eredmények és megbeszélések

az emlős rendszerekben a Cdc42 aktivitás fontosnak bizonyult a bőr ős – /progenitor sejtjeinek szőrtüszősejtekké történő differenciálódásának szabályozásában, a neuroepithelialis ős – / progenitor polaritás és az agyfélteke bifurkációjának szabályozásában, valamint a sejtszám és a növekedés szabályozásában a perinatális fejlődési időszakban (6-9). Érdekes, hogy a Cdc42 aktivitás vizsgálata WT felnőtt egerekben, különböző életkorokban azt mutatja, hogy az idősebb állatok relatív Cdc42-GTP szintje szignifikánsan magasabb, mint a fiatalabbaké a különböző szövetekben, beleértve a szívet, az agyat, a tüdőt, a májat, a csontvelőt, a lépet és a vesét (ábra. 1 A és az adatok nem jelennek meg), növelve annak lehetőségét, hogy a megnövekedett Cdc42 aktivitás részt vesz a normális öregedési folyamatban.

annak megállapításához, hogy a természetes öregedéssel járó megnövekedett Cdc42 aktivitás fiziológiai jelentőséggel bírhat-e, megvizsgáltuk a Cdc42 negatív szabályozót, Cdc42GAP, gén célzott egerekben, miután elérték a felnőttkort. A homozigóta Cdc42GAP knockout egerek korábbi tanulmányai a perinatális időszakban azt mutatták, hogy a különböző szövetek/sejtek emelkedett Cdc42-GTP − t tartalmaztak, és a cdc42gap − / – genotípus embriói / újszülött kölykei csökkent szerv/organizmus méretet mutattak, amelyek a megnövekedett spontán apoptózissal kapcsolatosak a különböző sejttípusokban (6). Felnőtt Cdc42GAP – / – egerekben a Cdc42 aktivitás konstitutívan magasabb volt több szövet / sejttípusban, mint a megfelelő WT egereknél, míg az RhoA-GTP vagy Rac1-GTP szintje hasonló maradt a WT-hez (ábra. 1b; adatok nem jelennek meg), ami arra utal, hogy a felnőtt állatokban a perinatális periódushoz hasonló specifikus cdc42-aktivitás figyelhető meg. A Cdc42GAP – / – egerek többsége az újszülött időszakban halt meg kisebb méretük és gyenge testalkatuk miatt (6). Azonban egy részük (7% – uk) túlélheti az újszülöttkori időszakot nevelőszülői gondozás alatt, független ápoló nők által. A postnatális időszakban a homozigóta egerekben a rendszeres tejbevitel, valamint a normál szérum glükóz-és inzulinkoncentráció ellenére a Cdc42GAP−/− egerek súlygyarapodása 3 hónapos korban lassulni kezdett a WT vagy heterozigóta egerek 5 hónapos életkorához képest, és az érett homozigóták testtömege 30% – kal csökkent az Általános cellularitás csökkenése miatt (ábra. 1 C és az adatok nem jelennek meg). A Cdc42GAP – / – egerek medián élettartama 12 hónap volt, míg a kontroll (WT vagy heterozigóta) egerek létfontosságúak maradtak a 27 hónapos átlagéletkorig (ábra. 1 D). A homozigóta egerek túlélési görbéje némileg eltér a tipikus Gompertz-görbétől, de hasonló a bubr1 (mitotikus ellenőrzőpont-szabályozó) knockout (10) vagy p44 (a p53 tumorszuppresszor rövid izoformája) transzgenikus (11) állatok. A Kyphosis és az életerő hiánya a Cdc42GAP – / – egerekben 12 hónapos korban nyilvánvalóvá vált (ábra. 1 E). A megnyúzott Cdc42GAP – / – egerek 15 hónapos korukban a testtömeg egyértelmű csökkenését, a bőr alatti zsírszövet jelentős csökkenését, súlyos lordokyphosist és izom atrófiát mutattak (az adatok nem szerepelnek). A röntgen vizsgálat szignifikáns kyphosis fenotípust és csökkent csont ásványi sűrűséget (BMD) mutatott a Cdc42GAP−/− egerekben 15 hónapos korban (ábra. 1 F). A Cdc42GAP – / – egerek boncolt csontjainak további számszerűsítése a BMD 3 -, illetve 2,6-szoros csökkenését mutatta a sípcsontban, illetve a combcsontban (SI ábra. 7). Ezenkívül mind a hím, mind a nőstény Cdc42GAP−/− egerek korábbi életkorban elvesztették a termékenységet a WT-hez képest. A Cdc42GAP−/− nőstények és a WT hímek közötti párzás során a homozigóták 26 hetes korban meddővé váltak, szemben a WT 48 hetesével (ábra. 1 G). Ezek a megfigyelések azt mutatják, hogy a Cdc42GAP hiány konstitutívan emelkedett Cdc42-GTP szintet, csökkent testméretet, korai kyphosist, csökkent BMD-t, rövidített termékenységi időszakot és csökkent élettartamot eredményez felnőtt egerekben.

a H& e festett szakaszok a 8 hónapos nőstény egér csigolyatestén keresztül azt mutatták, hogy a Cdc42GAP- / -egerek vékonyabb, meghajolt kéreggel és vékonyabb trabekulákkal rendelkeztek a WT egerekhez képest (ábra. 2 A). Hasonlóképpen, a homozigóta egerek combcsontjának hosszúsági szakaszai a kortikális csontvastagság csökkenését mutatták a WT egerekhez képest (az adatok nem jelennek meg). Ezek a megfigyelések összhangban vannak az osteoporosis bruttó megjelenésével és klinikai jellemzőivel. A felnőtt Cdc42GAP−/− egerek lépének, májának és veséjének tömege csökkent az Általános cellularitás csökkenése miatt, ami nyilvánvaló volt a lép h&e− foltos szakaszaiban, és a 12 hónapos Cdc42GAP−/-lép T és B sejtet tartalmazó fehér cellulóz régiói jelentősen csökkentek az életkornak megfelelő WT egerekhez képest (ábra. 2 B és az adatok nem jelennek meg), ami kifejezett limfoid atrófiára utal a homozigótákban. A szubdermális zsírszövet látszólagos csökkenésével összhangban a dorsalis bőr keresztmetszetének szövettani elemzése az s. C. zsírsejtek 9 hónapos Cdc42GAP – / – egerekben (ábra. 2 C). Az izomtömeg csökkenését és az izom atrófiát a H&e-festett vázizom szakaszok vizsgálata is megerősítette 12 hónapos Cdc42GAP-/-egerekből és az életkornak megfelelő WT egerekből (ábra. 2 C). A Cdc42GAP – / – egerek szintén jelentősen csökkentették a haj regenerálódását a hátsó haj borotválkozással történő eltávolítása után, míg az életkor és a nem megfelelő WT robusztus hajnövekedést mutatott (SI ábra. 8). A stressz tolerálásának képessége, például a sebgyógyulás, a Cdc42GAP-/− egerek öregedéssel összefüggő aktivitása (12) jelentősen csökkent a WT− hez képest (ábra. 2 D). A sebszakaszok hisztopatológiai elemzése kevés reepithelializációt mutatott a Cdc42GAP – / – egerek sebszélén, míg a WT egerek teljes reepithelializációja nyilvánvaló volt 4 nappal a seb bevezetése után (ábra. 2 E). Ezen megfigyelések mellett a homozigóta egerek számos hematopoietikus fenotípusa, beleértve a vérszegénységet, a csökkent lép-és csontvelő-cellularitást, a hematopoietikus őssejtek beültetésének hibáit a csontvelőbe, valamint a hematopoietikus őssejtek fokozott érzékenységét az indukált mobilizációra (13, 14) összhangban voltak a hematopoietikus rendszer korai öregedésével. Fontos, hogy a fiatal homozigóta egerek (<4 hónapos) vizsgálata a nyilvánvaló fenotípusok megnyilvánulása előtt nem mutatott nagyobb rendellenességeket a csontban, a bőrben és a lépben (SI ábra. 9 A és B és az adatok nem jelennek meg), ami arra utal, hogy a Cdc42GAP-/− egerek öregedésszerű fenotípusai nem korai fejlődési rendellenességnek tulajdoníthatók. Ezenkívül a homozigóta egerek számos fenotípusa, beleértve a csökkent kortikális csontvastagságot, a kyphosisot, az izomtömeg és az epidermális szövetek elvesztését, megtalálható a régi (>2,5 éves) WT egerekben (SI ábra. 9 C és D és az adatok nem jelennek meg). Amint azt az SI 1. táblázat összefoglalja, ezek az eredmények együttesen erős bizonyítékot szolgáltatnak arra, hogy a Cdc42GAP hiány idő előtti öregedésszerű fenotípusokat okoz az állatokban.

A 9 hónapos felnőttek szöveteinek festése, beleértve a májat, a vesét és a lépet, az öregedéshez társuló Alzheimer-galaktozidáz (SA-6-gal) esetében a homozigóta egerekben ez az öregedési marker erős aktivitását mutatta, amely nem volt kimutatható az életkorhoz és a nemhez illeszkedő WT egerek szöveteiben (ábra. 3 A és SI Fig. 10), jelezve, hogy a Cdc42GAP−/− felnőtt szövetek idő előtti öregedésen eshetnek át. Érdekes módon a perinatális időszakban megfigyelt homozigóta szövetek megnövekedett apoptózisa hiányzott a felnőtt homozigótákban, amikor a megemelkedett SA-6-gal aktivitás nyilvánvaló volt (ref. 6 és az adatok nem jelennek meg). Cdc42GAP – / – egér embrionális fibroblaszt (MEF) sejtek, amelyek 3-szor nagyobb cdc42-GTP-t tartalmaznak, de normál Rac1-GTP vagy RhoA-GTP tartalmat tartalmaznak a WT MEF-sejtekhez képest (6), szignifikánsan megnövekedett SA-6-gal aktivitást mutattak, és lapított és megnagyobbodott öregedő morfológiát halmoztak fel a 6.átjárástól kezdve, amikor a WT MEF-sejtek negatívak voltak az SA-6-gal aktivitás szempontjából, és morfológiájuk szerződéses volt (ábra. 3 B és SI Fig. 11). A Cdc42GAP−/ – MEF sejtek lassulni kezdtek a növekedésben az 5-7.szakaszokban, amikor az egyező WT MEF sejtek exponenciálisan növekedtek (ábra. 3 C) (6), és a 7.szakasz után masszív replikatív öregedésen mentek keresztül, míg a legtöbb WT MEF sejt nem érte el az öregedést a 13. szakaszig (SI ábra. 11 és az adatok nem jelennek meg). Ezenkívül a Cdc42GAP−/− MEF sejtek szignifikánsan nagyobb százaléka a 7.átjárónál nagyobb gócokat képezett a magban, mint a WT sejtek (SI ábra. 12). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a Cdc42GAP hiány korai Szövet / sejt öregedést indukál.

az emlősök korai öregedésének és a sejtek öregedésének egyik jól elismert tényezője a fokozott genomiális instabilitás (15). A metafázis terjedésének elemzése azt mutatta, hogy >30% primer splenocyták a 8 hónapos homozigóta egerekből aneuploidak voltak, míg az életkor és a nemhez illeszkedő WT splenocyták nem mutattak kimutatható aneuploidiát (ábra. 3 D), jelezve, hogy a Cdc42GAP−/− Szövet genomiális instabilitást szenvedett. E megállapítás alátámasztására a Cdc42GAP – / – MEF sejtek szignifikáns növekedést mutattak kettős magsejtek dapi festés alatt a WT sejtekhez képest a 7.átjárónál (SI ábra. 12). A MEF-sejtek későbbi szakaszainak kariotípus-elemzése (6-7. szakasz) azt is feltárta, hogy bár a WT− sejtek legtöbb kromoszómája (60%) sértetlen maradt, a Cdc42GAP−/ – sejtek 42% – a tartalmazott legalább egy kromoszóma-rendellenességet, 20% – uk két vagy több rendellenességet, 14% – uk pedig három vagy több rendellenességet tartalmazott (ábra. 3 E). Az aneuploidia százalékos aránya és mértéke szintén jelentősen emelkedett a Cdc42GAP−/ – MEF sejtekben, >a sejtek 32% – A mutatott abnormális kromoszómaszámot 72 és 102 között, míg a legtöbb WT sejt diploid volt (ábra. 3 E és SI Fig. 13). A kromoszóma károsodásának kariotípus-elemzése azt mutatja, hogy a homozigóta MEF sejtek aberrációi változatosak voltak, beleértve a kromatid törést, a korai testvér kromatid elválasztást (a hibás orsószerelési ellenőrző pont jellemzője), a transzlokációt, a kromoszóma töréseket, a dicentrikus kromoszómát és a kromoszóma fragmentációt (ábra. 3 F és SI 2. táblázat), ami arra utal, hogy a DNS károsodást javító gép veszélybe került a Cdc42GAP−/− sejtekben. A foszfo-H2 AX immunfluoreszcens festése a sejtmagban, egy DNS károsodási válasz marker (16), azt mutatja, hogy bár a 7 cdc42gap−/− MEF sejtek 10% – a pozitív volt a DNS károsodási marker szempontjából, <a WT sejtek 1% – a pozitív volt (ábra. 3 G). A cdc42gap-/− egerek öregedésszerű fenotípusainak kialakulása és progressziója, valamint a Cdc42GAP− / − sejtekben megfigyelt genomiális aberrációk mértéke és súlyossága közötti korreláció alátámasztja a Cdc42 szerepét a progeroid tulajdonságok kialakulásában.

a cdc42gap−/− sejtekben felhalmozódott DNS-károsodások lehetséges mechanizmusának meghatározásához összehasonlítottuk a homozigóta sejtek endogén reaktív oxigénfajainak (ros) szintjét a WT sejtekével, mivel a Rac1 és Rac2, két szorosan rokon Rho Gtpáz, a celluláris ros ismert szabályozói (17). SI Fig. A 14. ábra azt mutatja, hogy a Cdc42GAP – / – sejtek a WT sejtekhez hasonló ROS aktivitást mutattak, jelezve, hogy a Cdc42GAP endogén ROS-független mechanizmuson keresztül szabályozza a genomi stabilitást. Több Cdc42GAP−/− egér fenotípus hasonlósága miatt számos gén célzott DNS-károsodást javító molekula egérmodelljével, beleértve a Brca1 – /− p53+/−, Ku80−/−és Mtr−/− Wrn egérmodelleket (12, 18, 19), tovább vizsgáltuk a korai passzolt Cdc42GAP−/ – sejtek válaszkészségét a különböző DNS-károsító szerekre. A DNS-károsodásra adott válasz növekedési vizsgálatában a Cdc42GAP-hiányos sejtek a DNS-károsodást javító aktivitás széles hibáját mutatták (ábra. 4), amely a homozigóta sejtek között a sejthalál szignifikánsan magasabb százalékában nyilvánult meg a kezelés után a WT sejtekhez képest a H 2O2 dózisának növelésével, ionizáló besugárzás, camptotecin, metil-metán− szulfonát, vagy mitomicin C. így a cdc42gap−/ – sejtek későbbi szakaszaiban talált felhalmozódott különféle genomi rendellenességek legalább részben a károsodott DNS-károsodást javító tevékenységeknek tulajdoníthatók.

a sejtek tartós genomiális károsodásának következménye többszörös DNS-károsodás-válasz és / vagy öregedési gének indukálása (20, 21). A p53, p21Cip1, p16Ink4a és a foszfo-p53 (Ser-15) expressziója a Cdc42GAP−/− MEF sejtekben szignifikánsan magasabb volt, mint a WT MEF sejtekben hasonló passzusok után, míg a p19arf a homozigóta sejtekben hasonló növekedési tendenciát mutatott a passzusokkal, mint a WT sejtek (ábra. 5 A). A p53, p21Cip1, p16Ink4a, phospho-p53 (Ser-15) és a DNS károsodást jelző phospho-H2 AX fehérje szintje a Cdc42GAP−/− szövetekben 8 hónapos egerekből szintén szignifikánsan magasabb volt, mint az egyező WT egerek megfelelő szöveteiben (ábra. 5 B). Ezek az eredmények bizonyítják, hogy a p53-szabályozott útvonal, különösen a p21Cip1 és a p16Ink4a aktiválása összefügg a Cdc42GAP-hiány által kiváltott korai öregedéssel. Annak a kérdésnek a megvizsgálására, hogy a cdc42gap-hiányos sejtekben a megnövekedett Cdc42 aktivitás elegendő-e a korai öregedési fenotípus figyelembevételéhez, a cdc42 aktiváló mutánsát expresszáltuk, Cdc42F28L, primer WT MEF sejtekben, és megvizsgáltuk a sejtek SA-ons-Gal aktivitását összehasonlítva az egfp-expresszáló sejtek különböző szakaszokban való megfeleltetésével. A Cdc42F28L expresszió szignifikáns növekedést okozott az SA-6-gal-pozitív sejtpopulációban (35% a Cdc42F28L sejtekben, szemben az EGFP-expresszáló sejtek 7% – ával) a korai passaged MEF sejtekben (ábra. 5 C), jelezve, hogy a Cdc42 aktiváció elegendő a korai sejtöregedés indukálásához.

annak a lehetőségnek a további feltárására, hogy a Cdc42GAP−/− sejtek öregedési fenotípusát p53 hiba mentheti meg, Cdc42GAP+/−p53+ / − egereket hoztunk létre, és megpróbáltunk MEF sejteket készíteni a keresztezettből. A 44 embrió közül hat Cdc42GAP−/−p53+/− genotípusú volt, és egyetlen Cdc42GAP−/−p53−/− genotípus sem volt. A Cdc42GAP−/ – p53+ / – MEF sejtek a p53+/− és a WT sejtek közötti ütemben növekedtek, és a p53+/− vagy a WT sejtekéhez hasonló bazális szeneszcens populációt mutattak a 7. áthaladáskor, míg a p53 – / – és Cdc42GAP- / -MEF sejtek lineáris görbével és hajlítási populációs duplázási görbével szaporodtak, és hasonló passzusoknál szeneszcencia-rezisztensek és öregedésre hajlamosak voltak (ábra. 5 és E). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a Cdc42 aktiváció által kiváltott korai öregedés a p53-tól függ.

a sejtek és állatok korlátozott élettartama a különböző stresszekre adott replikatív öregedés következménye lehet, beleértve a DNS károsodását (22), a telomer eróziót (23), A ROS-t (24) és/vagy a nem megfelelően aktivált onkogéneket (25). A Cdc42GAP – / – egerek olyan gain-of-Cdc42 aktivitású állatmodellt mutatnak be, amely utánozza a mitogén jel által indukált Cdc42 aktivációt (6), és lehetővé teszi a Cdc42 aktiváció lehetséges hatásainak értékelését az állatok és a sejtek fiziológiájára. Kimutatjuk, hogy a Cdc42GAP hiány okozza a sejtek korai öregedését és az állatok korai öregedéshez hasonló fenotípusait. Különösen a Cdc42GAP gén célzása indukálja a Cdc42 aktivitás globális növekedését és elősegíti a sejtek genomiális instabilitását a csökkent DNS-károsodás-javító képességgel, ami viszont aktiválhatja a p53 és a p16 Ink4a-t, ami korai öregedéshez vezet (ábra. 5 F). Korábban azt találták, hogy a Cdc42 aktiválódik az öregedő sejtekben a morfológiai kiigazítás modulálására (26). Azt is javasolták, hogy részt vegyen a p53-szabályozott sejt morfológiai változásában, apoptózisában és proliferációjában (27-29), valamint a c-Jun N-terminális kináz-kontrollált apoptózisban (30, 31), olyan eseményekben, amelyek a sejtek öregedésével és az állatok öregedésével kapcsolatosak (32, 33). Megállapításaink, miszerint a Cdc42 aktiváció összefügg a természetes öregedéssel, és hogy a Cdc42GAP hiány DNS-károsodást okozó javítási hibát okoz, hogy a sejtek felhalmozódhassanak a korai öregedéshez vezető genomi rendellenességek, továbbá funkcionális kapcsolatot sugallnak a Cdc42 aktivitás és az emlősök öregedése között.

a p53 útvonal aktiválása vagy a DNS-károsodás helyreállításában vagy a genomiális stabilitás szabályozásában részt vevő gének megzavarása kimutatták, hogy korai öregedést indukál egerekben (11, 12, 33, 34). Összhangban a korábbi megfigyelésekkel, miszerint a Cdc42 nem vesz részt a sejt szuperoxid aktivitásának szabályozásában (17), Azt találtuk, hogy a cdc42gap−/− sejtekben felhalmozódott DNS-károsodás nem kapcsolódik a ROS aktivitáshoz, mivel a homozigóta sejtek nem mutatnak fokozott ROS aktivitást. A Cdc42GAP deléció a DNS károsodásjavító képesség jelentős csökkenését okozza széles spektrumban, beleértve a DNS térhálósító szerre és a kettős szálú törésinduktorra adott válaszokat, ami arra utal, hogy a Cdc42 hosszan tartó aktiválása tompíthatja a DNS károsodásjavító képességét. A Cdc42GAP−/− sejtekben található genomi károsodás sokfélesége szintén összhangban van egy globális DNS-károsodás-javítási hiba hatásával. A még megválaszolandó fontos kérdések közé tartozik, hogy milyen specifikus molekuláris determinánsok vesznek részt a Cdc42GAP által szabályozott DNS-károsodás helyreállításában, és mi az upstream jel(ek) okozza a megnövekedett Cdc42-GTP-t a normál öregedési folyamat során.