186 defoszforilezésre, azt is megállapítottuk, hogy defoszforilálja a CDK9 Ser-175-et (lásd alább). Egy további CDK9 Thr-186 foszfatázt, magnéziumfüggő protein foszfatáz 1A-t (korábban 2C) (PPM1A) azonosítottak foszfatáz expressziós könyvtár és Thr-186-foszfospecifikus antitestek segítségével . A PPM1A túlzott expressziója csökkentette a Thr-186 foszforilációját és az siRNS által közvetített kimerülést, és a P-TEFb és a PPM1A együtt is koprecipitálódott, ami arra utal, hogy a CDK9 fiziológiai szubsztrátja lehet A PPM1A-nak . Egy újabb tanulmány kimutatta, hogy a CDK9 Thr-186 foszforilációja csökkent a nyugalmi CD4(+) T-sejtekben, amelyek nem megengedőek a HIV-1 replikációra, és hogy ez a csökkenés korrelált a PPM1A bőségével és a CDK9 korlátozott toborzásával a nagy P-TEFb komplexbe . Ez a megállapítás tovább támasztja alá a HIV-1 transzkripció nagy komplexének szükségességét és a PPM1A kritikus szerepét a nyugalmi T-sejtek HIV-1 szuppressziójában. Mivel a PPM1A expresszió nem változott a T-sejtek aktiválásakor, még ismeretlen szabályozó tényezők is szerepet játszhatnak a PPM1A aktivitás szabályozásában.
4.4. A CDK9 T-hurokja Ser-175 foszforiláció
amint a CDK9/ciklin T1 disszociál a nagy P-TEFb komplexből, a CDK9 foszforilálódhat a Ser-175-en. Míg a Thr-186 defoszforiláció teljesen gátolta a CDK9/ciklin T1 kináz aktivitást, David Price és munkatársai nem találtak különbséget a CDK9 S175A és a CDK9 S175D mutánsok kináz aktivitásában . Ezzel szemben Qiang Zhou és csoportja kimutatta, hogy a CDK9 S175A mutáns inaktív, míg a CDK9 S175D mutáns kinázként aktív . Azt is kimutatták, hogy a Ser-175 foszforiláció elősegíti a CDK9/ciklin T1 kötődését a Brd4-hez . Azt javasolták, hogy a Ser-175 foszforilezése konformációs változást okozhat a CDK9-ben, lehetővé téve a BRD4-nek a T1 ciklinhez való kötődését . Nemrégiben végzett tanulmányunkban azt találtuk, hogy a PP1 dinamikus gátlása a CDK9 ser-175 kizárólagos foszforilációjához vezetett, amelyet a Hunter 2D peptid leképezés és az LC-MS analízis in vivo kombinációja határoz meg . A PP1 gátlása a CDK9 aktivitás gátlásához és az RNAPII foszforiláció csökkenéséhez vezetett in vitro és in vivo . Megállapítottuk, hogy a CDK9 S175A mutáns enzimatikusan aktív és indukálta a HIV-1 transzkripciót . Érdekes módon, míg a CDK9 S175D mutáns kevésbé volt aktív kinázként, könnyebben képződött kis P-TEFb komplex, különösen akkor, ha a PP1 gátolt volt. Így arra a következtetésre jutottunk, hogy a PP1 aktiválja a HIV-1 transzkripciót a CDK9 Ser-175 maradék defoszforilezésével. Azt is észrevettük, hogy a ser-175 foszforilációs aktivitás sokkal bőségesebb volt, mint a THR-186 aktivitás a sejtkivonatokban, ami arra utal, hogy a CDK9 aktivitás természetesen elnyomható a ser-175 túlfoszforilezésével. Jonathan Karn csoportjának nemrégiben végzett tanulmánya kimutatta, hogy a T-sejtek aktiválása a T-sejt receptor (TCR) vagy a phorbol-észter (PMA) révén jelzi a CDK9 ser-175 erősen indukált foszforilezését . A molekuláris modellezés alapján azt javasolták, hogy a foszforilált Ser-175 hidrogénkötést képez a Tat Lys-14-gyel, megerősítve a TAT kötődését a CDK9/ciklin T1-hez, és elősegítve a HIV-1 transzkripció aktiválását . A korai megfigyeléseknek megfelelően a CDK9 S175A mutációt is megállapították, hogy megszünteti a brd4-hez való kötődést . Megfigyeléseinkkel összhangban a CDK9 S175A mutáns nagymértékben indukálta A Tat-függő látens HIV-1 reaktivációt, amelyet Jonathan Karn és munkatársai annak tulajdonítottak, hogy ez a mutáns nem képes megkötni a BRD4-et, miközben képes kötődni a Tat-hoz . Azt is megállapították , hogy a ser-175-nél foszforilált CDK9 ki van zárva a 7SK RNP komplexből, ami párhuzamos korábbi megfigyelésünkkel, miszerint a CDK9 S175D foszfomimetikus mutáns kis P-TEFb komplexben található . Így ez a legújabb tanulmány rámutat a Ser-175-re, mint a HIV-1 reaktivációjának és a kis molekulájú terápiák potenciális fejlesztésének fontos célpontjára.
nemrégiben kifejlesztettünk PP1-célzott kis molekulákat, amelyeket úgy modelleztünk, hogy illeszkedjenek az RVXF-befogadó üreghez a PP1-en . Gyakorlatilag körülbelül 300 000 vegyületet szűrtünk, majd fizikailag körülbelül 1000 vegyületet szűrtünk, és azonosítottunk egy hit vegyületet, az 1H4-et, amely gátolta a HIV-1 transzkripciót és replikációt nem citotoxikus koncentrációban . Az 1H4 in vitro megakadályozta egy rvxf szekvenciát tartalmazó szubsztrát peptid PP1 által közvetített defoszforilációját, megzavarta a tenyésztett sejtekben a PP1 és a Tat kapcsolatát, és megakadályozta a PP1 transzlokációját a sejtmagba . Jelenleg a hit vegyület finomításán dolgozunk, valamint PP1-célzott vegyületeket fejlesztünk a látens provírus aktiválására.
4.5. A CDK9 Ser-90 foszforilációja
mi és mások korábban megmutattuk, hogy a HIV-1 transzkripciót a TAT aktiválja a G1 fázisban, de nem a G2 fázisban . Így feltételeztük, hogy a Tat bevonhat egy sejtciklus-szabályozó kinázt, amelyről megmutattuk, hogy CDK2/ciklin E . A HIV-1 gátolva van a CDK2 leütő sejtekben , valamint a makrofágok differenciálódásában az indukált pluripotens őssejtektől a CDK2 leütéssel, ami arra utal, hogy a CDK2 fontos a HIV-1 transzkripciójában és replikációjában. A cdk2 és a CDK9 közötti funkcionális kapcsolatot akkor találtuk meg, amikor a HIV-1 vaskelátorok általi gátlását elemeztük. A HIV-1 transzkripciót gátolták a 311-es és ICL670-es vaskeláterekkel kezelt T-sejtekben, ami szintén gátolta a CDK2 és CDK9 sejtaktivitását . A di-2-piridilketon tioszemikarbazon alapú tridentát vaskelátorok a HIV-1 transzkripciót és a vírus replikációját sokkal alacsonyabb koncentrációban gátolták, mint a 311 vagy az ILC670, valamint a CDK2 és CDK9 aktivitást is gátolták . Bár a CDK2 gátlás mechanizmusa még nem tisztázott, valószínűleg magában foglalja a P21 indukcióját a hipoxia által indukált 1-es faktor (HIF-1) felszabályozásán keresztül, mivel a vashiány eltávolítja a vasat a prolil-hidroxilázból, és növeli a HIF-1 és HIF-2 fehérje szintjét, ami utánozza a hypoxia hatását . In vitro elemeztük a CDK9 foszforilációját CDK2-vel, és azonosítottunk egy motívumot (90SPYNR94), amely konszenzusos CDK2 foszforilációs helyet képviselt, és amelyet hatékonyan foszforiláltunk . A CDK9 foszforilációját a ser-90-en foszfospecifikus antitestekkel detektálták, és a CDK2 leütése után csökkent. A CDK9 S90A mutáns asszociáció a nagy P-TEFb komplextel csökkent, túlzott expressziója gátolta a HIV-1 transzkripciót. Ezzel szemben a CDK9 S90D mutáns változatlan kapcsolatot mutatott nagy és kis P-TEFb komplexekkel és indukálta a TAT-függő HIV-1 transzkripciót. A foszfomimetikus S90 azonban a CDK9 expresszió általános csökkenését mutatta, ami arra utal, hogy a nagy és kis P-tefb komplexek kialakításához foszforilációs / defoszforilációs egyensúlyt kell fenntartani. A molekuláris modellezés azt mutatta, hogy a CDK9 Ser-90 egy oldószernek kitett rugalmas hurkon helyezkedik el, ami arra utal, hogy foszforilezésen megy keresztül (a 2.ábrán is látható). Így legújabb tanulmányaink egy új szabályozási foszforilációs helyet azonosítottak a CDK9 – en, amely célzott lehet a HIV-1 transzkripció aktiválására vagy gátlására.
5. Következtetés
a CDK9 specifikus helyeinek foszforilációja és defoszforilációja a transzkripciós folyamat során történik, és szigorúan ellenőrizni kell. Bizonyos treonin/szerin maradványok módosításai meghatározzák, hogy a CDK9 társul-e a nagy P-TEFb komplexhez, hogy elérhetővé váljon a toborzáshoz, és hogy a nagy komplex disszociációja hatékonyan megtörténik-e. A Thr-186 foszforilezése a CDK9 és a Ser-90 T-hurokjában, amely a T-hurokon kívül helyezkedik el, meghatározza, hogy a CDK9 az inaktív nagy komplexben marad-e, és azt is, hogy a kináz enzimatikusan aktív-e, ha disszociálódik a 7SK snRNP-től. A defoszforiláció ezen helyek bármelyikén a nagy komplex destabilizációjához vezet CDK9/ciklin T1 felszabadulása, ezáltal korlátozva a TAT toborzását a HIV-1 LTR-re. A CDK9 C-terminálisának módosításai lehetővé teszik a ciklin T1-et : a KÁTRÁNYKÖTÉS és a defoszforiláció ezeken a helyeken megakadályozza a toTAR RNS kötődését. Ezzel szemben a Thr-29 vagy Ser-175 maradékokban történő foszforilezés gátolja a CDK9-et. Így a cdk9 foszforilezéssel történő szabályozásának kialakuló képe összetettnek tűnik, részben párhuzamos azzal, amit más CDK-k ismertek. A nemrégiben azonosított CDK9-célzott kinázok, CDK7, CDK2 és foszfatázok, PP1 és PPM1A valószínűleg új célpontként jelennek meg a HIV-1 és a rák elleni terápiákban.
összeférhetetlenség
a szerzők kijelentik, hogy nincs összeférhetetlenség a cikk közzétételét illetően.
elismerések
ezt a projektet támogatta District of Columbia Developmental Center for AIDS Research (P30AI087714), Rcmi-NIH 2g12rr003048 a Research Centers in Minority Institutions (Rcmi) Program (Division of Research Infrastructure, National Center for Research Resources, NIH), orosz alapkutatási Alapítvány (no. 12-04-91444-NIZ) és az Orosz Oktatási és Tudományos Minisztérium (no. 2012-1.5-12-000-1001-030). A szerzők szeretnék megköszönni a Nekhai lab tagjainak a javaslatokat,és elnézést kérni azoktól, akiknek a munkáját helyhiány miatt nem idézték.
