eredmények

A vékonybél Plazmacytoid dendritikus sejtjeinek jellemzése.

standard eljárásokat alkalmaztunk az epitheliumban (intraepithelialis, IE) és az LP-ben található immunsejtek izolálására a bélből. Mindkét sejtkészítményben a CD11c+B220+Ly6C+ sejtek különálló populációját találtuk, amelyek az összes sejt legfeljebb 1% – át tették ki. A pDC-vel ellentétben a myeloid (m)DC (CD11c+MHCII+CD3−B220−Ly6C−) csak nagyon alacsony számban volt jelen az IE készítményben (ábra. 1 A). Mind az LP, mind az IE készítmény pDC-je alacsony felületi MHC II osztályú expressziót mutatott (ábra. 1 A). További elemzés kimutatta, hogy mindkét készítmény CD11c+B220+Ly6C+ sejtjei egyenletesen expresszálják a pDC markereket PDCA1 valamint 120G8 (ábra. 1 B). Az IE készítmény válogatott pDC (CD11c+B220+Ly6C+) és myeloid DC (mDC) citospinjei a PDC kerek és sima, plazma sejtszerű morfológiáját mutatták, míg az mDC a jellegzetes dendriteket mutatta (ábra. 1 C). A PDC lokalizációjának további jellemzésére a bélben anti-B220-at, anti-120G8-at és anti-CD3 mAb-t alkalmaztunk immunhisztológiában. Mikrográf véletlenszerűen vett szakaszok, ábrán látható módon. 1 D, A 120g8+B220+CD3− sejtek elhelyezkedését a hámsejtekhez viszonyítva képelemzéssel határoztuk meg (elemzés; Olympus, Hamburg, Németország). A 650 pDC-sek elhelyezkedését értékelve azt figyeltük meg, hogy ezeknek a sejteknek 4,9% – A egyértelműen a hámsejtrétegen belül helyezkedik el, míg további 6,7% – uk a hámsejtek csúcspontjától számított 5-10 KB-os távolságon belül helyezkedik el (ábra. 1 D). Ezek az adatok azt mutatják, hogy a PDC bizonyos mennyisége a bél epitheliumán belül vagy annak közelében helyezkedik el, míg >a vizsgált sejtek 80% – a távolságon helyezkedett el >15 GmbH, ami LP sejtekké teszi őket (ábra. 1 D). Mivel a standard izolációs eljárásokat követően hasonló számú pDC volt jelen az IE és LP készítményben, jelenleg nem világos, hogy az LP pDC szennyezi-e az IE készítményt, vagy a hámhoz lokalizálódó pDC hatékonyabban izolálódik. Mivel az IE készítményen belül alig találunk mDC-t, az utóbbi lehetőséget részesítjük előnyben. Még meg kell határozni, hogy mindkét populáció különböző funkciókat tölt-e be, vagy egy közös sejtpopulációhoz tartozik-e. Mivel az IE készítmény pDC-je, ellentétben az LP készítmény pDC-jével, meglehetősen kíméletes eljárásokkal izolálható, ebben a vizsgálatban kizárólag az IE készítmény pDC-jét használtuk funkcionális vizsgálatokhoz.

Ccr9 expresszió a bél pDC-jén.

a PDC bélbe történő migrációját lehetővé tevő molekuláris mechanizmusok azonosítása érdekében elemeztük a homing molekulák expresszióját. Bár jól megalapozott, hogy az integrin ae (CD103) közvetíti a limfocita tapadását a bél hámsejtjeihez, nem sikerült azonosítani ennek az integrinnek az expresszióját a bél pDC-jén. Hasonlóképpen, CCR7 (ábra. 1 E), lényegében részt vesz a homing a limfociták a perifériás limfoid szervek nem expresszálódik PDC a bél. Ezzel szemben a CD18 magas szintjét (62-integrin) és a közepes szintet (4-7) figyeltük meg, míg a pDC 50%-a P-szelektin ligandumokat expresszál (Fig. 1 E). Érdekes, hogy a bél pDC túlnyomó többsége nagy mennyiségben fejezte ki a kemokin receptor CCR9-et (ábra. 1 E), míg az LP mDC-je no-t vagy alacsony CCR9-szintet fejezett ki .

A különböző limfoid szervekből izolált pDC Ccr9 expressziója.

figyelembe véve a ccr9 egységes expresszióját a bél pDC-jén, elemeztük a ccr9 expresszióját a másodlagos limfoid szervekből izolált pDC-N, beleértve a lépet, a bőrelvezető LN-t, a mesenterialis LN-t és a Peyer-tapaszokat (PP; ábra. 2 A) és használt CD4+CD8+ timociták, amelyekről ismert, hogy a ccr9 magas szintjét expresszálják pozitív kontrollként (11); ábra. 2 B). Érdekes, hogy ezeknek a szerveknek a pDC-nek csak egy töredéke expresszálta a CCR9-et (ábra. 2 A), míg a BM-ből izolált PDC 95% – a hordozta ezt a receptort (ábra. 2 C). A legtöbb BM pDC a CCR5-öt és a CXCR3-at is expresszálja, míg a CCR2 csak a sejtek körülbelül 25% – án van jelen. A CXCR4, amelyről ismert, hogy megtartja a sejteket a BM-hez, csak nagyon gyengén expresszálódik (ábra. 2 C). Ezek az adatok együttesen azt mutatják, hogy a pDC különféle kemokin receptorokkal van felszerelve, mielőtt felszabadulnának a BM-ből. Ez a funkció feltehetően lehetővé teszi, hogy ne csak a gyulladásos helyekre, hanem a nem gyulladt bélre is irányuljon.

az Flt3L-kiterjesztett pDC kemotaxis elemzése.

a CCR9 erős expressziója alapján a BM-en és a bél pDC-jén összehasonlítottuk a PDC és mDC migrációs kapacitását a kemokin CCL25/TECK felé, amely az egyetlen ismert ligandum erre a receptorra (12). A pDC gyakorisága az egér különböző törzsei között változik, és jól ismert, hogy például a C57BL/6 (B6) egerek sokkal kevesebb pDC-t hordoznak, mint a 129SV egerek (13). A genetikai háttértől függetlenül azonban az egér szöveteiből izolálható pDC száma nem elegendő a standard in vitro kemotaxis vizsgálatok elvégzéséhez. Ennek a korlátozásnak a leküzdése érdekében kibővítettük a DC populációt in vivo egy Flt3-L-szekretáló tumorsejtvonal (B16-FL) beültetésével B6 egerekben 14 napig (14).

ebben az időszakban a lépben jelen lévő CD11c+ sejtek százalékos aránya 3% – ról 30-35% – ra nőtt (az adatok nem jelennek meg). Az in vivo expandált pDC nyolcvan százaléka kifejezte a CCR9-et, a szintek nagyon hasonlóak a BM pDC-N (ábra. 2 C és Fig. 4 C) míg az in vivo expandált mDC csak kis mennyiségben fejezte ki ezt a receptort (SI ábra. 6B). A lép pDC-jét cd11c+ MACS-válogatással dúsítottuk, ami 95% – os tisztaságot eredményezett a CD11c+ sejtek esetében, amelyek 15% ly6c+B220+ pDC-t tartalmaztak. Az In vitro transzwellmigrációs vizsgálatok a pDC erős kemotaktikus válaszát mutatták ki a CCL25-re, valamint a CXCL9-re, a cxcr3 ligandumára és a CXCL12-re, amely a CXCR4 liganduma. Csak gyenge választ figyeltek meg a CCL19 felé, amely a ccr7 ligandumaként szolgál. mDC mutatott kis kemotaktikus válasz felé CCL25 és CXCL9 és mérsékelt válasz felé CXCL12 és CCL19 (ábra. 3 A).

a pDC számának csökkenése a Ccr9-hiányos egerek vékonybélében.

Ezen megfigyelések alapján jellemeztük a pDC eloszlását CCR9-hiányos egerekben. Hasonló százalékos pDC-t találtunk a tüdőben és a májban(SI ábra. 7), valamint az inguinalis és mesenterialis nyirokcsomókban, míg a lép pDC száma enyhén emelkedett a CCR9−/− egerekben. Ezzel szemben >a bél 90% – os csökkenését és a PP pDC 50% – os csökkenését figyeltük meg (ábra. 3 B).

A pDC elsősorban a vékonybélbe vándorol.

az eddig ismertetett eredmények alapján valószínűnek tűnt, hogy a pDC-nek CCR9-re van szüksége a vékonybélbe való bejutáshoz. Ennek a hipotézisnek a bizonyítására adoptívan átvittük a B6 és CCR9−/− donorok sejtjeit, amelyek Flt3-L-szekretáló tumort hordoztak 14 napig. Hatása alatt Flt3L pDC bővült hasonló mértékben a B6 és CCR9−/− egerek (ábra. 4 A és SI Fig. 8) és megkülönböztethetetlenek voltak a ccr2, CCR5 és CXCR3 expressziója tekintetében, míg a CCR9 csak a B6-ból származó pDC-n volt kimutatható, de nem ccr9-hiányos donorok (ábra. 4 C). További tisztítás nélkül ezeknek a donoroknak a splenocitáit 5(6)-karboxi-fluoreszcein-diacetát-N-szukcinimidil-észterrel (CFSE), illetve 5(6) – karboxi-tetrametil-rodamin-N-szukcinimidil-észterrel (TAMRA) jelöltük. A WT és CCR9-hiányos sejtek keverékét, úgy igazítva, hogy azonos számú pDC-t tartalmazzon, IV.átvitték a B6-recipiensekbe. 18 óra transzfer után először elemeztük az IE-ben jelen lévő örökbefogadóan átvitt WT sejtek összetételét, valamint az LP készítményt, és észrevettük, hogy az IE-ből kinyert összes sejt 54% – A, illetve 25% – a pDC volt (ábra. 4 B). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a különböző sejtpopulációk között a PDC-t a leghatékonyabban vitték haza a bélbe. Ezek a versenyképes transzferek azt is feltárták, hogy a CCR9-hiányos pDC nagymértékben károsodott a bélbe való otthoni képességükben, amit a ccr9-hiányos vs.WT pDC alacsony migrációs aránya tükröz az IE és az LP készítményben (ábra. 4 D). Ezzel szemben a ccr9-hiányos és a B6 pDC hasonló hatékonysággal vándorolt a perifériás és mesenterialis nyirokcsomókhoz (ábra. 4 D). A sejtjelölés jellege nem volt hatással ezekre a kísérletekre, mivel a színezékek B6 és CCR9−/− sejtek közötti cseréje azonos eredményeket hozott (az adatok nem szerepelnek). Bár ezek az adatok egyértelműen azt mutatják, hogy a pDC-nek ccr9-re van szüksége a bél hatékony elhelyezéséhez, meg kell említeni, hogy az FLT3-ligandummal kezelt egerekből származó pDC kereskedelmi tulajdonságai eltérhetnek a fiziológiás helyzetekben jelenlévőktől.

a PDC-t a gyulladt bélbe toborozzák.

mivel ismert, hogy a pDC fontos szerepet játszik a vírusellenes immunitásban (4, 10) feltételeztük, hogy a PDC gyulladásos folyamatok során toboroz a bélbe az első vonal védelmének megerősítése érdekében. A kolera toxinról (CT) ismert, hogy orálisan alkalmazva bélgyulladást vált ki, és beszámoltak arról, hogy az orális alkalmazást követő 2 órán belül a bélbe átmenetileg felvett mDC száma 4-szeresére nő (15). Megfigyeltük, hogy az mDC mellett a pDC-számok is 3-szorosára növekedtek, amikor B6 egereket etettek 10 GB CT-vel (ábra. 4 E). Érdekes, hogy az azonos kísérleti beállítás soha nem eredményezte a pDC növekedését sem az IE-ben, sem a CCR9-hiányos egerek LP előkészítésében 1, 2 vagy 3 óra CT-kezelés után (ábra. 4 E és az adatok nem jelennek meg). A ccr9 specifikus követelményét a PDC-re vonatkozóan a gyulladásos folyamatok során a bélbe történő toborzásukhoz a WT és a CCR9-hiányos pDC örökbefogadó transzferével igazolták CCR9-hiányos recipiensek, majd CT alkalmazása a fent leírtak szerint. Míg az IE és az LP készítményben az adoptívan átvitt WT pDC bőségesen jelen volt, a CCR9-hiányos pDC-t szinte teljesen kizárták ezekből a rekeszekből (ábra. 4 F). Ezek az eredmények együttesen azt mutatják, hogy a gyulladásos események során a PDC felvehető a bél nyálkahártyájába, és hogy ez a mechanizmus nagymértékben támaszkodik a CCR9-re.

a bél pDC szerepe az LP mieloid DC gyors mobilizálásában.

a közelmúltban kimutatták, hogy a tlr7/8 ligandum resikvimod (R848) orális alkalmazása az LP DC gyors mobilizációját eredményezi, és hogy a pDC által esetlegesen felszabaduló TNFa részt vesz ebben a folyamatban (16). Így azt feltételeztük, hogy a bél pDC lehet a TNFa forrása, amely potenciálisan kiváltja a szomszédos mDC mobilizálását. Ennek a hipotézisnek a teszteléséhez in vitro stimuláltuk az IE és LP készítmény B6 pDC-jét 16 órán keresztül R848-Mal. Valóban, a pDC jelentős mennyiségű TNFa-t szekretált, de nem tudott kimutatható mennyiségű IL-2-t előállítani, IL-4, IL-5, vagy IFNy (ábra. 5 A). Ezután elemeztük az LP mDC in vivo mobilizálását az r848 orális alkalmazása után. Míg a kezeletlen B6 és CCR9−/− egerek nem különböztek a bél mDC jelenlététől (ábra. 5 B), 2 órán belül az orális R848 indukálta az mDC 60%− ának mobilizálását a WT− ben, de csak 10,8% a CCR9 – / – egerekben. Fontos, hogy miután a CCR9-hiányos egerek i. v. megkapta az Flt3L-vel kezelt WT donorok léppdc-jét 16 órával az r848 orális alkalmazása előtt, ez a hiány a bél mDC mobilizálásában teljesen megmenthető (ábra. 5 C). Ezek a kísérletek azt mutatják, hogy a pDC ccr9-függő elhelyezése a bélbe részt vesz a bél mDC gyors mozgósításában a tlr7/8 ligandum orális alkalmazása után. Mivel a patkánymodellben mások is kimutatták, hogy az LPS alkalmazása az LP mDC (17) mobilizációját is indukálja, 50 db LPS IP-t alkalmaztunk WT és CCR9-hiányos állatokra. Érdekes, hogy ezekben a kísérleti körülmények között nem figyeltünk meg különbséget a WT és a CCR9-hiányos állatok között az LP mDC mozgósításában (SI ábra. 9).