synnynnäisen immuunijärjestelmän myelooinen osasto koostuu useista solutyypeistä, joiden tehtäviin kuuluu vaurioituneiden ja apoptoottisten solujen puhdistuminen, antigeenin esiintyminen, immunosuppressio ja isännän suojaaminen vierailta mikro-organismeilta.

monosyytit edustavat erittäin muovista solujen alaryhmää, joka muodostaa synnynnäisen immuunijärjestelmän. Nämä solut pystyvät kulkemaan verisuoniston läpi, ja altistuessaan tietyille sytokiineille ne erilaistuvat eri solutyypeiksi. Kiertävät monosyytit luokitellaan joko ei-klassisiksi tai klassisiksi, ja ne voidaan erottaa niiden solujen pintareseptoriekspressiomallin perusteella. Klassiset monosyytit verenkierrossa näyttävät CD14 + + + Hi / CD16 – / lo ja niitä esiintyy erityisesti infektio-tai tautipaikoilla (1,2).

ihmisen ei-klassiset monosyytit verenkierrossa näyttävät cd16+++Hi/CD14+ / lo pintaekspression (1). Aktivaation jälkeen monosyyteissä tapahtuu useita morfologisia ja biokemiallisia toiminnallisia muutoksia, jotka johtavat monosyyttien erilaistumiseen uusiksi solutyypeiksi, kuten makrofageiksi (3).

klassiseksi aktivaatioksi kutsutussa paradigmassa ihmisen monosyyteillä on fenotyyppinen plastisuus, joka voidaan aloittaa altistumalla th1—vastetta edistävälle sytokiini-interferoni-γ: lle (IFN-γ) tai tuumorinekroositekijä α: lle (TNF-α) sekä endotoksiini-lipopolysakkaridille (LPS) (4,5). Tämä klassisen aktivaation mekanismi tuottaa M1-makrofageja, jotka tuottavat tulehdusta edistäviä välittäjäaineita, jotka suojaavat isäntää bakteereilta ja viruksilta (6). Ihmisen monosyytit voidaan myös erilaistaa M2-makrofageiksi altistumalla th2-vastetta edistäville sytokiineille kuten interleukiini-10: lle (IL-10) ja muuntavalle kasvutekijä-β: lle (TGF-β) (4,7). M2-makrofagit ilmentävät korkeita CD206-(mannoosireseptori) ja CD163-pitoisuuksia, tuottavat alhaisia proinflammatorisia sytokiinipitoisuuksia ja edistävät haavan paranemista ja matriisin remodelaatiota.

dendriittisolut (DCS) ovat toinen joukko monosyyttipohjaisia immuunisoluja, joiden tehtävänä on esittää antigeenejä T-soluille adaptiivisen t-solupohjaisen immuunivasteen käynnistämiseksi. DCs voidaan luokitella pitkälti kolmeen alaryhmään: klassiset (CDC), plasmasytoidit (pdcs) ja monosyyttijohdokset (modc). CDC: t ovat tyypillisesti imukudoksessa, pernassa, imusolmukkeissa ja luuytimessä. PDC: t muistuttavat plasmasoluja ja niitä esiintyy tyypillisesti verenkierrossa (8). Monosyytit voivat erilaistua DCs: ksi, joita usein kutsutaan monosyyttiperäisiksi DCS: iksi (moDCs) granulosyyttien makrofagikasvuston stimulaatiotekijälle (GM-CSF) ja IL-4: lle (9,10) altistumisen jälkeen. modc – yhdisteiden on raportoitu ilmentävän solujen pinnan markkereita CD80, CD83, CD86 ja CD1a in vitro (11-13). Vaikka modc: t eroavat makrofageista solujen muodoltaan ja toiminnaltaan, niillä on yhteisiä ilmentymiä useiden solujen pinta-antigeenien, kuten CD11c: n, CD206: n ja CD1a: n (14) kanssa.

useat ryhmät ovat raportoineet ihmisen CD14+ – monosyyttien onnistuneesta erilaistumisesta makrofageiksi; monet näistä julkaistuista protokollista ovat kuitenkin erilaisia. Yhteinen vaihtelu näiden menetelmien välillä on IL-6: n sisällyttäminen (15) tai pois jättäminen (16). Toinen ero protokollien välillä on hoidon ajoitus. Tämä protokollien epäjohdonmukaisuus on ongelmallista.

näiden ongelmien ratkaisemiseksi tutkimme ja vertailimme IL-6: n sisällyttämistä ja jättämistä pois sytokiinihoidosta, jota käytetään yleisissä ihmisen monosyyttien erilaistumismenetelmissä. Havaitsimme, että IL-6: n puuttuessa nämä strategiat tuottavat soluja, joilla on alhainen homogeenisuus, mikä voi tuottaa monitulkintaisia kokeellisia tuloksia. Toiseksi ongelman ratkaisemiseksi kehitimme uuden vaiheittaisen in vitro-strategian, johon sisällytettiin IL-6. Havaitsimme, että tämä strategia paransi huomattavasti M1-ja M2-makrofagien sekä ihmisen CD14+ – monosyyteistä erotettujen modc-solujen homogeenisuutta. Tämä menetelmien parantaminen tarjoaa tutkijoille parempia malleja immuunijärjestelmän ja tautitilojen tutkimiseen.

materiaalit ja menetelmät

Soluvalmisteet

Buffy-päällysteet kerättiin viiden tai useamman terveen miesluovuttajan kokoverestä, jotka oli yhdistetty. Perifeerisen veren mononukleaarisolut (pbmcs) valmistettiin Buffy-päällysteistä Ficoll-Paquen (1.077 g/mL tiheys) (17-1440-02; GE Healthcare Bio-sciences, Piscataway, NJ) tiheysgradientti sentrifugoimalla 400 × g 18°C: ssa 35 minuutin ajan veren ainesosien erottamiseksi. Kennot pestiin useita kertoja 1× PBS: n avulla ja laskettiin Nexcelom Cellometer Auto T4 plus-solulaskurilla (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA). Kun CD14+ – monosyytit oli laskettu, ne eristettiin pbmc: stä magneettisella merkinnällä käyttäen MAB CD14-konjugoituja mikrobeja (130-050-201; Miltenyl Biotec, San Diego, CA), jonka jälkeen se erotetaan magneettisten kolonnien avulla (130-042-401 ja 130-042-302; MILTENYL Biotec) valmistajan ohjeiden mukaisesti, yhtä poikkeusta lukuun ottamatta: kun CD14+ – soluja kerätään magneettisesta kolonnista, solut huuhdeltiin pois aluksi 5 mL: n puskurilla pelkästään painovoiman varassa (ilman mukana toimitettavaa mäntää). 5 mL: n ensimmäisen huuhtelun jälkeen lisättiin 5 mL puskuria ja huuhdeltiin varovasti mukana toimitetulla männällä.

soluviljelmä

ihmisen CD14+ monosyytit siemensivät solutiheydeltään 2, 0–3.0 × 105 solua/mL rpmi 1640-väliaineessa, jossa on 2 mM/L L-glutamiinia (Life Technologies, Frederick, MD) täydennettynä 10%: n kuumuudella inaktivoidulla FBS: llä (Sigma, Carlsbad, CA), 100 U/mL penisilliinillä (Life Technologies) ja 100 mg/mL streptomysiinillä (Life Technologies) 37°C: ssa kostutetussa 5% CO2-inkubaattorissa. Solujen erottamiseen M1-makrofageiksi käytettiin sytokiineja GM-CSF (20 ng/mL) (PeproTech, Rocky Hill, NJ), IFN-γ (20 ng/mL), IL-6 (20 ng/mL) ja endotoksiini LPS (20 ng / mL). M2: n makrofagien erilaistumisessa käytetyt sytokiinit olivat makrofagiyhdyskuntaa stimuloiva tekijä (M-CSF), IL-4, IL-6 ja IL-13 pitoisuuksina 20 ng/mL (PeproTech). modc: t syntyivät lisäämällä GM-CSF: ää (100 ng/mL) ja IL-4: ää (20 ng/mL). Kunkin strategian ajoitusta kuvataan tarkemmin kuvassa 1.

Virtaussytometria

polarisoituneita makrofageja ja DCs: ää viljeltiin 9 päivän ajan 10 cm2 astioilla (BD Falcon, Billerica, MA). Päivänä 9 kerättiin väliaineet ja ei-kiinnittyneet solut; kiinnittyneet solut pestiin käyttäen 1× PBS: ää, poistettiin solujen dissosiaatiopuskuria (Life Technologies) käyttäen ja sitten lisättiin kerättyihin väliaineisiin/ei-kiinnittyneisiin soluihin pestäväksi. Suspendoidut solut sentrifugoitiin ja pestiin kahdesti (1× PBS, 0, 5% BSA: Ta, 2 mM EDTA: ta), laskettiin ja inkuboitiin fluoriforikonjugoiduilla primaarisilla vasta-aineilla CD206: ta (FITC), CD36: ta (PE), CD163: a (PE-Cy7), e-cadherinia (Alexafluori488), CD86: ta (PE), CD1a: ta (FITC), CD83: a (PE), CD80: tä (PE), CD124: ää (pe) vastaan ja cd64 (FITC) pimeässä 45 min 4°C: ssa.fluoresenssi havaittiin S3TM-solulajittelijalla (Bio-Rad, Hercules, ca).

Endosytoosimääritys

polarisoituneet ihmisen makrofagit pinnoitettiin 4-kuoppakammioisiksi lasilevyiksi (MA nunc Lab-Tek II, Thermo Scientific, Waltham, MA) tiheydellä 3.0 × 105 solua/mL 7.päivänä, ja sitä jatkettiin viljelemällä sopivia sytokiineja jäljellä olevien 2 päivän ajan. Peryleeni bisimidi (PBI-12-Man) (17) oli ke-Rang Wangilta Hebein yliopistossa saatu ystävällinen lahja. Soluja viljeltiin 10 µg/mL PBI-12-Man-viljelmällä 30 minuutin ajan 37°C: n lämpötilassa, minkä jälkeen ne pestiin 1× PBS: llä. Kennot kiinnitettiin 70-prosenttisella etanolilla ja asennettiin Dapi: llä (P36962; Life Technologies). PBI-12 Man: n endosytoosin visualisoimiseksi diat jännittyivät ja lähtivät 585 nm: ssä. Punaiset fluoresenssikuvat kvantitoitiin Metafer-slideskannausohjelmiston (MetaSystems, Boston, MA) avulla. Tilastollinen testaus tehtiin käyttäen MATLAB R2015a-ohjelmistoa (The Mathworks, Inc., Natick, MA). Rank-sum-testeissä testattiin univariaattista tilastollista merkitsevyyttä näytteiden välillä.

immunofluoresenssi

makrofagit eriytettiin aiemmin kuvatuilla menetelmillä 7 päivän ajan ja siirrettiin sitten nunc Lab-Tek II: n 4-porauskammion dioihin sopivilla sytokiineillä. Solut jätettiin kasvamaan seuraavan 7 päivän ajan; 14 päivän kuluttua alkuperäisestä pinnoituksesta solut kiinnitettiin 70% etanolilla ja asennettiin käyttämällä pitkittää timantti Anti-fade mountant kanssa DAPI. Solut visualisoitiin faasikontrasti – ja fluoresenssimikroskopialla EVOS FL Auto (Life Technologies) – laitteella.

tulokset ja keskustelu

ihmisen CD14+ monosyyttien erilaistumisen strategiat ja edellytykset

aloitimme arvioimalla, mitkä strategiat olivat tehokkaimpia ihmisen M1-ja M2-makrofagien sekä modc-yhdisteiden homogeenisten populaatioiden tuottamisessa. Ihmisen CD14 + – monosyytit eristettiin ja kylvettiin kudosviljelylevyille erilaistumaan makrofageiksi tai mods: iksi in vitro. Tämän jälkeen testasimme kolmea erityistä käsittelyolosuhdetta määrittääksemme menetelmän, jolla saatiin tasaisimmat makrofagi-ja moDC-populaatiot. Ensimmäisessä tapauksessa viljelimme soluja lisäämällä vain GM-CSF: ää tai M-CSF: ää 9 päivän ajan (Kuva 1). Tätä ehtoa kutsutaan ”vain” (kuva 1). Toinen hoitostrategia oli altistaa solut jatkuvasti sovellettavalle sytokiinimiljöölle päivänä 0, täydentää väliainetta, sytokiineja ja LPS: ää päivänä 5 ja analysoida soluja päivänä 9. Tätä ehtoa kutsutaan ”jatkuvaksi” (Kuva 1). Kolmas strategia oli stimuloida CD14 + -monosyyttejä joko GM-CSF: llä tai M-CSF: llä 5 päivän ajan, minkä jälkeen lisättiin tuoreita elatusaineita, jotka sisältävät LPS: ää ihmisen M1-makrofageille ja kaikkia soveltuvia sytokiineja tietylle hoitoryhmälle (GM-CSF, IFN-γ ja IL-6 M1-makrofageille tai M-CSF: lle, IL-4, IL-13 ja IL-6 m2-makrofageille). Tätä hoitostrategiaa kutsuttiin vaiheistetuksi (Kuva 1). CD14+-monosyyttien käsittely 100 ng/mL: lla GM-CSF: ää ja IL-4: ää 5 päivän ajan ja väliaineen ja kaikkien sytokiinien korvaaminen 5.päivänä tuotti modc-yhdisteitä. Modc: t stimuloitiin sitten IL-6: lla ja LPS: llä 24 tunnin ajan ennen analysointia (päivä 8) DC: n kypsymisen ja aktivoitumisen edistämiseksi. Tätä viljelymenetelmää kutsuttiin ”stimuloiduksi” (Kuva 1). Modc: t, jotka eivät koskaan saaneet IL-6-ja LPS-altistusta, nimettiin ”ei-stimuloiduiksi” (Kuva 1). Solujen pintareseptorin ilmentyminen ja solujen toimivuus analysoitiin 9 päivän viljelyn jälkeen edellä kuvatuissa erityisolosuhteissa.

IL-6-altistus lisää M2-polarisaation tehokkuutta in vitro

aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että makrofagialtistus sytokiini IL-6: lle ei ainoastaan vääristä monosyyttien erilaistumista dendriittisolusta makrofagi-fenotyyppiin, vaan että IL-6-altistus myös lisää m2-makrofageihin liittyvää mRNA-ekspressioprofiilia (15,18). Näiden havaintojen vahvistamiseksi ja IL-6: n vaikutuksen M1-ja M2-polarisaatioon testaamiseksi ihmisen CD14+ – monosyyttejä jatkuvassa ja vaiheittaisessa viljelyssä käsiteltiin IL-6: lla tai ilman sitä. M2-makrofagin pintamarkkeriekspression tutkiminen M1-erilaistuneissa soluissa ei osoittanut merkittäviä muutoksia, kun sitä viljeltiin IL – 6: lla (kuva 2), mikä viittaa siihen, että IL-6-hoito ei siirrä M1-polarisoituneita makrofageja kohti m2-fenotyyppiä.

vastaavasti jatkuvan ja vaiheittaisen m2-makrofagiviljelmäryhmän analyysi paljasti, että IL-6-käsittely lisäsi m2-makrofagin pintamarkkereiden ilmentymistä. M2-makrofagipopulaatioissa sekä CD206: n että CD36: n ilmentyminen pysyi korkeana ja näytti muuttumattomalta, kun ne altistettiin IL-6: lle (kuva 2, A ja B). CD163: n ja E-cadherinin pinta-ekspressiotasot ja populaation homogeenisuus lisääntyivät kuitenkin merkittävästi, kun niitä hoidettiin IL-6: lla (kuva 2, C ja D). Tämä näkyy matalasti ilmentyvien CD163-ja E-cadheriinihuippujen pienenemisenä (punaiset nuolet kuvassa 2, C ja D) ja siitä johtuvana siirtymisenä kohti homogeenisesti korkeasti ilmentävää populaatiota.

IL-6: ta käytetään usein modc: n kypsymisen (18,19) indusoimiseen. Sen määrittämiseksi, voisiko IL-6-hoito aiheuttaa ei-toivottuja modc-yhdisteitä makrofagipolarisoituneissa populaatioissa, tutkittiin mature DC surface marker (CD83) – lauseketta. Virtaussytometrinen analyysi osoitti, että mitkään M1-tai M2-viljelyolosuhteet eivät edistäneet CD83-ekspression merkittävää lisääntymistä (Kuva 2e). Tämä viittaa siihen, että näissä makrofagipopulaatioissa ei ollut moDC-kontaminaatiota tai että kontaminoivat modc-yhdisteet olivat IL-6-epäherkkiä.

vaiheittainen polarisaatio johtaa kanonisten M1 -, M2-ja moDC-solujen pintamarkkereiden lisääntyneeseen ilmentymiseen

sen varmistamiseksi, että ihmisen CD14+ – monosyytit olivat täysin erilaistuneet joko makrofageiksi tai mods: iksi päivään 9 mennessä, virtaussytometriaa käytettiin solujen pintamarkkereiden analysointiin ja morfologisten erojen arviointiin (kuva 3, A-C). Ihmisen CD14+ – monosyytit eriytettiin (Kuva 1) sen arvioimiseksi, mikä strategia tuottaisi solutyypin kannalta sopivien pintamarkkereiden voimakkaan ilmentymisen. Kullekin solutyypille testattiin solupinnan merkkiaineiden paneeli. M1-kennopintainen merkkipaneelimme koostui kanonisista markkereista CD86 ja CD80 (kuva 3, A-C). M2-makrofagipaneelissa käytimme CD206: ta, CD163: a, CD124: ää (IL-4-reseptori-α), e-cadherinia ja CD36: ta (luokka B-haaskareseptori) (kuva 3, A-C). Modeissa käytettiin CD83: a, CD86: ta ja CD1a: ta. Kaikkien testattujen merkkiaineiden pinta-ekspressiotasot määritettiin kaikille solutyypeille (täydentävä Kuva S1). Fluoresenssin intensiteetin mediaani (MFI) laskettiin ja esitettiin kertamuutoksena suhteessa vastaavaan kontrolliin, jota ei ole kontrolloitu (KS.taulukot Kuvassa 3).

mielenkiintoista on, että analyysi m2-solujen pinnan markkereista, CD36: sta ja IL-4RA: sta, M1 GM-CSF-vain polarisoituneissa makrofageissa paljasti dramaattisen kasvun (Kuva 3A). Verrattaessa pelkästään GM-CSF: llä hoidettuja soluja kaikkiin M1-hoitoryhmiin, pelkällä GM-CSF: llä oli selvästi suurempi cd36-ilmentymä. Nämä vain GMO-CSF-solut ilmaisivat myös alhaisia pitoisuuksia M1-merkkiaineissa CD86 ja CD80. Vastaavasti jatkuva tila tuotti soluja, jotka olivat alhaisia CD86: ssa ja CD80: ssä, mutta myös korkeita CD36: ssa ja IL-4RA: ssa. Vastaavasti kun ihmisen CD14+ – monosyytit erilaistuivat M1-vaiheistuksessa, CD86 ja CD80 olivat huomattavasti säädellympiä, kun taas CD36 ja IL-4RA-ilmentymä jäi vähäiseksi. Solupinnan merkkiekspression virtaussytometrinen analyysi osoitti, että M1-makrofagien cd206 -, CD36-ja CD163-ilmentymä oli pienempi kuin m2-makrofagien sekä vaiheittaisessa että jatkuvassa altistuksessa (täydentävät luvut S1 ja S4). Lisäksi nämä vaihtelevat viljelyolosuhteet tuottavat soluja, joilla on erilliset morfologiset ominaisuudet ja rakenne (kuva 3A). Vaikka GM-CSF – vain käsitellyt solut näyttävätkin suuremmilta, forward scatter (FSC) – tiedot osoittivat ryhmien väliset kokoerot vähäisiksi (täydentävät luvut S2 ja S3). Sisäisen monimutkaisuuden (SSC) vertailu käsittelyolosuhteiden välillä osoitti rakeisuuden lisääntyneen GM-CSF: ssä ja vaiheistetuissa ryhmissä (täydentävä Kuva S2). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että GM-CSF-vain ja jatkuva käsittely tuottavat soluja, jotka ilmentävät alhaisia M1-merkkiaineiden ja korkeita tiettyjen M2-merkkiaineiden pitoisuuksia sekä osoittavat morfologisia muutoksia.

m2 makrofagiviljelyolosuhteista saatiin hieman epäselvempiä tuloksia kuin M1-makrofagiviljelyolosuhteista (kuva 3B). Verrattuna vain M-CSF-ryhmään, vaiheistetuissa ja jatkuvissa ryhmissä CD206: n ilmentymistasot olivat koholla. Sen sijaan IL-4RA: n pintatasot olivat huomattavasti korkeammat vain M-CSF-olosuhteissa sekä jatkuvaan että vaiheittaiseen käyttöön suhteutettuna. E-cadherinin lauseke pysyi yhtenäisenä kaikissa ryhmissä, kun taas CD163 oli huomattavasti korkeampi sekä vain M-CSF-että phased-ryhmissä. Yksi huomionarvoinen seikka on, että jatkuvan altistuksen ryhmä oli johdonmukaisesti paljon vähemmän homogeeninen solun pinnan merkkiilmaisun osalta. Tätä havainnollistavat histogrammista löytyvä bimodaalijakauma ja suuri ekspressiotasojen varianssi. Lisäksi hoitoryhmien välillä on nähtävissä dramaattisia morfologisia eroja. Faasikontrastikuvien perusteella vain M-CSF-ryhmä tuotti soluja, jotka vaikuttavat pienemmiltä ja erittäin rakeisilta (kuva 3B). Virtaussytometrinen analyysi osoittaa, että nämä solut ovat samankokoisia (FSC), mutta solujen rakeisuus lisääntyy vaiheistetuissa ja jatkuvissa käsittelyolosuhteissa (täydentävä Kuva S2). Lopuksi glutamiinipuutos muutti M2-polarisaatiota, mikä osoittaa, että metaboliset tuotteet ovat välttämättömiä tämän strategian mukaisesti (täydentävä Kuva S5). Kaiken kaikkiaan nämä tiedot viittaavat siihen, että vaiheistetut olosuhteet tuottavat suurimman tehokkuuden M2 makrofagin polarisaatiolle.

tämän jälkeen tarkasteltiin sellaisten modc-yhdisteiden pintamarkkeriekspressiota, joita ei stimuloitu tai stimuloitiin IL-6: lla ja LPS: llä 24 tuntia ennen virtaussytometristä analyysia. IL-6: n ja LPS: n stimulointi johti CD80: n, CD83: n ja CD86: n ilmaisun lisääntymiseen (Kuva 3C). Kypsän TASAVIRTAMERKIN cd83 solun pinnan ekspressio lisääntyi dramaattisesti aktivoituessa IL-6: n ja LPS: n avulla 8.päivänä verrattuna stimuloimattomaan ryhmään. Tämä vahvisti, että IL-6 ja LPS pystyivät edistämään dendriittisolujen kypsymistä (täydentävä Kuva S1L). CD1a-lauseke pysyi yhtenäisenä stimuloimattomien ja stimuloimattomien ryhmien välillä. Mielenkiintoista on, että stimuloidut DCs: t pysyivät suspensiossa, mutta ne näyttivät alkavan kasautua ja kiinnittyä toisiinsa (Kuva 3C). Nämä tulokset vahvistavat aiempia modc-polarisaatiota koskevia havaintoja ja tarjoavat lisäkontrollin pintamarkkerianalyysille, jonka avulla voidaan tunnistaa ei-toivottuja moDC-populaatioita makrofagiviljelyn eri olosuhteissa.

m2-makrofageilla, jotka syntyvät vaiheittaisessa sytokiinialtistuksessa, on m2-liitännäinen toiminnallisuus

mannoosireseptori (CD206) on endosyyttinen ja kierrätysreseptori, jota esiintyy voimakkaasti m2-makrofagipopulaatioissa vaiheittaisissa käsittelyolosuhteissa. Seuraavaksi halusimme arvioida CD206-välitteistä endosyyttistä kertymää makrofageissamme. Tämä määritettiin käyttämällä PBI-12-Mania, bioyhteensopivaa ainetta, joka fluoresoi sitoutuessaan mannoosireseptoriin (17). Kun sekä M1-että M2-makrofageja oli käsitelty 1 tunnin ajan PBI-12-Man-valmisteella, PBI-12-Manin punainen fluoresenssi oli pääasiassa solunsisäistä M2-makrofageissa vaiheittaisissa ja jatkuvissa käsittelyolosuhteissa (Kuva 4, A ja B). Tämä havainto viittaa siihen, että solujen pinnan sitoutuminen CD206: een ja endosytoosi johtavat vesikulaarien lokalisointiin. Tämä on samaa mieltä aiempien virtaussytometriatietojen kanssa, jotka osoittivat, että vaiheittaisissa käsittelyolosuhteissa m2-makrofageilla oli suurempi cd206: n ilmentymä solun pinnalla suhteessa M1-makrofagipopulaatioon. Mielenkiintoista, havaitsimme, että GM-CSF-vain solut osoittivat korkeita PBI-12-ihmisen endosytoosia (Kuva 4, A ja B). Tämä korreloi virtaussytometristen tietojemme kanssa (kuva 2), jotka osoittivat, että vain GM-CSF-viljelyolosuhteet tuottavat M1-soluja, joissa on m2-pintamarkkeriilmaisu. Kaiken kaikkiaan osoitamme, että näillä soluilla oli makrofagien normaalit ominaisuudet ja että CD206 toimi m2-makrofagipopulaatiossa.

14 päivän viljelyn jälkeen M2-makrofageilla oli myös kyky sulautua, sillä niiden koko oli yli 200 µm ja ne sisälsivät useita tumia solua kohti (Kuva 4C). Nämä muistuttivat moninukleoituja jättisoluja (Mngc), joilla on raportoitu olevan fagosyyttisiä ja muita kykyjä (20). Lisäksi Mngc: t on yhdistetty kehon vieraaseen materiaaliin, tuberkuloosiin ja syöpään (20-23). Tämä solufuusio löytyi yksinomaan m2-makrofagipopulaatioistamme ja oli paljon merkittävämpi m2-vaiheistetussa tilassa. Vaikka vain M-CSF-ryhmillä oli joitakin monitumaisia soluja (Kuva 4C), niiden koko ja lukumäärä olivat paljon pienempiä kuin vaiheistetulla ryhmällä. Kun otetaan huomioon näiden solujen kyky suorittaa tämä makrofagiin liittyvä toiminto, nämä tulokset osoittavat edelleen, että vaiheittaisissa viljelyolosuhteissa syntyy hyvin M2: n kaltaisia makrofageja.

tässä kuvasimme vasta kehitettyä vaiheistettua protokollaa makrofagipolarisaatiolle. Huomasimme, että IL-6: n sisällyttäminen ja vaiheittainen polarisaatiohoidon ajoitus ovat ehdottoman kriittisiä M1 – ja M2-kaltaisten makrofagien tuottamisessa in vitro. Löydöstä testattiin tiukasti verrattuna muihin polarisaatiomenetelmiin. Tästä syystä uskomme, että vaiheittainen polarisaatiomenetelmä on merkittävä edistysaskel. Tämä antaa tutkijoille yhtenäiset kokeelliset standardit tuottaa homogeenisia makrofagipopulaatioita in vitro-käyttöön ja mahdollisuuden vertailla niiden tuloksia. Vaikka tämä protokolla tarjoaa useita parannuksia nykyisiin polarisaatiostrategioihin verrattuna, uskomme, että lisätutkimus ja optimointi altistusajoista ja sytokiinicocktailista olisi hyödyllistä. Tämä auttaa meitä ymmärtämään M1-ja M2-makrofagien monimutkaisia rooleja sairauden eri etenemismuodoissa ja edistää uudenlaisten terapeuttisten menetelmien kehittämistä.

kiitokset

tämän tutkimuksen tutkimusta tukivat National Cancer Institute grants U54CA143803, CA163124, ca093900, ca143055, UNCF / Merck Postdoctoral Science Research Fellowship award (J. C. Z.) ja yhteistyöpalkinto Medimmune, LLC. Kiitämme Amanda Brownia, Dionna W. Williamsia, J. James Frostia, Kris Sachsenmeieria (MedImmune, LLC.), Robert Hollingsworth (Medimmune, LLC.), David M. Mosser (Marylandin yliopisto), Suzanne Ostrand-Rosenberg (Marylandin yliopisto-Baltimoren piirikunta), Cherie Butts (Biogen) ja Donald S. Coffey heidän hedelmällisiä keskusteluja tästä työstä. Tätä asiakirjaa koskee NIH: n Julkisuuspolitiikka.