a candidosis típusától függetlenül a Candida fajok azon képessége, hogy fennmaradjanak az egészséges egyének nyálkahártya felületén, fontos tényező, amely hozzájárul annak virulenciájához. Ez különösen fontos a szájüregben, ahol a szervezetnek ellen kell állnia a nyelőcső felé irányuló viszonylag állandó nyáláramlás mechanikus mosási hatásának .

a Candida egyetlen domináns virulencia faktorát sem ismerik fel, bár számos tényező érintett a fertőzési folyamat elősegítésében. Ezek közé tartoznak a Candida orális felületekhez való tapadásában szerepet játszó tulajdonságok (pl. relatív sejtfelszíni hidrofóbitás és specifikus adhesin molekulák jelenléte), a gazdaszervezet immunvédelmi mechanizmusainak ellenállóképessége (pl. magas frekvenciájú fenotípusos váltás és morfológiai átmenet), valamint a hidrolitikus enzimek felszabadulása (pl., szekretált aszpartil-proteinázok és foszfolipázok), amelyek károsíthatják a gazdasejteket .

3. Orális Candidosis

Samaranayake olyan osztályozást javasolt, amelyben az orális candidosis elváltozásokat két fő csoportra osztották: I. csoport, vagy primer orális candidózisok, amelyek a szájüregben lokalizált elváltozásokra korlátozódnak, bőr vagy más nyálkahártya bevonása nélkül; II.csoport vagy másodlagos orális candidózisok, ahol a léziók a szájon át, valamint az extraorális helyeken, például a bőrön vannak jelen (3. táblázat). Az I. csoportba tartozó elváltozások a klasszikus triádból állnak-pseudomembranosus, erythemás és hiperplasztikus változatok—, és egyesek az utóbbiak további felosztását javasolták plakkszerű és nodularis típusokra .

4. Az orális Candidosis diagnózisa

az orális candidosis diagnózisa gyakran a klinikai megjelenési jellemzők jellegére alapozható, bár lehetőség szerint mikrobiológiai mintákat kell venni annak érdekében, hogy azonosítani és számszerűsíteni lehessen az esetlegesen jelen lévő Candida-t, és izolátumokat biztosítsanak a gombaellenes érzékenység vizsgálatához.

5. Izolálási módszerek

a Candida szájüregben történő izolálására rendelkezésre álló technikák közé tartozik a kenet, a sima tampon , a lenyomatkultúra , a teljes nyál összegyűjtése , a koncentrált szájöblítés és a nyálkahártya biopszia. Mindegyik módszernek különleges előnyei és hátrányai vannak, és a mintavételi technika megválasztását elsősorban a vizsgálandó elváltozás jellege határozza meg (4.táblázat). Ahol egy hozzáférhető és meghatározott elváltozás nyilvánvaló, gyakran előnyben részesítik a közvetlen mintavételi megközelítést, például tampon vagy lenyomat használatát, mivel ez információt nyújt a lézióban jelen lévő organizmusokról. Azokban az esetekben, amikor nincsenek nyilvánvaló elváltozások, vagy olyan esetekben, amikor az elváltozás nehezen hozzáférhető, elfogadhatóbb a nyálminták tenyésztésén vagy az orális öblítésen alapuló közvetett minta.

a gombaterhelés kvantitatív becslését lenyomatokkal, koncentrált szájöblítéssel és szájöblítés tenyésztésével lehet elvégezni, hogy megkülönböztessük a kommensális hordozást és az orális Candida patogén létezését, az utóbbiban nagyobb terhelés valószínűnek tekinthető .

6. Közvetlen mikroszkópos

a Candida fajok morfológiai jellemzőit (5.táblázat) meg kell vizsgálni az azonosításhoz. A kenet értékes az élesztő és a kötőjel formák megkülönböztetésében, de kevésbé érzékeny, mint a kulturális módszerek . A minta kálium-hidroxid (KOH) előállítása nem pigmentált septát hifákat tár fel jellegzetes dichotóm elágazással (körülbelül 45 MHz-es szögben) . A KOH-Calcofluor fluoreszcens folt módszer gombás jellemzők, mint a hifák, élesztősejtek, és más gombás elemek fluoreszkálnak .

a lézió helyéről vett kenetet mikroszkóp tárgylemezekre rögzítik, majd vagy a gram-folttal, vagy a periodikus acid Schiff (PAS) technikával festik. Ezekkel a módszerekkel a kandidális hifák és élesztők Sötétkék (Gram-folt) vagy piros/lila (PAS) jelennek meg .

krónikus hiperplasztikus candidosis esetén a lézió biopsziája szükséges a behatoló Candida későbbi kimutatásához szövettani festéssel, akár a PAS, akár a Gomori methenamin ezüst foltok felhasználásával. A gombaelemek bemutatása a szövetekben történik, mivel ezek a foltok mélyen festik őket. A blastospórák és hifák vagy pszeudohiphae jelenléte lehetővé teheti a kórszövettani szakember számára, hogy a gombát Candida fajként azonosítsa, és más kórszövettani jellemzők jelenléte miatt krónikus hyperplasticus candidosis diagnózisát állapítsa meg .

7. Laboratóriumi tenyésztés

7.1. Tampon

a lézió helyének tamponja viszonylag egyszerű módszer a növekedés kimutatására, és a Candida szemikvantitatívan becsülhető meg. A mintavételi megközelítés magában foglalja egy steril vattacsomó gyengéd dörzsölését a léziós szövet felett, majd ezt követően egy primer izolációs közeg, például Sabouraud dextróz-agar (SDA) beoltását .

7.2. Koncentrált orális öblítés

az orális öblítési technika során a beteg 10 mL steril foszfátpufferelt sóoldatot (0,01 M, pH 7,2) tart a szájban 1 percig. Az oldatot ezután centrifugálással (10-szeresére) töményítjük, és ismert térfogatot, általában 50 ml-t, spirális galvanizáló rendszer alkalmazásával agar táptalajon beoltjuk. 24-48 órás inkubálás után 37 CAC-on a növekedést a kolóniák felsorolásával értékeljük, és az öblítés milliliterenkénti kandidális kolóniaképző egységeként (cfu mL−1) fejezzük ki .

7.3. Impresszum tenyésztés

az Impresszum módszer egy ismert méretű (jellemzően 2,5 cm2) steril habpárnát használ, amelyet előzőleg közvetlenül a használat előtt megfelelő folyékony közegbe, például Sabouraud húslevesébe mártottak. A betétet ezután a célhelyre (nyálkahártya vagy intraorális protézis) helyezzük 30 másodpercig, majd tenyésztés céljából agarba helyezzük .

8. Táptalaj

a Candida leggyakrabban használt primer izolációs közege az SDA, amely bár lehetővé teszi a Candida növekedését, alacsony pH-ja miatt elnyomja számos orális baktériumfaj növekedését. az antibiotikumok beépítése az SDA-ba tovább növeli szelektivitását . Az SDA-t általában aerob módon inkubálják 37 Kb 24-48 órán keresztül. A Candida krémszínű, sima, pépes konvex kolóniákként fejlődik ki az SDA-n, és a fajok közötti megkülönböztetés ritkán lehetséges . Becslések szerint egynél több Candida faj fordul elő az orális minták körülbelül 10% – ában, és az utóbbi években egyre fontosabbá vált a nonalbicans Fajok kimutatásának képessége .

az elmúlt években más differenciális táptalajokat fejlesztettek ki, amelyek lehetővé teszik bizonyos Candida fajok azonosítását a kolónia megjelenése és színe alapján az elsődleges tenyészetet követően. Az ilyen táptalajok előnye, hogy egyetlen fertőzésben több Candida faj jelenléte meghatározható, ami fontos lehet a későbbi kezelési lehetőségek kiválasztásában . Ilyen például a Pagano-Levin agar vagy a kereskedelemben kapható kromogén agarok, nevezetesen a CHROMagar Candida, az Albicans ID, A Fluroplate vagy a Candichrom albicans .

a Pagano-Levin agar megkülönbözteti a Candida fajokat a trifenil-tetrazolium-klorid redukciója alapján. A táptalaj halvány színű kolóniákat hoz létre C. albicans, míg más Candida fajok kolóniái különböző fokú rózsaszínű színt mutatnak. A Pagano-Levin agar hasonló érzékenységgel rendelkezik az SDA-val szemben, de jobb a mintában egynél több faj kimutatására , a CHROMagar Candida azonosítja a C. albicans, C. a tropicalis és a C. krusei a kolónia színe és megjelenése alapján , míg az Albicans ID és a Fluroplate hasznosnak bizonyult a C. albicans feltételezett azonosításában . Az azonosítás specifikussága a CHROMagar Candida esetében 95%, az Albicans ID és a Fluroplate agarok esetében pedig 98,6%. A CHROMagar Candida elsődleges izolációs agar-ként történő alkalmazását olyan megközelítésként említik, amely lehetővé teszi az újonnan leírt megkülönböztetést C. dubliniensis tól től C. albicans. A CHROMagar Candida-N A C. dubliniensis állítólag sötétebb zöld kolóniákként fejlődik ki, mint a C. albicans . Úgy tűnik azonban, hogy a CHROMagar használatával e két faj közötti megkülönböztetés csökken a szubkultúrában és az izolátumok tárolásában. A C. dubliniensis nem képes agar táptalajon növekedni 45cc inkubációs hőmérsékleten a közelmúltban alternatív tesztként javasolták e két faj megkülönböztetését .

9. Candida fajok azonosítása

az élesztők elsődleges táptalajon alapuló azonosítása különféle kiegészítő vizsgálatokkal igazolható, amelyek hagyományosan az izolátumok morfológiai (5.táblázat) és fiziológiai jellemzőin alapulnak.

9.1. Morfológiai kritériumok

a csíra-cső teszt a standard laboratóriumi módszer a C. albicans azonosítására. A teszt magában foglalja a hyphal kinövések (csíracsövek) indukcióját, amikor a ló szérumában szubkultúrázzák 37cc-n 2-4 órán keresztül. A C. albicans izolátumok körülbelül 95% – a csíracsöveket termel, ami a C. stellatoidea és a C. dubliniensis közös tulajdonsága .

a C. albicans és a C. dubliniensis más fajokból is azonosítható a chlamydospores néven ismert morfológiai jellemzők előállításának képessége alapján. A Chlamydospores refraktilis, gömb alakú struktúrák, amelyek a hifák végein keletkeznek, az izolátumok tenyésztését követően táplálkozási szempontból rossz közegben, például kukoricadara-agar. Az izolátumokat az agaron keresztkikötési mintázatban oltják be, és steril fedőréteggel fedik le. Az agarokat 24-48 órán át inkubáljuk 37 Kb-on, majd mikroszkóposan megvizsgáljuk a chlamydospore jelenlétét .

9.2. Fiziológiai kritériumok / biokémiai azonosítás

a Candida fajok biokémiai azonosítása nagyrészt a szénhidrát hasznosításán alapul. A hagyományos tesztelés magában foglalta volna a teszt izolátumok tenyészetét egy szénforrás nélküli bazális agaron. A szénhidrátoldatokat ezután a beoltott agar kútjaiba vagy az agar felületén elhelyezkedő szűrőpapír korongokra helyezzük. A szénforrás közelében történő növekedés a felhasználást jelzi. A kereskedelmi rendszerek ugyanazon az elven alapulnak, de a teszt szénhidrátokat egy tesztcsíkon található műanyag kutakban helyezik el. Az egyes kutak növekedését a zavarosság vagy a színváltozás bizonyos készletrendszerekben. A vizsgálati eredményekből nyert numerikus kódokat használják a vizsgált szervezet azonosítására adatbázis-összehasonlítás alapján .

9.3. Szerológiai

szerológiai vizsgálatokat gyakran alkalmaznak a Candida fajok izolátumainak klinikai jelentőségének megállapítására. A C. albicans elleni lgG antitestek növekvő titerei invazív candidiasist tükrözhetnek immunkompetens egyénekben. Az IgA és IgM antitestek kimutatása fontos az akut fertőzés azonosításához. Az immunszuppresszált egyének gyakran mutatnak variabilitást az antitest termelésben, és ebben az esetben antigén detektálási teszt alkalmazása javasolt. Az olyan tesztek, mint az enzimhez kapcsolt immunoszorbens vizsgálat (ELISA) és a rádióimmuno vizsgálat (ria) a kandidiális antigén kimutatására, akár sejtfal-mannan, akár citoplazmatikus alkotóelemek, már rendelkezésre állnak a fejlett országokban .

a szerológiai diagnózis gyakran késik, és a tesztek még mindig nem rendelkeznek érzékenységgel és specifitással. Ezenkívül az immunhiányos betegek antitesttermelése változó, ami megnehezíti a diagnózist . Ez annak köszönhető, hogy a gombás antigének és metabolitok gyakran gyorsan kiürülnek a keringésből, és az antitestek jelenléte nem mindig jelent Candida fertőzést, különösen súlyos alapbetegségben szenvedő vagy immunszuppresszív gyógyszereket szedő betegeknél .

a szerológiai tesztek általában nem az orális candidosis diagnosztikai eszközei. Az ilyen tesztek azonban prognosztikai eszközök lehetnek súlyos orális candidosisban szenvedő betegeknél, akik rosszul reagálnak az antimikotikus terápiára .

9.4. Molekuláris alapú azonosítási módszerek

a genetikai variabilitás elemzésével történő azonosítás stabilabb megközelítés, mint a fenotípusos kritériumokon alapuló módszerek alkalmazása. A Candida genetikai variációkon alapuló azonosítására elektroforetikus kariotípus-különbségek és restrikciós fragmentumhosszúságú polimorfizmusok (restrikciós fragmentumhosszúságú polimorfizmusok, RFLP-k) vizsgálata gélelektroforézissel vagy DNS-DNS hibridizációval .

fajspecifikus PCR-megközelítéseket is alkalmaztak a Candida fajok azonosítására. Számos célgént jelentettek a Candida fajok megkülönböztetéséről, bár a leggyakrabban amplifikáltak a riboszomális RNS operon szekvenciái. Az azonosítás a gélelektroforézis felbontását követően kapott PCR termékméretek alapján érhető el, vagy PCR termékszekvencia-variáció, amelyet közvetlen szekvenálással vagy restrikciós fragmens-analízis alkalmazásával határozunk meg a PCR-szekvenciák restrikciós endonukleázokkal történő vágását követően .

fluoreszcencia in situ hibridizáció peptid nukleinsav módszerrel (PNA Fish) egy új detektálási technika, amely az élő C. albicans bőséges rRNS-jében erősen konzervált fajspecifikus szekvenciákat céloz meg. Az egyes sejtek közvetlenül kimutathatók amplifikáció nélkül . Ez a technika 98,7–100% – os érzékenységet ér el, 100% – os specifitással, lehetővé téve a C. albicans megkülönböztetését a fenotípusosan hasonló C. dubliniensis-től .

molekuláris alapú technológia is használható a Candida fajok törzseinek azonosítására, bár az olyan technikák alkalmazása, mint a pulzáló mező gélelektroforézis (PFGE), véletlenszerű amplifikált polimorf DNS (RAPD) elemzésés ismételt szekvencia amplifikációs PCR (REP) nagyrészt az orális candidosis kutatásának epidemiológiai vizsgálataira van fenntartva .

10. Következtetés

az elmúlt években nagyobb hangsúlyt fektettek a Candida fajok megbízható azonosítására humán klinikai mintákból. A kandidális elkülönítés és azonosítás sematikus ábrázolása az 1. ábrán látható. Mivel a Candida a rezidens mikroflóra, megfelelő izolációs módszerekre van szükség a szájban való jelenlét megállapításához a számukkal együtt. Fontos a Candida fertőző törzseinek azonosítása is, mivel a Candida fajok izolátumai nagymértékben különböznek mind a fertőzés okozta képességükben, mind a gombaellenes szerekkel szembeni fogékonyságukban. Különböző fenotípusos technikák állnak rendelkezésre az izolált Candida azonosítására, beleértve a morfológiai tenyésztési teszteket, a differenciális agar táptalajt és a biokémiai asszimilációs teszteket. Ezeket a módszereket kiegészítik a legújabb molekuláris technikák, amelyeket nagyrészt epidemiológiai vizsgálatokra tartanak fenn.

1.ábra

A Candida fajok szájüregből történő izolálásának és azonosításának vázlatos ábrázolása.