Résultats et discussion

Les HANCs Proviennent de l’Épiderme de la Tête et nécessitent une Fonction Génique lb. Des études antérieures (5, 11, 17, 19) ont décrit le rôle des gènes lb dans les processus de spécification du devenir cellulaire. Chez la Drosophile, des expériences de gain et de perte de fonction ont révélé que les gènes lb spécifient l’identité d’un sous-ensemble de cellules cardiaques et musculaires et que cette fonction résulte de l’expression mésodermique hautement restreinte et spécifique à la lignée de lb. En outre, une analyse précise du lbe (Fig. 1) et le schéma d’expression de la lbl (données non représentées) au début de la fusion cardiaque ont révélé un amas triangulaire de cellules lb-positives situées juste en avant de la pointe du cœur (Fig. 1 A, pointe de flèche). Pour produire une description plus précise de la position de ces cellules par rapport aux glandes lymphatiques associées au cœur et aux glandes annulaires, nous avons double-marqué des embryons pour lb et des marqueurs de glandes spécifiques (Fig. 1 B et C). Les précurseurs des glandes lymphatiques révélés avec des anticorps anti-Serpent flanquent de part et d’autre de la pointe du cœur (Fig. 1B) mais ne pas chevaucher la zone marquée par lb. De même, la double coloration de la ligne piège enhancer l(2)1857, qui exprime spécifiquement LacZ dans les primordiums embryonnaires de la glande annulaire (15), montre que les cellules lb-positives sont situées immédiatement devant la glande annulaire (Fig. 1C).

Pour déterminer l’origine des cellules lb positives associées au cœur, nous avons suivi l’expression de lb dans la partie antérieure des embryons à partir du stade précoce. Aux stades embryonnaires qui précèdent la fusion cardiaque, nous n’avons pas pu détecter l’expression de lb associée à la partie antérieure de deux primordiums cardiaques. Cette découverte suggère que les cellules lb-positives ne sont pas spécifiées à l’origine dans la région du cœur et peuvent représenter des cellules d’origine différente qui deviennent associées aux cellules cardiaques à des stades ultérieurs. En effet, au stade tardif 11, un groupe de cellules lb-positives dans l’épiderme de la tête dorsale (Fig. 2A) peut être détecté. Ces cellules commencent à s’invaginer légèrement plus tard et forment la partie principale de l’épiderme plissé (Fig. 2B). La position et le moment de cette invagination ressemblent à un pliage de l’épiderme de la tête, donnant naissance à la partie postérieure de la poche dorsale appelée sac frontal (20). Pour vérifier si les cellules exprimant lb correspondent à l’extrémité du sac frontal, nous avons utilisé la lignée escargot-LacZ N516 qui exprime le lacZ dans les cellules formant la poche dorsale (20). Double coloration de l’étape 14 (Fig. 2B) et l’étape 16 (Fig. 2C) Les embryons N516 utilisant des anticorps anti-Lbe et anti-β-galactosidase démontrent clairement que lb et esg sont coexprimés à l’extrémité du sac frontal invaginant. Une vue dorsale de la région de la tête embryonnaire (Fig. 2D) confirme que ces cellules présentent la même disposition triangulaire que les cellules lb-positives associées au cœur montrées précédemment (voir Fig. 2D et 1).

Prises ensemble, ces données indiquent que les cellules exprimant la lb situées immédiatement devant le cœur proviennent de l’épiderme de la tête et migrent vers l’extrémité du cœur lors de l’invagination du sac frontal. Cette observation soulève une question supplémentaire concernant le rôle des gènes lb dans la spécification de ce groupe de cellules. Nous avons déjà montré que les gènes lb jouent un rôle important dans la spécification d’un sous-ensemble de précurseurs cardiaques et musculaires (11, 19). L’analyse fonctionnelle du gène lb ortholog Lbx1 de souris (21, 22) a également révélé son implication dans le contrôle de la spécification et de la migration dirigée des précurseurs des muscles appendiculaires. De plus, les données les plus récentes indiquent que Lbx1 chez la souris spécifie une sous-population de cellules de la crête neurale cardiaque nécessaires au développement cardiaque normal (23).

Pour tester si les Drosophiles lb sont nécessaires pour la spécification des cellules associées au cœur, nous avons analysé la formation de poches dorsales chez des embryons déficients pour les deux gènes lb (voir Matériaux et méthodes). En utilisant la sonde d’ARN esg comme marqueur, nous avons démontré que chez les embryons de lbdef, l’expression esg dans la partie distale du sac frontal portant les cellules associées au cœur est absente (voir Fig. 2 E et G avec F et H). De plus, comme le montrent les vues dorsolatérales des embryons de stade 14 (Fig. 2 G et H), la distance entre le sac vitellin et les cellules esg positives les plus distales est considérablement élargie chez les embryons déficients en lb. Cette découverte, corroborée par l’observation de Nomarski optics révélant que la partie postérieure du sac frontal a une morphologie modifiée (données non montrées), a indiqué que les HANCs ne sont pas spécifiés ou ne migrent pas correctement chez les embryons de lbdef. Étant donné que la déficience analysée couvre également les gènes bap et C15 adjacents, nous avons testé la formation de sac frontal dans des embryons mutants bap et des embryons UAS-RNAiC15 Arm-GAL4>. Chez les embryons bap208 et RNAiC15, le sac frontal coloré en esg était de forme normale (données non montrées), excluant ainsi l’influence des gènes bap et C15 sur la différenciation ou la migration des cellules associées au cœur. Ces données suggèrent fortement que le profil anormal des cellules sac frontales distales esg positives chez les embryons de lbdef résulte de la perte de la fonction lb.

Composants mésodermiques et Non mésodermiques Impliqués dans la Structuration de la Région d’écoulement cardiaque. Nos expériences d’immunocoloration ont montré que les cellules lb-positives ancrant le cœur sont très proches des cardioblastes exprimant lb (Fig. 1). Parce que les cardioblastes les plus antérieurs expriment l’étain (5), nous avons double-marqué des embryons avec des anticorps anti-Étain et anti-Lbe pour visualiser les positions respectives de la pointe du cœur et de la partie la plus distale du sac frontal. Étonnamment, ces deux structures se chevauchent d’environ trois longueurs de cellules lorsqu’elles sont observées du côté dorsal (Fig. 3 BIS). De plus, la vue confocale latérale de la région cardiaque antérieure (Fig. 3B) montre clairement que l’extrémité du sac frontal, constituée de cellules exprimant lb non mésodermiques, est directement attachée au cœur. Plus précisément, nous avons observé que la partie antérieure de l’aorte (chevauchant en partie les cellules lb associées au cœur) se plie ventralement, formant une zone morphologiquement distincte correspondant à la région de sortie cardiaque. Cette morphologie suggère qu’il pourrait y avoir un composant cellulaire supplémentaire favorisant la flexion ventrale du cœur. Nous avons décidé de rechercher la présence d’un muscle situé ventralement attaché à la pointe de l’aorte. La vue latérale de l’embryon, à double coloration pour la chaîne lourde de myosine (Myo) et Lbe (Fig. 3C), montre clairement que l’écoulement cardiaque est bien attaché à un muscle de la tête, que nous proposons d’appeler le COM. Une analyse plus précise des coupes confocales a révélé que le primordium cardiaque est en fait lié par deux COM étroitement couchés qui s’étendent de l’œsophage et se fixent de part et d’autre de la région de sortie cardiaque (pointes de flèches ouvertes sur la Fig. 3D). Étonnamment, ces muscles de la tête embryonnaires n’ont pas été décrits auparavant à notre connaissance. Le manque de documentation publiée pour les COM est probablement dû au fait que la morphologie et l’origine des muscles somatiques de la tête chez l’embryon de Drosophile n’ont pas été systématiquement analysées. En utilisant la seule description disponible de la musculature de la tête adulte faite par Miller (24), nous n’avons pas pu identifier les muscles de la tête adultes qui pourraient correspondre aux COM embryonnaires présentés ici.

Il est intéressant de noter que la double coloration Myo/Lbe a également révélé que les HANCs non mésodermiques sont attachés aux deux cellules cardiaques (Fig. 3E) et les COM (Fig. 3D). Parce que les HANCs expriment lb et s’associent sélectivement à la paire de cellules cardiaques lb-positive la plus antérieure (Fig. 3E et 4 D-F), nous supposons que l’établissement de ce contact peut impliquer des interactions cellulaires de type homophile. Tester les molécules d’adhésion cellulaire impliquées dans la signalisation intercellulaire entre les cellules homotypiques (25, 26) aidera à définir les mécanismes sous-jacents à l’établissement de la connectivité entre les HANCs exprimant la lb et les cellules cardiaques.

Pour visualiser la disposition spatiale de la pointe de l’aorte, des COM et des HANCs exprimant la lb, nous avons utilisé une analyse 3D assistée par ordinateur et une reconstruction de scans confocaux. Cette approche a pleinement confirmé nos observations révélant qu’en plus des HANCs, la région de sortie du cœur est étroitement attachée à une paire de COM (Fig. 3F). Ces muscles chevauchent la pointe du cœur des deux côtés et contribuent à sa flexion ventrale.

Pour comprendre comment le contact entre le cœur, les COM et les HANCs s’établit au cours du développement, nous avons surveillé ces structures chez des embryons de stade 14 précoce et tardif (Fig. 3 G et H). Nos données indiquent que les cellules cardiaques lb-positives et les HANCs exprimant lb attirent des COM s’étendant.

Le contact entre COMs et HANCs semble légèrement précéder la fixation de COM à l’extrémité de l’aorte et se voit au début de l’étape 14 (Fig. 3G). À ce moment-là, les fillopodes de COM s’étendent dans la direction des cellules cardiaques lb-positives (Fig. 3G) et se fixent définitivement à ces cellules au stade avancé 14 au début de la fusion cardiaque (Fig. 3H). Parce que les COM entrent en contact avec les cellules cardiaques et les HANC avant que les HANC ne s’attachent au cœur, nous supposons que les COMs, en plus de plier le bout du cœur, facilitent son contact avec les HANC. L’établissement du contact entre les muscles somatiques et leurs sites d’attachement épidermique (cellules tendineuses) a été largement étudié (27), révélant le rôle clé de la bande de facteur de transcription du doigt de zinc (28) et d’une protéine de liaison à l’ARN How (29). Nous avons utilisé ces deux marqueurs pour tester si les HANCs et les cellules cardiaques auxquelles les COMs se fixent affichent des propriétés de cellules ressemblant à des tendons. Le double marquage effectué sur des embryons WT avec anti-Lbe/anti-Rayure et sur des embryons how-lacZ avec des anticorps anti-Lbe/anti-LacZ a révélé que les HANCs et les cellules cardiaques en contact avec les cellules n’expriment pas de marqueurs de cellules tendineuses (données non représentées). Cette découverte indique que les cellules lb-positives attirent les COM en utilisant un mécanisme différent de celui utilisé par les cellules tendineuses. Les candidats les plus intéressants pour guider les COM sont la fente protéique sécrétée possédant les motifs de liaison protéiques multiples et ses récepteurs Robo et Robo2 (30). Slit et Robo sont apparus récemment comme des composants pivots contrôlant les processus d’attraction et de répulsion lors de la morphogenèse des muscles somatiques (31), suggérant qu’ils pourraient également être impliqués dans l’attraction COM.

Les Cellules Cardiaques exprimant la lb la plus Antérieure Jouent un Rôle Central dans la Structuration de la Région d’Écoulement Cardiaque. L’observation selon laquelle les COM et les HANCs ont choisi de s’attacher aux cellules cardiaques lb-positives les plus antérieures nous a incités à tester si la dérégulation de l’expression lb dans le cœur pouvait influencer la structuration de la région de sortie cardiaque. Pour effectuer ce test, nous avons utilisé le système d’expression ciblé Gal4/UAS (16). Deux lignes effectrices GAL4 différentes, 24B-GAL4 et Tin-GAL4, ont été utilisées (Fig. 4 A et C). La lignée 24B-GAL4 permet une expression ciblée dans toutes les cellules cardiaques et musculaires (Fig. 4A) avec un niveau d’expression uniforme et élevé dans les cellules cardiaques les plus antérieures (flèche de la Fig. 4 BIS). La ligne Tin-GAL4 (gentiment fournie par R. Bodmer) induit sélectivement l’expression du transgène du SAMU dans quatre cardioblastes de chaque hémiségment (ceux-ci incluent les cellules lb-positives), mais le niveau d’induction dans les cellules cardiaques les plus antérieures est plus faible (flèche de la Fig. 4C) que celle de la ligne 24B-GAL4. Pour développer l’expression cardiaque de lb, les deux lignes effectrices GAL4 ont été croisées avec la ligne UAS-lbe. L’expression cardiaque ectopique de lb entraînée par la lignée Tin-GAL4 était plus faible que l’expression endogène de lb dans le cœur, et aucune altération évidente induite par le gain de fonction dans la structure de la région d’écoulement cardiaque n’a été observée (données non présentées). En revanche, les embryons UAS-lbe 24B-GAL4 > ont montré une expansion marquée de l’expression lb dans le cœur (Fig. 4G), conduisant au contact anormal du COMs avec la pointe du cœur. Plus précisément, nous avons constaté que les COM se fixent directement aux cellules cardiaques les plus antérieures qui forment l’écoulement cardiaque (astérisque sur la Fig. 4G) et non à la deuxième paire de cellules cardiaques comme dans le WT (Fig. 4D). La connexion altérée des COM résulte très probablement des signaux attractifs ectopiques générés par l’expression cardiaque élargie de lb. En conséquence, la flexion ventrale de la partie la plus antérieure du cœur était plus prononcée (voir fig. 4 D et G). Nous avons également remarqué une morphologie altérée des COM (pointe de flèche ouverte sur la Fig. 4 D et G), ce qui pourrait résulter de l’expression musculaire ectopique de lb entraînée par le 24B-GAL4. Le contact entre les HANCs et les cellules cardiaques n’a pas été affecté par les conditions expérimentales de mauvaise expression. Pour tester si l’expression de lb cardiaque est nécessaire à l’attraction des COM, nous avons tiré parti de l’influence régulatrice négative décrite précédemment de l’eve (even-skipped) qui est capable de réprimer spécifiquement lb dans les cellules cardiaques (5). Encore une fois, les lignes effectrices 24B-GAL4 et Tin-GAL4 ont été utilisées pour stimuler l’expression d’eve dans le cœur. Nous avons constaté que ces deux conducteurs croisés avec la ligne UAS-eve (Tin-GAL4 avec pénétrance inférieure) conduisent à la répression de l’activité lb dans le cœur (Fig. 4 H et I). Malgré les défauts de spécification erronée, les primordiums cardiaques se forment normalement dans le gain de la veille du SAMU des embryons fonctionnels (réf. 5 et Fig. 4B), nous permettant de surveiller les COM et les HANCs dans un contexte où l’expression cardiaque de lb est appauvrie. Nos données montrent que dans de tels embryons appauvris en lb (voir l’absence d’expression cardiaque de lb à la Fig. 4 H et I) les COM ne s’attachent pas au bout du cœur. Nous avons observé que les COM s’étendaient antérieurement et s’attachaient à des HANCs invaginants (Fig. 4 H et I), qui ne sont plus en mesure d’ancrer correctement la pointe du cœur. La branche COM principale qui se fixe normalement à la région de sortie cardiaque (voir Fig. 4 E et F avec H et I) était absent ou fusionné avec la branche de fixation du HANC. Ainsi, nous pensons que la forme anormale de COM et une perte complète de son contact avec la pointe du cœur sont causées par une déplétion cardiaque de lb. Cette hypothèse est corroborée par le fait que les mêmes phénotypes ont été observés chez des embryons présentant une expression cardiaque ectopique (pilotée par Tin-GAL4) et cardiaque plus musculaire (pilotée par 24B-GAL4) d’eve (voir Fig. 4 H et I). Le contact et le positionnement altérés des COM sont apparus chez des embryons de stade avancé 14 lorsque la chaîne lourde de la myosine n’est pas encore détectable chez les cardioblastes (Fig. 4 E et H). L’analyse des embryons de stade 15 a en outre révélé que la perte d’expression de lb cardiaque s’accompagne d’une régulation à la baisse de la β3-tubuline (voir Fig. 4 F et I) dans la région de sortie cardiaque, indiquant que l’expression de lb dans le cœur a un impact important sur la morphogenèse cardiaque finale. Ces données complètent les rapports récents décrivant les rôles morphogénétiques d’un membre de la famille des récepteurs COUP-TF, Sept-up, exprimés dans la paire postérieure de cardioblastes dans chaque segment et nécessaires à la formation d’ostie dans les segments abdominaux A5–A7 (32, 33). Dans ce contexte, la démonstration du rôle de lb dans la structuration de la région d’écoulement cardiaque augmente la possibilité que dans les segments abdominaux lb joue un rôle similaire dans l’établissement du contact entre les cellules cardiaques et les muscles alaires d’ancrage cardiaque. Cette hypothèse reste à étudier.

De plus, les phénotypes présentés (Fig. 4) suggèrent que l’expression lb appauvrie expérimentalement dans le cœur influence l’émission ou la réception de signaux attractifs par les cellules cardiaques et entraîne par conséquent la perturbation du contact avec les COM. Le même attractif musculaire ou similaire est susceptible d’être produit ou reçu par des HANCs lb-positifs, suggérant ainsi que lb régule l’expression des gènes impliqués dans le contact cellule–cellule. Fait intéressant, chez l’homologue lb de souris, le gène Lbx1 s’est avéré nécessaire à la migration dirigée d’un sous-ensemble de précurseurs musculaires (21, 22), ce qui indique qu’il pourrait exister des mécanismes de mouvement cellulaire conservés qui sont contrôlés par des gènes lb.

Ensemble, grâce à l’analyse d’embryons dans lesquels l’expression de lb cardiaque a été étendue ou appauvrie expérimentalement, nous avons démontré que la lb est nécessaire à la fixation correcte des HANCs et des COM et, par conséquent, à la bonne structuration de la région d’écoulement cardiaque. Cette découverte donne un aperçu de la signification fonctionnelle de la diversification antéro-postérieure des précurseurs cardiaques dans chaque segment du cœur de la Drosophile.

Les HANCs peuvent-ils représenter un Prototype de Drosophile de Cellules de Crête neurale ? La morphogenèse cardiaque des vertébrés implique deux types de cellules différentes, les primordiums cardiaques mésodermiques et une sous-population de cellules de la crête neurale qui migrent de la région de la tête. Dans cet article, nous avons montré que chez la Drosophile, un groupe de cellules non mésodermiques provenant de l’épiderme de la tête (que nous avons nommé les HANCs) contribue à la morphogenèse finale du cœur. Comme dans les cellules de la crête neurale des vertébrés, les HANCs subissent des mouvements dirigés, entrent en contact avec les cellules cardiaques et participent à la structuration de la région d’écoulement cardiaque. Nous avons démontré que les gènes homéobox lb connus pour être impliqués dans la diversification des précurseurs cardiaques (5, 11) sont exprimés en HANCs et sont nécessaires à leur spécification. De même, l’orthlog de lb, le gène Lbx1, s’est récemment avéré nécessaire pour la spécification d’un sous-ensemble de cellules de la crête neurale cardiaque chez la souris (23), indiquant que les gènes lb /Lbx1 jouent un rôle conservé dans la spécification des composants non mésodermiques du cœur. De ce point de vue, les HANCs pourraient en effet être comparés aux cellules de la crête neurale des vertébrés. Cependant, nos données indiquent également que les HANCs présentent au moins deux caractéristiques spécifiques à la Drosophile uniquement: (i) ils se déplacent comme une partie de l’ectoderme de la tête repliée et non comme des cellules de la crête neurale délaminées; et (ii) ils forment un complexe fonctionnel avec des COM, qui n’ont pas de structures homologues chez les vertébrés. Ainsi, d’autres analyses sont nécessaires pour élucider le rôle exact des HANCs et leurs fonctions cellulaires potentielles de la crête neurale.