absztrakt
a meglévő kemotaxis vizsgálatok nem generálnak stabil kemotaktikus gradienseket, így—idővel—funkcionálisan csak a nem specifikus véletlenszerű mozgást mérik (kemokinézis). Összehasonlításképpen, a mikrofluidikus technológia képes egy szigorúan ellenőrzött mikrokörnyezet létrehozására, amely hosszú ideig stabilan fenntartható, ezért alkalmas a kemotaxis vizsgálatára. Itt leírunk egy új mikrofluidikus eszközt a sejtvándorlás érzékeny vizsgálatára, és bemutatjuk annak alkalmazását a simaizomsejtek kemotaxisának kemokin gradiensben történő értékelésére.
1. Bevezetés
Az irányított sejtmigráció kritikus szerepet játszik a gyulladásos rendellenességekben, az érrendszeri betegségekben, a sebgyógyulásban és a tumor metasztázisában . Számos in vitro módszert fejlesztettek ki a sejtmigráció számszerűsítésére, beleértve az egyrétegű sebek lezárását (“scratch assay”) és a Boyden kamrát . Ezek a jelenlegi módszerek azonban viszonylag érzéketlenek. Sőt, az ilyen megközelítések valójában csak a kemokinézist, vagyis a megnövekedett véletlenszerű mozgást mérhetik, nem pedig a kemotaxis által irányított sejtvándorlást.
valójában a scratch assay és a Boyden chamber transzwells hasznosságát módszertani kialakításuk korlátozza.
a karcolásvizsgálathoz egy meghatározott” seb ” (karcolás) készül egy összefolyó cellában egyrétegű; a hiba szélén lévő sejtek fokozatosan kitöltik az ürességet, és számszerűsítik a visszaállított összefolyás idejét. A karcolás gyorsabb javítását úgy értelmezték, hogy tükrözze a fokozott “kemotaxist” a sejtmanipuláció vagy a táptalajhoz hozzáadott oldható szerek jellege miatt. Míg a kísérlet fogalmilag egyszerű és technikailag könnyen elvégezhető, a sejteket egyenletes hatóanyag-koncentrációban fürdik, és a teljes kísérlet során nincs kemoattraktáns koncentrációgradiens; a mozgás, amely kitölti a rést, ezért csak egy “véletlenszerű sétát” jelent.”Így a karcolásvizsgálat “migrációja” nagyrészt csak a megnövekedett kemokinézis függvénye. Sőt, mint általában végzett-különösen több órán át tartó vizsgálat-a záró egy karcolás ” seb ” is valószínűleg tartalmaz egy jelentős összetevője a sejtproliferáció.
a “kemotaxis” mérésének másik leggyakoribb módszere a Boyden kamra transzwells. A specifikus kemokinek különböző koncentrációit helyezzük az eszköz alsó rekeszébe, míg az értékelendő sejteket a felső betétben inkubáljuk; egy mikroporózus membrán választja el a két kamrát, és támogatja a sejtnövekedést és részleges gátat képez a migrációnak. A membrán alsó felületén megszámolt vagy az alsó kamrában felhalmozódó sejteket általában egyetlen rögzített végponton értékelik. Ennek a vizsgálatnak az az előnye, hogy látszólagos irányított migráció, vagyis a felső kamrából az alsó kamrába, de még mindig problematikus. Először is, a kemokinek fentről lefelé nem “gradiens”, hanem csak egylépéses funkció alacsony vagy magas koncentrációktól. Másodszor, nincs mód fenntartani a kemokin különbséget a tetejétől az aljáig kamrák . Kezdetben a kemokin koncentrációja az alsó rekeszben nagyobb, de perceken vagy órákon belül a koncentrációk kiegyenlítődnek a diffúzió miatt, ekkor a specifikus kemotaxis megszűnik. Ehelyett a hosszú távú mérések valószínűleg a kemokinézis jelentős elemét tükrözik. Sőt, amint a sejtek a membránon keresztül az alsó kamrába esnek, nincs lehetőség a fordított migrációra. Végül a Boyden kamra is korlátozott, mert a sejtszámlálás megköveteli a kísérlet befejezését; egy időfolyam ezért több eszközt igényel.
a mikrofluidikus technológia képes leküzdeni ezeket a korlátokat azáltal, hogy hosszú távon stabil és szabályozható gradienst hoz létre az oldható faktorokból, amelyek folyamatosan nyomon követhetők az idő múlásával . A proliferáció blokkolására kezelt sejtek felhasználásával egy ilyen eszköz lehetővé teszi a kemotaxis valódi folyamatos értékelését a kemokinézissel szemben. Az 1. ábra olyan eszközt ábrázol, ahol a forrás és a mosogató koncentrációját megfelelő kutak létrehozásával tartják fenn, amelyek térfogata az összekötő hidrogélcsatornán keresztül a diffúz fluxushoz képest nagy . Egyensúlyi állapotban lineáris koncentrációgradiens alakul ki e két kút között. Bár a hidrogél régión átáramló intersticiális áramlás megzavarhatja a gradienst, ha a két kút hidrosztatikus nyomása nem egyenlő, a nyomásgradienseket kiküszöbölik azáltal, hogy a forrás-és mosogató kutakat további csatornákkal és tartályokkal kötik össze, amelyek alacsony ellenállási útvonalakként szolgálnak a folyadékáramláshoz és a nyomásegyensúlyozáshoz. A gradiensek tehát több napig fenntarthatók, és felhasználhatók a sejtmigráció érzékeny és specifikus tanulmányozására különféle sejttípusokkal . Az itt bemutatott munka leírja az ilyen eszközök használatát a simaizomsejtek elsődleges tenyészeteinek kemotaxisának felmérésére, és összehasonlítására a scratch és a Boyden kamra érzékenységi technikáival.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
Device design and stability of concentration gradients as a function of time. (a) az alsó 3 kút kemokinek cellás és / vagy forráskútja, a felső 3 kút pedig tartályként szolgál az alsó kutak egyenértékű nyomásának fenntartására. A kísérleti kialakítástól függően az oldalsó kutak vagy a központi kút forráskutakként szolgálhat; a központi kút sejtjei mindkét oldalon különböző kemokin ingerek felé vándorolhatnak, vagy az oldalsó kutak különböző sejtpopulációi vándorolhatnak egy központi kemokin inger felé. (b, c) A Koncentrációgradienseket vázlatosan mutatjuk be, miután kis molekulatömegű fluoreszcens festékindikátort adtak a forráskúthoz és a forrástartályhoz, vagy 2 (b), vagy 72 (c) órán belül. d) A 0 órától 72 óráig terjedő koncentrációgradiensek grafikus megjelenítése fluoreszcens festék hozzáadása után a forráskúthoz és a tartályhoz.
2. Anyagok és módszerek
2.1. Elsődleges simaizomsejtek (SMC) tenyészet
Aortákat 8 hetes C57/B6 egerekből (Charles River, Wilmington, MA) steril boncoló ollóval gyűjtöttük be. A tapadó zsírt eltávolítottuk, és az aortákat 20 percig inkubáltuk 37cc-n a Dulbecco módosított Eagle táptalajában (DMEM; Invitrogen, Grand Island, NY), amely 1% penicillint/sztreptomicint, 2% magzati szarvasmarha szérumot és 5 mg/mL II-es típusú kollagenázt (Invitrogen) tartalmazott. Az aortákat hideg DMEM-ben leöblítettük, és az adventitia-t gondosan szétszedtük; ezután apró darabokra vágtuk, és 30 percig inkubáltuk 37 Kb-os hőmérsékleten 1 mg/mL I. típusú kollagenázt (Invitrogén) és 0,125 mg/mL III-as típusú elasztázt (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) tartalmazó DMEM-ben. A szövet disszociációjára szolgáló ismételt pipettázást követően a kapott sejtelegyet friss “SMC táptalajban” (DMEM 10% magzati szarvasmarha szérummal, 1% penicillin/sztreptomicinnel; 2% nem esszenciális aminosavakkal, 1% L-glutaminnal; az Invitrogén összes reagensével) szuszpendáltuk, és 37 6CC-n 5% CO2-os inkubátorban tenyésztettük 1 mg/mL fibronektinnel bevont lemezeken 30 percig. A sejttenyészet létrejötte után (jellemzően az első áthaladás után) az SMC-t bevonat nélküli műanyag lombikokon termesztik (Corning Incorporated, Corning, NY).
az SMC-t a 2-től a 7-ig terjedő szakaszokig használták, és 99 volt.5% – os tisztaságú, áramlási citometriával értékelve a simaizomzat festése után. A festéshez a sejteket 1% paraformaldehiddel (Sigma-Aldrich) rögzítik foszfát pufferolt sóoldatban (PBS). FITC-konjugált simaizom-gátló anti-aktin antitestet (Sigma-Aldrich) 1 : 100 arányban hígítva 10x BD perm/wash pufferben (BD Pharmingen, San Jose, Kalifornia) 10 percig szobahőmérsékleten alkalmaztuk. A sejteket kétszer mossuk 1% magzati szarvasmarha szérummal PBS-ben, egyszer pedig 1% magzati szarvasmarha szérummal 1% formaldehidet tartalmazó PBS-ben, és azonnal elemezzük áramlási citometriával (FACScalibur, BD Biosciences, San Jose, CA). FITC-konjugált egér IgG1 izotípus (BD Pharmingen) izotípus-kontrollként használják. A kemotaktikus vizsgálatokhoz szükséges sejteket akkor gyűjtöttük be, amikor elérték az összefolyást.
2.2. Mitomicin-C kezelés
a sejteket tripszinizáljuk (0,25% tripszin-EDTA; Invitrogén) 2 percig 37 Kb-on, SMC-táptalajjal mossuk, majd egysejtű szuszpenzióként inkubáljuk 40 Kb/mL mitomicin-C-ben (MMC; Sigma-Aldrich) SMC közegben 30 percig 37-nél 67 C. Két további mosás után PBS-ben a sejteket életképesség, proliferáció vagy migrációs kapacitás szempontjából értékeltük. A sebgyógyulás (karcolás) vizsgálathoz MMC kezelést végeztünk SMC bevonás után, amikor a sejtek 100% – ban összefolytak; a sejteket inkubáltuk 40 Kb/mL MMC-ben SMC közegben 30 percig 37 Kb-n, majd kétszer mossuk PBS-ben a vizsgálat előtt.
2.3. SMC proliferáció gátlási vizsgálat
MMC kezelés vagy kontroll inkubáció után SMC közegben az SMC-t 6 lyukú lemezeken tenyésztettük (Corning Incorporated). A sejteket 1 óra, 24 óra vagy 48 óra elteltével tripszinizációval nyertük vissza, és a sejtszámokat és életképességet hemocytométerrel és trypan blue kizárással végzett számlálással értékeltük.
2.4. Sebgyógyulás / karcolás vizsgálat
az SMC-t 12 lyukú lemezeken tenyésztettük (Corning Incorporated) összefolyásig, majd MMC-vel kezeltük. Mosás után friss SMC táptalajt adtunk hozzá, és a sejt egyrétegét steril, 200 ml-es pipettahegy segítségével reprodukálható módon megkarcoltuk. A vérlemezkéből származó növekedési faktor (PDGF) különböző koncentrációi; R&D rendszerek, Minneapolis, MN) SMC adathordozókon minden kúthoz hozzáadtuk. A karcolási hiba szélei közötti távolságot öt különböző ponttól 3, 6 és 9 óráig mértük és átlagoltuk, vagy amíg a sebhiba le nem zárult.
2, 5. Boyden Chamber Transwell Assay
100 db SMC szuszpenziót 1,0–1,5 db 105 sejt/mL (összesen 1,0–1,5 db 104 sejt) mellett töltöttünk be a felső transwell betétekbe (Costar, Corning Incorporated), és 600 db különböző koncentrációjú PDGF tartalmú SMC táptalajt helyeztünk az alsó rekeszbe. 6 óra, 12 óra vagy 24 óra inkubálás után a transwell membránt a gyártó ajánlása szerint Hoechst 33342-vel (Invitrogen) festették, és az alsó felületen lévő transzmigrált sejteket fluoreszcens mikroszkóppal számolták MetaMorph NX mikroszkópia Automatizálási és képelemző szoftverrel (BioCompare, South San Francisco, CA). Az alsó kamrában lévő táptalajban soha nem azonosítottak sejteket. Annak felmérésére irányuló kísérletekben, hogy a sejtvándorlás kemotaxist vagy véletlenszerű kemokinézist jelentett-e koncentrációgradiens hiányában, vérlemezkéből származó növekedési faktor-BB (PDGF) adtunk az alsó kamrához, csak a felső betéthez, vagy mind a felső betéthez, mind az alsó kamrához.
2.6. Mikrofluidikus Eszközvizsgálat
a mikrofluidikus eszközöket (1 .A)-1. C) ábra) a máshol leírtak szerint állítjuk elő. Amint az 1. D) ábrán látható, a hozzáadott reagensek gradiensei legalább 72 órán át stabilak. A kísérleti protokolltól függően az értékelendő sejteket a központi kútba helyezik, és a két oldalsó kútból különböző kemotaktikus gradienseket alakítanak ki. Alternatív megoldásként két különböző sejtpopuláció migrációja értékelhető az oldalsó kutakból, azonos koncentrációs gradienseket tapasztalva, amelyeket a központi kútba helyezett reagensek generálnak. A sejtkoncentráció mindig 4-5-105/mL volt, és a sejtszuszpenziók közül 40–et (1,6-2,0 603 sejt) töltöttünk be a tesztkutakba.
a sejteket különböző időpontokban inkubáltuk az eszközökben, majd Hoechst 33342-vel (Invitrogen) festettük. Az egyes sejtek helyét fluoreszcens mikroszkóppal határoztuk meg (Nikon Eclipse TE2000-U; Nikon Instruments, Inc., Melville, NY), és a migrált távolságot a Matlab program (MathWorks, Natick, MA) segítségével értékelték. A “teljes migráció” az összes sejt által a kezdeti kiindulási helyen túlra vándorolt távolságok összege; ezt a migrációs indexet használják statisztikai elemzéshez (2.ábra).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
a sejtmigráció értékelése mikrofluidikus eszközökben. A sejteket egy mikrofluidikus eszköz középső alsó kútjába vontuk be, 50 ng / mL PDGF-et SMC közegben a bal alsó kútba, egyedül az SMC közeget a jobb alsó kútba helyeztük, majd 37-en inkubáltuk kb 48 órán keresztül. (a, b) A sejt kemotaxisának fáziskontraszt képe a központi csatornából a bal csatornában lévő 50 ng/mL PDGF irányába; a képeket a csatorna mentén osztják fel a mosogató és a forráslyukak között úgy, hogy a csatorna teljes hossza a sejtfelbontáshoz elegendő nagyítással mutatható ki. (c, d) A sejtek Kemokinézisének fáziskontraszt képe a központi csatornából csak az SMC közeg irányába. (e, f) a bal (e) vagy a jobb oldali alacsony teljesítményű fluoreszcens kép; (f) csatorna 48 h-nál a Hoechst 33342 festése után. (g) a bal csatorna nagy teljesítményű fluoreszcens képe az (e) panelen; a kép jobb oldala közelében lévő cellák nélküli fekete négyzet (csillag) egy szerkezeti oszlop, amely a migráció kiindulópontját jelöli. h) példa a kioldódási elemzésre. Egy függőleges piros vonal jelöli a kiindulási pontot; megmérjük a távolságot a kiindulási ponttól az egyes sejtmagok középpontjáig, és ezen egyedi mérések összege a MATLAB segítségével a teljes migrációs távolság lesz.
Az I. típusú kollagén (Invitrogen) a központi és az oldalsó kutak közötti csatorna kitöltésére szolgál, és ez a szubsztrát, amelyen keresztül a sejtek vándorolnak. Mind 1 mg/mL, mind 2 mg/mL kollagén használható. Bár az 1 mg / mL kollagén valamivel magasabb nem specifikus háttérsejt kemokinézist eredményez, és a gél betöltése technikailag nehezebb, mint a 2 mg/mL kollagénnél, az alacsonyabb kollagénkoncentráció lehetővé teszi az SMC elsődleges tenyészeteinek nagyobb migrációját, és a vizsgálat érzékenysége jobb. Eltérő rendelkezés hiányában a kollagén koncentrációja a migrációs csatornákban minden kísérletnél 1 mg/mL volt.
2.7. Statisztikai elemzés
A statisztikai összehasonlításokat hallgatói teszt vagy egyirányú ANOVA segítségével végeztük. A szignifikanciát a szinten határozták meg.
3. Eredmények és megbeszélés
amint azt a 3(a) ábra mutatja, a sejtproliferációt az MMC kezelés gátolja. Nincs szignifikáns különbség a sejtek életképességében az MMC-vel kezelt SMC ( % ) és a kezeletlen SMC ( % ) között a kezelést követő 48 órán keresztül. Így a sejtek felhalmozódása a különféle migrációs vizsgálatokban valódi sejtmozgást jelent a sejtproliferáció bármely összetevője nélkül. Ez azért fontos, mert MMC kezelés nélkül a hosszú távú inkubációkból származó migrációs indexeket megzavarhatja az egybeeső sejtproliferáció.
(a)
(b)
(C)
(D)
(a)
(b)
(C)
(D)
az elsődleges SMC tenyészetekkel végzett kaparásvizsgálatokban (3(b) ábra) a sejtek véletlenszerűen vándoroltak (kemokinézis), hogy a hibákat összehasonlítható sebességgel töltsék ki, függetlenül a PDGF koncentrációjától, beleértve kemotaktikus szer hiányát is. MMC kezelés nélkül a sebhibák általában valamivel korábban bezáródnak, ami a sejtproliferáció egyik elemére utal.
a 3.ábra(c) mutatja az SMC migrációjának eredményeit a Boyden chamber transwell assay alkalmazásával. A korai (12 órás) időpont kicsi, de jelentősen megnövekedett migrációt mutat 10-50 ng/mL PDGF-re reagálva, szemben az alsó kútban lévő kemokinnel. A pdgf 10-szeres koncentrációtartományában azonban nem volt megkülönböztethető különbség a migrációban, ami arra utal, hogy a vizsgálat viszonylag érzéketlen, legalábbis az elsődleges SMC tenyészetek esetében. Sőt, 24 órán belül nincs különbség a kemokinek (beleértve a közepes kontrollt is) koncentrációja között, ami arra utal, hogy a migráció ebben az időpontban nem specifikus, miután a citokin koncentrációk egyensúlyba kerültek a felső és az alsó kutak között.
annak hivatalos bizonyítására, hogy a felső kút membránján keresztüli vándorlás nem feltétlenül az irányított kemotaxis következménye, PDGF-et adtunk a felső kúthoz, az alsó rekeszben lévő PDGF-fel vagy anélkül. Még kemokin gradiens hiányában is a PDGF a felső kamrában jelentősen megnövekedett transzmigrációhoz vezetett(3.ábra (d)); ez csak a megnövekedett kemokinézisnek tulajdonítható.
a transwell-kísérletek tehát azt sugallják, hogy bár a kezdeti PDGF-koncentráció-különbségek bizonyos fokú fokozott sejtvándorlást indukálhatnak az alsó kutak magasabb koncentrációja felé, az ezt követő PDGF-diffúzió véletlenszerű kemokinézishez vezet.
összehasonlításképpen, a mikrofluidikus eszközökkel végzett dózis-válasz kísérletek (4.ábra) szignifikáns kemotaxist mutatnak olyan alacsony koncentrációknál, mint 2.5 ng/mL PDGF(4.b) ábra), és a kemotaxis dózisfüggő növekedését mutatja, amelynek csúcsa körülbelül 25-50 ng/mL (4. A) ábra). Érdekes módon a pdgf magasabb koncentrációja (például 100 ng/mL) kevesebb migrációhoz vezet, összhangban a nagy dózisú kemotaxis letartóztatással (18). Megjegyzendő, hogy előzetes MMC kezelés nélkül a migrációs index nagyobb(4.ábra (a)), kiemelve a proliferáció nem elhanyagolható hozzájárulását a hosszabb vizsgálati időkkel előforduló “látszólagos” kemotaxishoz. The results demonstrate that the microfluidic device for measuring chemotaxis is substantially more sensitive than the existing scratch or “gold standard” Boyden chamber approaches.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
Microfluidic device assay. a) dózis-válasz görbék előzetes MMC-kezeléssel vagy anélkül. Az MMC-vel kezelt és nem kezelt SMC-t oldalsejtes kutakba helyeztük, a központi forrás kutakban különböző koncentrációjú PDGF (5 ng/mL, 10 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL és 100 ng/mL) volt jelen. A migrációt a Hoechst 33342 festéssel és fluoreszcens mikroszkóppal 48 óra után mérték a matlab program segítségével a teljes migráció kiszámításához. A kontrollokat (csak SMC közeg) és a PDGF minden koncentrációját három példányban értékelték. Szignifikáns különbségek láthatók 5 ng / mL-től 100 ng/mL PDGF-ig a kontrollhoz képest (). (b) Kemokinézis versus kemotaxis mikrofluidikus eszközökben. MMC-vel kezelt SMC-t 2,5 ng/mL PDGF-vel vagy anélkül bevontuk a központi cellába; 2,5 ng/mL vagy 50 ng/mL PDGF-et adtunk az oldalsó forrás kutakhoz. Mivel a központi sejtkútban nincs PDGF, a vizsgálat szignifikánsan nagyobb teljes migrációt Mutat 48 óra után, 50 ng/mL-rel a forráskútban (“0-50”), szemben a Forráskút 2,5 ng / mL-jével (“0-2, 5”). A 2,5 ng/mL PDGF jelenléte a központi sejtkútban szignifikánsan nagyobb teljes migrációhoz vezet, ha koncentrációs gradiens van (“2,5–50”; ) helyi kemokinézis hatásnak tulajdonítható. Gradiens (“2,5–2,5”) hiányában van egy kemokinézishez kapcsolódó migráció, amely lényegesen kisebb, mint a gradiens jelenlétében látható migráció (“0-2, 5”;). (c) A (B) panelként végzett Időpályás kísérlet.
a mikrofluidikus eszköz nemcsak a kemotaxis mérésére használható, hanem kifejezetten meg tudja különböztetni a kemokinézis és a kemotaxis migrációhoz való hozzájárulását (4(b) ábra). Így kemokin gradiens hiányában (pl. 2.5 ng / mL PDGF mind a középső, mind az oldalsó kutakban), a migrációs index a kemokinézist tükrözi. Összehasonlításképpen, ha a középső kútban nincs PDGF, az oldalsó kútban pedig 2,5 ng/mL, a migrációs index az irányított kemotaxist tükrözi. A mikrofluidikus eszköz a meglévő kemokinézis jelenlétében is képes felmérni a kemotaxist, mint amikor a középső kút 2,5 ng/mL PDGF-et, az oldalsó kút pedig 50 ng/mL-t tartalmaz. Kicsi, de statisztikailag nagyobb a migráció, ha az inger kemotaktikus gradiens, nem pedig egyszerű kemokinézis.
mivel a kemokin gradiens 2 órán belül létrejön (17), és több napig stabil, a sejtek folyamatosan vándorolhatnak felfelé a koncentráció gradiens idővel (4(c) ábra). Összehasonlításképpen, más klasszikus módszereknek vagy nincs koncentrációgradiensük (scratch assay), vagy csak átmeneti kemokingradiensük van, így a kemokinézis—az irányított kemotaxis helyett—egyre inkább hozzájárul.
az ebben a munkában jelentett mikrofluidikus eszköz számos szempontból jobb, mint a kemotaxis tanulmányozására korábban alkalmazott egyéb in vitro megközelítések. Különösen a Boyden-kamra-amely kemokin gradienst tartalmaz egy porózus membránon keresztül-az 1950-es évek óta szokásos kemotaktikus vizsgálat. ennek az eszköznek azonban jelentős korlátai vannak abban, hogy a gradiensek sem stabilak, sem lineárisak, a kezdeti éles koncentráció fokozódásával, amely az idő múlásával fokozatosan romlik. Újabban mikro-elektromechanikus rendszerek (MEMS) olyan technológiákat fejlesztettek ki, amelyek mikrofluidikus biochipeket használnak az in vivo körülmények utánzására; ezekben az eszközökben a sejteket szabályozott áramlás alatt folyamatosan nyíróerőknek teszik ki. Ezen eszközök folyamatos áramlása azonban kihívást jelent a stabil kemokin gradiensek fenntartása szempontjából. Bár a forrás és a lefolyócsatorna közötti hidrogélek lineáris koncentrációgradienseket hozhatnak létre, a kutak és csatornák finom variációi nyomásgradienseket idézhetnek elő, amelyek megzavarják a gradienseket az intersticiális áramlás révén ; ráadásul az eszközök folyamatos áramlása hajlamos hígítani a sejtforrások által kiválasztott kemoattraktánsokat. A korábban leírt új mikrofluidikus eszközben, amelyet ebben a cikkben a simaizomsejtek migrációjára validáltak, a nagy térfogatú forrás és a mosogató kutak stabil kemokin gradienseket tartanak fenn az összekötő hidrogélben; minden intersticiális áramlás megszűnik a forrás és a mosogató kutak további csatornákkal és tartályokkal való összekapcsolásával, amelyek ellenállás-kondenzátor áramkörként szolgálnak. A koncentrációgradiensek tehát stabilak és több napig lineárisak. A jelenlegi munka tovább finomította az alkalmazást, beépítve a mitomicin-C kezelést a proliferáció zavaró hozzájárulásának csökkentése érdekében, és bemutatva, hogy a kemotaxis és a kemokinézis hogyan értékelhető ugyanabban a kísérleti beállításban.
összeférhetetlenség
a szerzők kijelentik, hogy nincs összeférhetetlenségük.
elismerések
ezt a munkát a BWH-BRI Alap támogatása támogatta a kutatási kiválóság fenntartása érdekében-híd kutatási támogatás. Chen Zhang – ot 18 hónapig támogatta a kínai ösztöndíj Tanács. Ovidius C. Amati és Richard T. Lee-t részben az NSF CBET-0939511 tudományos és Technológiai Központ támogatta.
