absztrakt
feszültségfüggő L – típusú Cav1.2 kalciumcsatornák a membrán depolarizációt a citoplazmatikus szabad Ca2+ koncentráció átmeneti növekedéséhez kapcsolják, amely számos alapvető sejtfunkciót indít el, beleértve a szív-és érrendszeri izomösszehúzódást, a génexpressziót, a neuronális plaszticitást és az exocitózist. A kalciumáram inaktiválása vagy spontán megszüntetése a Cav1.2-en keresztül kritikus lépés ezen folyamatok szabályozásában. Ennek a folyamatnak a patofiziológiai jelentősége a magas vérnyomásban, a szívelégtelenségben, az aritmiában és számos más betegségben nyilvánul meg, ahol a kalciumáram bomlásának gyorsulása előnyös funkciót jelent. A tanulmány központi kérdése a Cav1.2 kalciumcsatorna inaktiválása, amelyet több determináns közvetít.
1. Bevezetés
a feszültségtől függő befelé irányuló Ca2+ áram () a citoplazmatikus szabad Ca2+ koncentráció átmeneti növekedésének közös mechanizmusa, amelyet a sejtek depolarizációja vált ki. A Ca2+ jelátvitel ezen formája aktiválja az alapvető sejtfolyamatokat, beleértve a szív összehúzódását , a simaizomtónus szabályozását , a génexpressziót, a szinaptikus plaszticitást és az exocitózist . A Ca2 + beáramlás teljes és gyors megszűnését a spontán kalciumcsatorna inaktiváció bonyolult mechanizmusa közvetíti, amely döntő fontosságú a Ca2+ sejt túlterhelésének megakadályozásában az akciós potenciálok során, valamint a nyugalmi sub-6m citoplazmatikus szabad Ca2+ koncentráció helyreállításában . Ez a tanulmány a cav1.2 kalciumcsatorna inaktiválásának molekuláris alapjára és több meghatározó tényezőjére összpontosít.
2. Cav1.2: kihívások és megoldások
2.1. Molekuláris komplexitás
A Cav1.2 kalciumcsatorna egy oligomer komplex, amely az A1C, a 6C és a három alegységből áll . Az ioncsatorna pórusát az A1C peptid (1.ábra) alkotja, amelyet a CACNA1C gén kódol. A kisegítő alegységek a csatorna funkcionális expressziójához és plazmamembrán (PM) célzásához elengedhetetlenek . Számos genomi izoformában léteznek, amelyeket négy CACNB gén (CACNB1–4) és három CACNA2D gén (CACNA2D1–3) generál. Mindhárom alegység alternatív splicing hatálya alá tartozik. A Cav1.2 molekuláris szerveződés összetettségét növelve a fő alegységek oligomerizálódnak . A genomiális variabilitás, az alternatív splicing és a hetero-oligomerizáció együttesen rengeteg Cav1.2 splice variánst generál, amelyek a sejtekben faj -, szövet-és fejlődésfüggő módon expresszálódnak, míg finom egyensúlyuk változása jelentős patofiziológiai következményekkel járhat .
2.2. Kihívások a gazdasejt kiválasztásában
A Cav1.2 természetesen előforduló sokfélesége bonyolítja a natív sejtekből nyert adatok értelmezését, nem beszélve az egycsatornás adatokról. Ez alapozza meg a Cav1.2 kutatás fontosságát rekombináns expressziós rendszerekben, ahol a csatorna molekuláris összetétele és alkotóelemeinek szerkezete előre meghatározott. Ez a kísérleti megközelítés azonban a megfelelő gazdasejt kiválasztásának fő problémájával szembesült.
a kalciumcsatornák legtöbb vizsgálatát HEK293 sejtek felhasználásával végezték. Ezek a sejtek nagy expressziós hatékonyságot biztosítanak rekombináns Ca2 + csatornák, de sajnos tartalmaznak endogén kalciumcsatornákat, amelyek Ca2+ áramokat mutatnak 3 pA/pF-ig . Így a HEK293 sejtek csak akkor teszik lehetővé a rekombináns Ca megfelelő vizsgálatát2 + csatornák csak akkor, ha az áram amplitúdója elég nagy ahhoz, hogy figyelmen kívül hagyja az endogén csatornák hozzájárulását. A Ca2+ csatornák funkcionális determinánsainak helyes értékelése azonban olyan gazdasejtek használatát igényli, amelyek teljesen mentesek az endogén Ca2+ csatorna alegységektől. A COS1 vagy COS7 sejtek jól megfelelnek ennek a követelménynek, mert nem generálnak érzékelhető kalciumáramot, nem tartalmaznak endogén Ca2+ csatorna alegységeket vagy prekurzoraikat, és nem mutatnak endogén Cav1.2 alegységek indukcióját a rekombináns expresszió hatására . A CAV1.2 csatornaáramok COS1 cellákban mért aktiválásának és inaktiválásának kinetikai paraméterei és feszültségfüggése összhangban van más expressziós rendszerekben kapott adatokkal . A COS cellák egyik fontos előnye a viszonylag lassú osztódási sebességük, amely lehetővé teszi a különböző méretű Cav1.2 csatornás alegységek expressziójának és összeszerelésének jobb ellenőrzését.
2.3. A fluoreszcens címkézés és mérés problémái
a GFP-szerű fluoroforok fúziója a rekombináns A1C N – és/vagy C-végéhez vagy az n-végéhez a 6C nem változtatja meg jelentősen az expresszált csatornák elektrofiziológiai tulajdonságait, lehetővé teszi fluoreszcens és FRET (fluoreszcens rezonancia energiaátvitel) mikroszkópia alkalmazását a Cav1.2 szubcelluláris eloszlásának és összeszerelésének tanulmányozására, valamint a csatorna molekuláris architektúrájának és dinamikájának bonyolult aspektusaira. A csatorna fő elektrofiziológiai jellemzői változatlanok maradnak, ha a disztális exonok által kódolt a1C C-terminális szekvenciát 46-50 (1.ábra, 1833-2138 maradékok az a1C,77-ben) ECFP váltja fel. Azonban az N – vagy/és C-végei által az EYFP-hez fuzionált a1C nagyon érzékeny a fotobleachingre, amely visszafordíthatatlanul inaktiválja azt. Ismert, mint fluorofor-támogatott fény inaktiválás (FALI), ez az érdekes tulajdonság korlátozza az akceptor fotobleaching alkalmazhatóságát a FRET méréséhez a Cav1.2-ben a csatorna funkcionális állapotának bizonytalansága miatt . A fluoroforok közötti korrigált FRET ratiometriai analízise azonban, amely az A1C és/vagy a 6C alegységek faraihoz fuzionált, tükrözi a csatorna reverzibilis állapotfüggő szerkezeti átrendeződését, amelyet a tapaszbilincs alatti transzmembránfeszültség változásai váltanak ki .
2.4. Rekombináns Cav1. 2: Mi szükséges a funkcionális kifejezéshez és hogyan jelenik meg?
a “vad típusú” rekombináns Cav1.2 tipikus tulajdonságait a 2(A) ábra szemlélteti a mindenütt jelenlévő humán A1C,77 izoform példájával (GenBank no. z34815). Amikor az EYFP-vel jelölt A1C-t csak COS1 sejtekben expresszáltuk, a fluoreszcens jelölésű csatornafehérje diffúz módon oszlott el a citoplazmában, és nem generált mérhető kalciumáramot (2(A) ábra, a panel). A PM és a citoplazma között az a1C eloszlásának kvantitatív elemzése(2.B) ábra) megerősítette, hogy az A1C nem céloz szignifikáns PM-t függetlenül a 6 (A és b) sávok jelenlététől. Kifejezés Cavß hiányában α2δ stimulált PM célzás a a1C, de a csatorna néma maradt (2. Ábra(A), c panel), kivéve, ha α2δ volt coexpressed (panel d). Így, β pedig α2δ alegységek elegendő a funkcionális csatorna; ezekben a kísérleti körülmények, alegységek β serkentik a PM célzás a csatorna komplex jelenlétében α2δ, megkönnyítik a feszültség kapuzási a Cav1.2 csatorna.
a 2(A) ábrán (d panel) látható csúcs kalciumáram alakja és megjelenése meglehetősen jellemző az 6-Modulált Cav1.2 esetében . Főbb jellemzői közé tartozik a viszonylag lassú bomlási sebesség és a depolarizáló impulzus végéig tartó tartós rész nagy része . Nyilvánvaló, hogy a hosszú távú akciós potenciálok során az ilyen tulajdonságok a sejt patogén kalcium túlterheléséhez vezethetnek, ha azt nem kiegyensúlyozzák robusztus kompenzációs mechanizmusok. Ez volt a Cav1 végső szerepe.2 a szívsejtek akciós potenciáljának időtartamának meghatározásakor, amely kiváltotta a kalciumcsatorna-blokkolók kutatását és fejlesztését, egy olyan gyógyszercsoport, amelynek mára milliárd dolláros piaca van. A Cav1.2-nek ez a szerepe serkenti a Cav1.2 inaktiváció molekuláris determinánsainak azonosításával kapcsolatos jelenlegi érdeklődést a specifikusabb és hatékonyabb gyógyszerek megtalálásának reményében.
2, 5. Végül, de nem utolsósorban szövődmény: Cav1.2 csoportosítás
egyetlen kamrai myocyta ~300 000 Cav1.2 csatornát tartalmaz, de a csatornáknak csak ~3% – a van nyitva a csúcson . A közhiedelemmel ellentétben a Cav1.2 csatornák nem oszlanak el egyenletesen a plazmamembránon. A natív neuronális és szívizomsejtekben nagy klasztereket alkotnak. A funkcionális rekombináns eyfpn-a1C/onc2a/onc2c csatornák hek293 sejtekben kifejezett egymolekulás képalkotása ~40 csatornából álló klasztereket mutatott ki, amelyek mozgékonyak voltak a plazmamembránban . Mind a fluoreszcencia korrelációs spektroszkópia, mind a fluoreszcencia visszanyerése fotobleaching kísérletek után a laterális diffúziós állandó nak, – nek 6m/s. a Cav1.2 klaszterek mobilitásának funkcionális jelentősége nem egyértelmű. Úgy gondolják, hogy a szívizomsejtekben az ilyen mobilitást más fehérjékkel, például ryanodin receptorokkal való kölcsönhatások korlátozhatják . A Cav1.2 klaszterek mérete és fajlagos sűrűségük a plazmamembránban az expresszált ons alegység típusától függ . A szomszédos A1C alegységek végpontjai közötti távolság 67-től 67-ig változik 6B neuronális / szív-6B-től 79-ig 63-ig ér-63-ig. A plazmamembránon a Cav1.2 klaszterek legnagyobb sűrűségét és a legkisebb klaszterméretet az 61B jelenlétében figyelték meg. A Cav1.2 klaszterek felépítését és tulajdonságait meghatározó molekuláris mechanizmusok megismerése fontos a Cav1.2 aktivitás és a Ca2+ jelátvitel indukált válaszai közötti kapcsolás patofiziológiájának jobb megértéséhez.
3. A Cav1.2 kalciumcsatorna feszültség – és Ca2+-függő inaktiválása
Cav1.2 kalciumcsatorna esetében két különböző mechanizmus szabályozza a Ca2+ áram inaktiválását. Az egyik mechanizmust Ca hajtja meg2 + ionok a plazmamembrán citoplazmatikus oldalán, míg a másik a transzmembrán feszültségétől függ. Kísérletileg a Ca2+ helyettesítése Ba2+ töltéshordozóként kiküszöböli a Ca2 + – függő inaktivációt (CDI), így a Ba2+-vezető kalciumcsatornák feszültségfüggő módon inaktiválódnak gyors (FI) és lassú (SI) mechanizmusokkal . Ez a három inaktivációs mechanizmus, A FI, SI és CDI, valamint ezek fő meghatározói a 3.ábrán láthatók.
3.1. Ca2 + – függő inaktiváció és kalmodulin-kötő domén a1C
a CDI-nek számos különböző meghatározója van, de csak 1997-ben szűkült le a CDI Ca2+-érzékelő helyét az A1C 80-42 exonok által kódolt 80 aminosav C-terminális szekvenciájának szakaszára (2.ábra), amelyet piros blokk jelölt a 3(A) ábrán (a panel). A természetben előforduló splice variáció ebben a régióban A1C, 86(3 (B) ábra) teljesen gátolta a CDI-t, mivel nyilvánvaló az áram lassulásának hiányából Ba-val2+ mint töltéshordozó (C panel, fekete nyom) összehasonlítva (piros nyom). A gátolt CDI másik jellemző tulajdonsága a feszültség aktuális méretfüggésének hiánya volt(3.ábra (B), D panel, nyitott szimbólumok), amely ellentétben áll a gyors inaktiválás időállandójának U alakú függőségével () a membránpotenciál a vad típusú Cav1.2-ben(lásd 3. ábra (A), D panel). Két különálló szekvenciát, az L-t és a K-t azonosítottak ebben a 80 aminosavas szakaszon belül, amelyek A1C,86-szerű mutációi a vad típusú A1C-ben ugyanazoknak a jellemző tulajdonságoknak felelnek meg , ami két szomszédos CDI-érzékelő létezésére utal. Az egyiket a K régióban calmodulin- (CaM-) kötő IQ motívumként vázolták fel, később pedig az IQ motívum CDI-vel való kapcsolatát, mint funkcionális Ca2+ – CaM kötőhelyet három független vizsgálatban igazolták a CA-hoz nem affinitású CaM mutánsok alkalmazásával2+. Ennek megfelelően az LA motívum a CDI-hez kapcsolódott, mint apo-CaM kötőhelyhez, amelyet a csatorna nyugalmi állapota ruházott fel. Egyetlen CaM molekula kötődik ehhez a Ca-Hoz2 + – függő CaM-kötő domén (CBD) a1C a csatorna fő Ca2+ érzékelője .
az A1c Splice variációja az A1C CBD régiójában,86 nem csak teljesen gátolja a CDI-t, hanem eltávolítja az SI-t is (3(B) ábra, C panel), és megfosztja a csatornát a differenciális érzékenységtől a 6-alegység modulációval szemben (3(B) ábra, e panel), annak ellenére, hogy a 3 (B) ábra továbbra is az A1C, 86-hoz kapcsolódik(3 (B) ábra, b panel). Ez azt jelzi, hogy a csatorna mindhárom tulajdonsága—a CDI, az SI, és a 6-alegység moduláció—összekapcsolódik .
3.2. Lassú inaktiválás
számos bizonyítékot mutattak be arról, hogy az S6 szegmensek disztális részére korlátozódó aminosavak az A1C-ben fontos szerepet játszanak az SI-ben . Ennek a régiónak a szisztematikus vizsgálata felvázolta a “lassú inaktiválás éves determinánsát” (ADSI), mint négy, erősen konzervált aminosavból álló struktúrát, amely négy transzmembrán szegmensből Áll6, amely a pórus citoplazmatikus végét alkotja(3.ábra (a), A panel). Egyidejű mutációjuk (s405i az IS6-ban, A752T az IIS6-ban, V1165T a IIIS6-ban és I1475T az IVS6-ban) létrehozza az A1C, IS-IV csatornát. Az A1C,IS-IV csatorna jelenlegi kinetikájának elemzése a gyorsan inaktiváló komponens (10 ms) óriási gyorsulását mutatta, amely a teljes (or ) amplitúdó körülbelül 50% – át teszi ki. Az A1C,IS-IV lassú feszültségfüggő inaktiválása teljesen gátolt, és a csatorna a depolarizáció időtartama alatt vezet. Cseréje Ca2 + Ba2+, mint a töltés hordozó (panel c) nem változott jelentősen ez a minta inaktiválás, míg az elemzés feszültségfüggőség az inaktiváló komponens keresztül a1C,IS-IV csatorna (panel d) megerősítette hiánya CDI. Az a1A helyettesítése az A1C,az is-IV csatornaáram inaktiválásán nem változtatott, ami arra utal, hogy a differenciál-alegység moduláció hiányzik, míg a Ko-immunprecipitációs analízis (B panel) közvetlen bizonyítékot szolgáltatott az A1C,az IS-IV és a ++ közötti összefüggésre.
a 3. ábrán bemutatott eredmények együttesen azt sugallják, hogy az ADSI, a CBD és a GmbH között keresztbeszélgetés van, amelyet a köztük lévő közvetlen kölcsönhatások és/vagy a pórus alapjául szolgáló polipeptidköteg összetevőinek specifikus konformációs hajtogatása támogat. Valójában mind a CBD-vel való kölcsönhatást, mind a funkcionális konformáció fontosságát közvetlenül igazolták a rekombináns Cav1.2-t expresszáló élő sejtekben.
3.3. Az A1C C-farok hajtogatásának szerepe
kvantitatív feszültségfüggő FRET mikroszkópia az élő cellában lévő patch bilinccsel kombinálva azt mutatta, hogy az a1C C-terminális farok alegység reverzibilis feszültségfüggő konformációs átrendeződéseknek van kitéve . Az a1C C-farok rögzítése a plazmamembrán belső szórólapjához az A1C (a1C -) C-terminálisához fuzionált pleckstrin homológia (PH) doménen keresztül megszüntette ezt a konformációs átrendeződést,és gátolta mind az SI-t, mind a CDI-t (4(A) ábra) az a1C, IS-IV esetében megfigyelthez nagyon hasonló módon (3(C) ábra). Ez az A1C karboxil terminális mobilitását korlátozó módosítás jelentős hatással volt a Ca-RA2+ jelátvitel. A Cav1.2 aktivitásához kapcsolódó CREB-függő transzkripciós aktivációt teljesen elnyomták annak ellenére, hogy a depolarizációra adott válaszként a “C-horgonyzott” csatorna robusztus volt. Az a1C C-tail felszabadulása a pip2 hidrolízis aktiválásával a foszfolipáz C aktiválásakor teljes mértékben helyreállítja ezeket a hiányos funkciókat, beleértve az SI – t, a CDI-t, valamint az hatékony kapcsolódását a CREB-függő transzkripcióhoz . Így az A1C C-terminális farok specifikus funkcionális hajtogatása döntő fontosságú az inaktiváláshoz. A jelátvitel szempontjából döntő fontosságú, mivel úgy tervezték, hogy a CBD-hez kapcsolódó cam-ben az áteresztő Ca2+ – ot ketrecbe helyezze, és hatékonyan mozgassa ezt a ketrecbe zárt Ca2+ – ot a CREB-függő transzkripcióval vagy a szívizom összehúzódásával összefüggő downstream jelátviteli célpontokba . Mindenekelőtt ez a funkció szoros együttműködésben zajlik a csatornát aktiváló extracelluláris ingerekkel. A jelátvitel szempontjából az SI egy zár a csatorna belsejében, amelyet az áteresztő Ca szabadít fel2+ hogy felgyorsítsa annak lezárását és elindítsa a C-terminál farok mozgását .
3.4. Az a1C N-terminális szerepe
az összes fent említett funkció az a1C N-terminális integritásától is függ. A rekombináns A1C / 6C / 2CC csatorna inaktiválási tulajdonságait nem változtatják meg nagymértékben az a1C n-farok proximális részének szerkezeti változásai, például egy fluoreszcens fehérje fúziója , PH-domén vagy az 1/1a exonok alternatív splicingje, amely az a1C hosszú izoformáját hozza létre . Az a1C N-terminális részleges deléciójának hatásának legelső funkcionális elemzése azt mutatta, hogy részt vesz az inaktiválásban, míg az OHC megakadályozza a csatorna gátlását az N-farok által. FRET mikroszkóppal kombinálva tapaszbilincs, azt találtuk, hogy az inaktiváció az A1C és a 6a NH2 végpontok erős kölcsönös átirányítását okozza, de távolságuk a plazmamembránhoz képest nem változik észrevehetően . Ezt a relatív mobilitási hiányt az adja KB oly módon, hogy megkönnyítse a csatorna válaszát a feszültség kapuzására. Az A1C N-terminális farok alegységnek a csatorna szabályozásától való leválasztására irányuló kísérleteket végeztük el, ha nem történt meg. Az A1c N-farok rögzítése a plazmamembrán belső szórólapjában a csatolt PH-doménen keresztül olyan körülményeket teremtett, amikor a PHN-A1C és a 6 (2) bekezdés elegendő volt egy erős befelé irányuló áram létrehozásához(4 (B) ábra). Ez a csatorna azonban meg van fosztva a CDI-től és minden feszültségfüggő inaktiválástól. Valójában sem a Ba2+, sem a Ca2+ áram nem mutatott észrevehető bomlást (lásd átfedő nyomok). Az A1C N-farok felszabadulása a PIP2 hidrolízis során a foszfolipáz C aktiválásával teljesen gátolta az a-hiányos csatornát . Hasonló tulajdonságokat figyeltek meg, kivéve az áram sokkal lassabb aktiválódását, az A1C teljes (de 4 aminosav) N-terminális farkának delécióján (4(C) ábra). Az a1C N-terminális farok bármelyik típusú leválasztásával—akár delécióval, akár PM rögzítéssel-úgy tűnik, hogy az egész cellás áram aktiválásának késése összefügg az első késleltetés meghosszabbításával. Az egycsatornás felvételekből kiderült, hogy az N-farok deléciója lényegében stabilizálta az a nyitott állapot nak,-nek adapt-A1C/adapt-2-csatorna, amely hosszabb nyílásokat mutatott a hosszan tartó depolarizáció során .
így a CDI-t az a1C C – farok CBD determinánsai, a citoplazmatikus pórus régióban lévő ADSI, valamint az a1C C-és N-végek hajtogatása közvetíti. A kalmodulin integrálja ezeket a determinánsokat, biztosítva a Ca2 + – függő kapcsolót, amely megszünteti a lassú inaktivációt, felszabadítja az a1C C-farokot, és átadja a kapcsolódó Ca2+/kalmodulint, amely a Ca2+ jelátvitel aktiváló stimulusaként működik .
3, 5. Kifejezés, Inaktiválását Cav1.2 Hiányában a β pedig α2δ
a β pedig α2δ alegységek alapvető, a funkcionális kifejezés a Cav1.2 csatorna? Az elemzés a hatását exogén CaM (CaMex) a kifejezés, tulajdonságai Cav1.2 hiányában vagy β vagy α2δ egyértelműen azt mutatták, hogy sem a β sem α2δ elengedhetetlen. A CaMex túlexpressziója csak kis mértékben változtatja meg az a1C / 6C / 2D / 2C csatorna feszültség-kapuzását azáltal, hogy az aktiválás és inaktiválás feszültségfüggését több negatív potenciál felé tolja el, megkönnyítve (de nem gyorsítva) az inaktiválást, és növelve a sűrűséget körülbelül 2-szeresére . A CDI megmarad, amint az a Ca2+ Ba2+ mint töltéshordozó helyettesítésének hatásából is kitűnik, amely jelentősen megnövelte az áram inaktiválásának időbeli menetét(5 (A) ábra). Új megértése, a szerepek, β pedig α2δ jön az a megállapítás, hogy CaMex teszi kifejezés, illetve tevékenység a a1C csatorna hiányában β (5. Ábra(B)), vagy α2δ (5. Ábra(C)), de nem mindkét kiegészítő alegységek. Bár a CaMex szerkezetileg nem kapcsolódik a (Z) 6.és a (Z) 2. fejezethez, támogatja az emberkereskedelmet, A (Z) CDI-t és a (Z) csatornakapuzást. A kvantitatív elemzés azt mutatta, hogy a CaMex nem stimulálta az A1C újraelosztását PM-ben a citoplazmában, de jelentősen javította a plazmamembrán célzását az a1C / 62 csatornák. Másrészt a CaMex nem javította a plazmamembránon a citoplazmában az A1C/ ++ 2D és az a1C/2D/ca2d csatornák relatív eloszlását. Így a jelen lévő kiegészítő alegységtől függően az a1C/62D és az a1C/2 2D camex által támogatott csatornaaktivitása különböző mechanizmusok irányítása alatt áll. Ennek ellenére a CaMex-megkönnyített, egy-segéd-alegység csatornák meglehetősen hasonló tulajdonságokkal rendelkeznek, beleértve a kalciumáram lényegesen lassabb inaktivációs kinetikáját, valamint az aktiválás és az inaktiválás feszültségfüggőségének erős elmozdulását a negatívabb potenciál felé. Hasonlóan a hagyományos A1C / 6D / 2D csatornákhoz, ezek a csatornák megtartják a CDI-t és nagy érzékenységet mutatnak a dihidropiridin kalciumcsatorna-blokkolókkal szemben . Azonban csak az a1C / KB / camex csatorna mutatja a kalciumáram elősegítését erős depolarizációs prepulzussal (az adatok nem jelennek meg).
mivel a CBD-vel társított CaM részt vesz a CDI-ben, egyértelmű, hogy a CaMex hatását különböző CaM-kötő helyek közvetítik. Az ilyen hely egyik potenciális jelöltje az a1C N-terminális farok disztális részében van jelen . Még nem látni kell, hogy ez a hely valóban integráló szerepet játszik-e a Cav1.2 inaktivációt támogató több molekuláris determináns szabályozási kötegében. Egy másik lehetőség a CaMex szerepét a silent Cav1 aktiválására korlátozza.2 a nagy klasztereken belül, ahol a CaM korlátozott helyi elérhetősége lehet az oka a 2.5.szakaszban leírt alacsony frakcionált aktivitásnak. Bármi legyen is a Cav1.2 cam általi szabályozásával kapcsolatos mechanizmus, úgy tűnik, hogy kevés gyakorlati következménye van az orvostudományban való felhasználásra, pontosan azért, mert a CaM mindenütt jelen van és multifunkcionális peptid, amely számos más sejtfunkciót szabályoz, míg jelenléte a Cav1.2-ben létfontosságú a CDI számára.
4. a cav1 alegység modulációja.2
figyelemre méltó molekuláris variabilitás a Ca2 + helytelen kezelésével összefüggő betegségek kezelésében a differenciálisan Modulált Cav1.2 megváltozott inaktivációs tulajdonságaiban tükröződik. Számos közelmúltbeli megfigyelés alapot nyújt egy ilyen optimista nézethez. Először is, a homo – és hetero-oligomerek kialakulására való hajlamot a különböző biokémiai technikák közvetlenül bizonyították mind a natív sejtekben, mind a rekombináns expressziós rendszerben. Míg a homogén homooligomerizáció megnövekedése jelentősen növeli a sűrűséget , a heterooligomerizációja a heterooligomerizációja a variánsoknak és a többi osztóváltozatnak megváltoztathatja a Cav1.2 feszültségfüggőségét és inaktivációs kinetikáját is . Az oligomerizációt több molekuláris determináns közvetíti, ezért több beavatkozásra van szükség, például a kórokozó túlexpressziója esetén. 2. Úgy tűnik azonban, hogy megvalósíthatóbb magát a xhamster2-t megcélozni; a lassú és hiányos inaktiváció molekuláris determinánsát (lásd a 2(A) ábra, d panel) azonosították a 40-aminosav C-terminális determinánsként (a2ced), amely mind a 7 ismert, természetesen előforduló addicionális variánsban jelen van. Ca2 + -és CaM-független kölcsönhatásának a CBD-vel való leválasztása(3.ábra (a), A panel) helyreállítja az inaktivációs tulajdonságokat , amelyek jellemzőek a 6b/3 Modulált Cav1.2-re, amely gyors és teljes inaktivációt mutat, amint azt a deléciós kísérletekben kimutatták. Véleményem szerint az ilyen szelektív leválasztás a CBD-ből a CBD receptorához való kötődésről egy új vonzó stratégia a Ca2 + túlterhelés kezelésére, mivel a többi CA alegységet ez nem érinti. Ezenkívül a Cav1.2 és a legközelebbi cél Ca2+/CaM-függő protein-kináz II közötti keresztbeszélgetés megmarad.
5. Következtetések
Ez a tanulmány kimutatta, hogy tudjuk, hogyan lehet felgyorsítani a Cav1.2 inaktiválását kevesebb, mint 10 ms-ra (3(C) Ábra), hogy teljesen megfosztjuk az inaktivációtól (4(B) és 4(C) ábra), vagy hogy megszüntessük a kifejeződésének függését a 6.vagy a 2. évtől anélkül, hogy az inaktivációra jelentős következményekkel járna. Felvázoltuk az A1C termini és CaM végső szerepét az inaktiválásban, de ezek a tanulmányok egyike sem hozott közelebb a Cav1-hez kapcsolódó kalcium helytelen kezelésének végső céljához.2. kivéve a régi és sajnos nem túl szelektív kalciumcsatorna-blokkolókat. Az egyetlen új megvalósítható cél a Cav1.2 patogén 6C modulációja, ahol effektor-receptor kölcsönhatás jön létre.
a molekuláris biológia szempontjából a Cav1.2 minden bizonnyal a legbonyolultabb szabályozási rendszerek közé tartozik. A Cav1 mindegyikének figyelemre méltó molekuláris sokfélesége.2 az összetevők a csatorna több genetikai / splice variánsát idézik elő, amelyek nagy és változatos klaszterekre vannak felosztva, és folyamatos funkcionális változásnak vannak kitéve a homo – és hetero-oligomerizációval, valamint más jelátviteli komponensekkel, nem beszélve a fajokról, a szövetekről és a fejlődési változékonyságról. Meglepődünk a többszörös Cav1.2 izoformák tulajdonságainak redundanciáján, és még inkább meglepődünk, amikor néhányuk, amely csak “hagyományos” elektrofiziológiai tulajdonságokat mutat, kiderül, hogy egy betegséggel jár . A magyarázat keresésekor nem szabad intuitív módon csak a kalciumáram jellemzőire összpontosítanunk-feszültségfüggőség, amplitúdó és időtartam. A végválasz , mint például a specifikus Cav1.2 izoformához kapcsolódó CREB jelátviteli események térbeli és időbeli szervezése, valamint a más (pl. cAMP-függő) jelátviteli mechanizmusokkal vagy más jelen lévő Cav1.2 izoformákkal való verseny, új ötleteket adhat és új határokat nyithat az egyes Cav1.2 splice variánsok normál és beteg sejtekben és szövetekben betöltött szerepének vizsgálatához.
Abbreviations
| ADSI: | Annual determinant of slow inactivation |
| CaM: | Calmodulin |
| CBD: | Calmodulin-binding domain |
| CDI: | Ca-dependent inactivation |
| ECFP: | Enhanced cyan fluorescent protein |
| EYFP: | Enhanced yellow fluorescent protein |
| FALI: | Fluorophore-assisted light inactivation |
| FI: | Fast inactivation |
| FRET: | Fluorescent resonance energy transfer |
| GFP: | Green fluorescent protein |
| SI: | Slow voltage-dependent inactivation. |
