Vita

jelen tanulmány feltárta az SR luminalis Ca-kötő fehérje, a CSQ2 szerepét a gerjesztés–összehúzódás kapcsolásának és a CICR szabályozásában a szívben. Pontosabban, megmutatjuk, hogy a CSQ2 Ad által közvetített túlzott expressziója drámai módon megnövelte mind a sejtek átlagolt Ica által kiváltott Ca tranziensek, mind a spontán Ca szikrák nagyságát izolált szívsejtekben. Ezen Ca jelek növekvő fázisának és változási sebességének elemzése azt mutatta, hogy megnövekedett méretük az alapul szolgáló Ca-felszabadulási fluxusok lassú megszűnésének volt köszönhető az SR-ből.az aktív Ca felszabadulás meghosszabbítása mellett az SR Ca raktárak funkcionális újratöltésének dinamikája is lelassult a megemelkedett csq2 fehérjeszinttel rendelkező sejtekben, amint azt az ismétlődő Ca szikrák lelassult helyreállítási ideje jelzi. Lényegében ellentétes eredményeket kaptunk a myocytákban, amelyekben a CSQ2 szintet ad-mediált antiszensz transzdukció csökkentette. Ezek a myocyták rövidebb Ca-felszabadulást mutattak, de felgyorsították a Ca-felszabadulási helyek helyreállítását. Ezenkívül periodikusan stimulált myocytákban csökkent CSQ2 szinttel az izoproterenol alkalmazása intracelluláris aritmogén oszcillációkat okozott . Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a CSQ2 kulcsfontosságú meghatározója az SR Ca releasing funkciónak, amely a Ca-release időtartamának és a release site refractoriness szabályozásával működik. A megfigyelt izoproterenol-függő zavarok fényében ritmikus Ca kerékpározás a myocytákban alul expresszálódik CSQ2, eredményeink relevánsak a csq2 gén mutációihoz kapcsolódó katecholamin által kiváltott aritmiák sejtmechanizmusainak megértéséhez.

a Csq2 hatás molekuláris mechanizmusai. A csq2 SR Ca felszabadulásra gyakorolt megfigyelt hatásait annak tulajdonítjuk, hogy ez a fehérje képes molekuláris pufferként működni, amely szabályozza a szabad az SR luminalis térben (lásd a javasolt sémát az ábrán. 5). A lipid kétrétegű vizsgálatokból ismert, hogy a Ca kötődése a RyR komplex luminális aspektusához (azaz luminális Ca érzékelő) növeli a csatorna aktivitását, míg alacsonyabb luminálisnál a csatorna aktivitása csökken (EC50 6 mm; ref. 26). Mivel sok RyRs aktivált állapotban lenne normál nyugalmi luminális Ca szinten (1 mM), a luminalis csökkentése a felszabadulási folyamat során ezért csökkentené a csatorna általános aktivitását (ezt a folyamatot luminális Ca-függő deaktiválásnak nevezik; ref. 3). Eredményeink azt sugallják, hogy a felszabadulási folyamat során az RyRs közelében lévő helyi szabad luminális stabilizálásával a CSQ2 lelassítja a RyR csatorna luminális Ca-függő lezárását, ezáltal növelve az SR-ből a citoszolba felszabaduló Ca mennyiségét. A CSQ2 a szabad intra-SR helyreállítási dinamikáját is szabályozza a Ca újbóli felvétele során azáltal, hogy mosogatóként szolgál a Ca számára az SR lumenben. Így a CSQ2 nemcsak erősíti az SR Ca effluxot, hanem stabilizálja a CICR-t is a CA-felszabadulási helyek funkcionális helyreállításának vagy készenlétének modulálásával minden felszabadulás után. Nemrégiben hasonló mechanizmusra hivatkoztunk az alacsony affinitású Ca kelátképzők (szerves sók) hatásainak magyarázatára, amelyek az SR-be kerülnek a Ca felszabadulásakor (3). Jelen eredményeink fontossága az, hogy megmutatják, hogyan szabályozza a felszabadulási folyamatot egy endogén, SR-rezidens Ca-kötő fehérje, CSQ2. Feltárják a csökkent csq2 mennyiség kóros következményeit is a szívsejtek SR-jében.

felvetődött, hogy a CSQ2 hatással lehet A Ca-release csatorna funkciójára a Ca-release csatorna komplexet (azaz RyR, junctin és / vagy triadin) tartalmazó fehérjékkel való közvetlen kölcsönhatás révén (ref. 13; felülvizsgálatra, lásd ref. 9). Vizsgálataink nem mutattak ki jelentős különbségeket az SR Ca felszabadulásának paramétereiben a körülbelül 3-szor emelkedett CSQ2 fehérjét tartalmazó sejtek és azok a sejtek között, amelyekben szerves puffereket töltöttek be az SR-be (3). Így a legegyszerűbb magyarázat az eredményeinkre az, hogy a csq2 domináns hatása az SR Ca felszabadulásra a fehérje SR-EN belüli pufferelő hatásának köszönhető. annak a részletes mechanizmusnak a tisztázása, amellyel a CSQ2 és a kapcsolódó fehérjék, mint például a junctin és a triadin szabályozzák a Ca felszabadulást, meg kell várniuk a vizsgálatokat, amelyek magukban foglalják a szintek manipulálását és ezen fehérjék mutáns formáinak expresszióját, amelyek megváltozott képességekkel rendelkeznek az egymás és a RyR kölcsönhatására.

a stimulált myocyták Ca felszabadulásának maximális sebessége hasonló volt, függetlenül az SR-ben kifejezett CSQ2 mennyiségétől (ábra. 2B és 3D). Ezek az eredmények alátámasztják azt az elképzelést, hogy a CSQ2 szabályozza a felszabadulási folyamat befejezését, de ezek az eredmények nem azok , amelyeket az SR-ben a fehérje várható pufferelő hatása alapján feltétlenül megjósolnánk. valójában a maximális felszabadulási sebesség várhatóan magasabb lesz a megnövekedett luminalis Ca-pufferelési erősségű sejtekben, amelyeket a szabad intra-SR lelassult csökkenése okoz, mert ezekben a sejtekben a Ca gradiens késleltetett csökkenése az SR membránon várhatóan nagyobb Ca fluxusintenzitást eredményez. Számos lehetséges ok magyarázza, hogy miért nem tartották be ezt. Az egyik lehetőség az, hogy a kezdeti szabad intra-SR alacsonyabb lehet A CSQ2-túlexpresszióban, mint a CSQ2-alulexpresszáló sejtekben. Bár egyensúlyi állapotban a Szabad egy zárt rekeszben, például az SR-ben, nem befolyásolhatja a Ca-kötő helyek száma (ennek csak azt a kinetikát kell befolyásolnia, amelynél az egyensúlyi állapot az intra-SR-t elérjük), lehetséges, hogy kísérleteink során nem sikerült valódi egyensúlyi állapotot elérni (azaz alacsony sebességű stimuláción átesett myocyták). Egy másik lehetőség az, hogy a megnövekedett CSQ2 fehérje jelenléte lelassítja a Ca diffúzióját a luminális térben, ezáltal lelassítja a Ca kilépését a nyitott csatornákon keresztül. Nyilvánvaló, hogy több kutatásra van szükség, mind kísérleti, mind elméleti szempontból a probléma megoldásához.

A CICR megszüntetése. Intenzív kutatás tárgyát képezte, hogy a CICR, az önregenerációra hajlamos folyamat hogyan fejeződik be, először a globális Ca tranziensek mérésével, újabban pedig a Ca szikrák vizsgálatával (3, 27-30). Az egyik figyelembe vett lehetőség az, hogy a RyR csatornák Ca-függő inaktiváláson vagy adaptáción mennek keresztül a csatorna citoszolikus oldalán (27-29). Egy másik lehetőség az, hogy az intra-SR csökkenése aktív jelet ad a RYR-ek bezárására azok megnyitása után (3, 30-32). Nemrégiben találtunk közvetlen kísérleti bizonyítékot a luminalis Ca által kiváltott változások szerepére a RyR aktivitásban (azaz luminalis Ca-függő deaktiválás) az SR Ca felszabadulásának megszüntetésében az SR-tartályba betöltött alacsony affinitású Ca pufferekkel rendelkező intra-SR szintek rögzítésével (3). Ezeknek a puffereknek a felhasználásával drámai módon meghosszabbítottuk az aktív Ca felszabadulás időtartamát mind a fokális, mind a globális Ca tranziensek mögött a myocytákban. Összhangban ezekkel a megállapításokkal, jelenlegi eredményeink azt mutatják, hogy a nagy kapacitású SR luminális Ca puffer CSQ2 szintjének növelése meghosszabbítja a Ca-felszabadulás időtartamát, mivel ennek az endogén puffernek a csökkentése lerövidítette a felszabadulás időtartamát, nyilvánvalóan a luminalis Ca-függő bezárásának lassításával vagy felgyorsításával RyRs, illetőleg. Ezek az eredmények együttesen meggyőző bizonyítékot szolgáltatnak a RyRs luminalis Ca-függő deaktiválásának szerepére a CICR megszűnésében. Bár bizonyítja a luminális Ca változásainak fontosságát az SR Ca felszabadulásának megszüntetésében, eredményeink nem feltétlenül zárják ki annak lehetőségét, hogy további mechanizmusok, például RyR inaktiválás vagy adaptáció a citoszolikus Ca szabályozási helyeken szintén befolyásolhatják a Ca-felszabadulás megszűnését.

bár egyértelmű bizonyíték áll rendelkezésre a luminalis Ca változásainak szerepére a szív szikráinak megszűnésében (ref. 3; jelenlegi tanulmány), korábbi tanulmányok azt mutatták, hogy a vázizomzat Ca szikrái nem járhatnak az SR jelentős kimerülésével . Lacampagne et al. (33) a nagy időbeli felbontású Ca szikrafelvételek kinetikai elemzését arra utalták, hogy a Ca szikra alapjául szolgáló Ca-felszabadulási fluxus állandó a kétéltű izomrostokban. Mivel az SR Ca fluxusnak csökkennie kell, amikor az SR esik, ez az eredmény azt jelentheti, hogy a luminalis Ca szintje állandó marad a Ca szikrák alatt. Így fennáll annak a lehetősége, hogy a szikra megszűnéséért felelős alapvető mechanizmusok különböznek a szív-és vázizomban. A két sejttípuson végzett komplementer vizsgálatok (azaz a vázizomrostokban a CSQ fehérje szintjének modulációja és a szívizomsejtekben a gyors Ca spark kinetikai mérések) segíthetik a kérdés tisztázását.

relevancia a CPVT szempontjából. Eredményeink egyik legfontosabb szempontja, hogy megmutatják, hogy a csökkent CSQ2 szint hogyan okozhat szívritmuszavarokat sejtszinten. A CPVT egy arrhythmogén betegség, amelyet a testmozgás és a katekolamin infúzió által kiváltott syncope és hirtelen halál jellemez (34). Eddig négy mutációt kapcsoltak össze a CPVT-vel. Úgy tűnik, hogy ezen mutációk közül három csökkenti a CSQ2 expressziót (17), és egy mutációt javasoltak a Ca (16) megszakadt kötődéséhez. Eredményeink arra utalnak, hogy a CPVT kiváltó oka összefüggésben lehet A Ca-felszabadulási mechanizmus rendellenes helyreállításával, amelyet a csökkent CSQ2 szint okoz (ábra. 5). A Ca-kötő helyek alacsonyabb koncentrációja miatt a CSQ2-t nem expresszáló sejtek SR-jében a Ca-tároló újratöltése a SERCA szivattyúval gyorsabban történik, mint a normál sejtekben. Az áruház újratöltése még gyorsabbá válik, ha a SERCA aktivitását a protein-kináz a stimulálja, potenciálisan figyelembe véve a CPVT klinikai epizódjainak a katekolaminoktól való függését. Csökkent csq2 szintű myocytákban a Ca-felszabadulási csatornák idő előtti helyreállítása luminális Ca-függő refrakter állapotból spontán, extraszisztolés SR Ca-raktárak kisüléséhez vezetett. Ismeretes, hogy a spontán Ca felszabadulás belső áramokat és rezgéseket indukálhat a membránpotenciálban, ami kiváltott aritmiát eredményez (4-7). Ezért a Ca kezelésében megfigyelt zavarok legalább részben magyarázhatják a CPVT patogenezisét olyan genetikai hibákkal, amelyek vagy csökkent Ca-kötő aktivitást (16), vagy a CSQ2 (17) csökkent expressziós szintjét eredményezik.

összehasonlítás a transzgenikus egerekkel végzett korábbi vizsgálatokkal. Eredményeink eltérnek a csq2-t túlexpresszáló transzgenikus egerekben kapott korábbi eredményektől (14, 15). Ezekben a vizsgálatokban a CSQ2 10-20-szoros túlzott expressziója megnövelte az izolált cardialis myocyták Sr Ca tárolási kapacitását; azonban a luminalis Ca nem állt rendelkezésre felszabaduláshoz, ami depressziós globális és helyi Ca-felszabadulási jelekhez vezetett. A Ca kezelésének ezen változásait számos szerkezeti, funkcionális és biokémiai változás kísérte a sejtek és a szubcelluláris szintek szintjén, valamint a cardialis hypertrophia és elégtelenség kialakulása. Másrészt a jelen tanulmány fenntartja a csq2 fehérje szintjét közelebb a fiziológiai szintekhez akut, nem pedig krónikus körülmények között; így ezek az adatok valószínűleg pontosabban tükrözik a csq2 fehérje szintjének az intracelluláris Ca kezelésére gyakorolt változásainak közvetlen fiziológiai következményeit. Ezek az eredmények rávilágítanak a fehérjék konstitutív magas szintű expressziójának transzgenikus állatmodellekben kifejtett hatásainak értelmezésével kapcsolatos lehetséges problémákra, valamint a komplementer vizsgálatok értékére akut körülmények között.

következtetés. Összefoglalva megállapítottuk, hogy a CSQ2 lényeges meghatározója az SR azon képességének, hogy tárolja és felszabadítsa a Ca-t a szívizomban. Úgy tűnik, hogy a CSQ2 tározóként szolgál a CA számára, amely könnyen hozzáférhető a CICR számára, valamint aktív Ca pufferként is, amely modulálja a RyRs helyi luminális Ca-függő lezárását. Ugyanakkor a CSQ2 stabilizálja a CICR mechanizmust azáltal, hogy lelassítja az SR Ca üzletek funkcionális feltöltését. A Ca-felszabadulási csatornák rendellenes reprimáló viselkedése figyelembe veheti vagy hozzájárulhat a csq2 gén mutációival kapcsolatos kamrai aritmiákhoz.