Abstract

Understanding which are the catalytic residues in an enzymes and what function they perform is critical to many biology studies, especially those leading to new therapeutics and enzyme design. Vuonna 2004 julkaistussa Catalytic Site Atlaksen (http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/CSA) alkuperäisessä versiossa, jossa luetellaan entsyymin katalyysiin liittyvät jäämät kokeellisesti määritetyissä proteiinirakenteissa, oli vain 177 kuratoitua merkintää, ja siinä käytettiin yksinkertaistettua lähestymistapaa näiden merkintöjen laajentamiseksi homologisiin entsyymirakenteisiin. Tässä esittelemme uuden version CSA: sta (CSA 2.0), joka laajentaa huomattavasti sekä kuratoitujen (968) että automaattisesti merkittyjen katalyyttipaikkojen määrää entsyymisektoreissa käyttäen uutta merkintöjen siirtomenetelmää. Kuratoituja merkintöjä käytetään yhdessä sekvenssivertailusta peräisin olevan jäämätyypin vaihtelun kanssa katalyyttipaikkojen 3D-mallien tuottamiseen, joita puolestaan voidaan käyttää katalyyttipaikkojen löytämiseen uusista rakenteista. CSA-merkintöjen siirtämisen helpottamiseksi muihin resursseihin on kehitetty uusi ontologia: Entsyymimekanismin ontologia, joka on mahdollistanut merkintöjen siirtämisen mekanismiin, merkintöihin ja luokitteluun entsyymeissä (MACiE) ja UniProt Knowledge Base (UniProtKB) – resursseihin. CSA: n tietokantarakenne on suunniteltu uudelleen ja sekä CSA: n data-että hakuominaisuudet esitetään uudessa modernissa web-käyttöliittymässä.

johdanto

entsyymit edustavat ∼45% kaikkien genomien kollektiivisista proteiinituotteista, jotka on luetteloitu muun muassa uniprot Knowledge Base (UniProtKB) (1). Biologisina katalyytteinä ne helpottavat monia aineenvaihduntaprosesseja ja reittejä, jotka ovat elintärkeitä elämän olemassaololle ja ovat olleet biologien ja kemistien tutkimusten kohteena jo yli 100 vuoden ajan. Ne ovat myös joitakin lääkekehityksen pääkohteita, ja monet hyväksytyt lääkkeet vaikuttavat muuttamaan sairausprosesseihin osallistuvien entsyymien toimintaa. Lisäksi ne ovat usein bioteknologian sovellusten keskipisteitä. Yksityiskohtaiset tiedot katalyyttijäämistä ja entsyymiaktiivisista kohdista ovat olennaisen tärkeitä proteiinin rakenteen ja toimintojen, inhibiittorien rakenteen ja entsyymin rakenteen välisen suhteen ymmärtämiseksi.

Catalytic Site Atlas (CSA) (2) perustettiin antamaan kuratoituja merkintöjä hyvin säilyneistä jäämistä, jotka osallistuvat suoraan katalyyttiseen toimintaan entsyymeissä, joiden rakenteet on talletettu Proteiinitietopankkiin (PDB) (3). Näitä kuratoituja merkintöjä voidaan puolestaan käyttää katalyyttisten jäämien päättelyyn muissa entsyymirakenteissa homologian avulla yksinkertaisella PSIBlast-menetelmällä.

Alkuperäinen resurssi sisälsi 177 käsin kirjoitettua merkintää ja 2608 homologista merkintää, ja se kattoi ∼30% kaikista ATE: n sisältämistä EY-numeroista. Esittelemme tässä uuden version katalyyttisen sivuston Atlas-CSA 2.0. Olemme lisänneet merkittävästi kuratoitujen merkintöjen määrää 968: aan ja ottaneet käyttöön uuden kehittyneemmän menetelmän, jolla merkinnät siirretään homologisiin rakenteisiin, mikä lisää merkintöjen siirron kestävyyttä. Kuratoitujen merkintöjen laajentaminen mahdollistaa myös uusien 3D-rakennemallien lisäämisen, joita on käytetty katalyyttisen Sivustohakupalvelun uudistuksessa. Lisäksi tietokannan skeema on suunniteltu uudelleen, integroimalla se entsyymimekanismien sisarkantaan: mekanismi, huomautus ja luokittelu Entsyymitietokannassa (MACiE) (4). Olemme myös kehittäneet uuden ontologian, ENTSYYMIMEKANISMIN ontologian (EMO), joka mahdollistaa CSA-tiedon integroinnin sekä MACiE-että UniProtKB-tietorakenteisiin, ja sitä voidaan käyttää kontrolloituna sanastona kuvaamaan proteiinisekvenssin ja-rakenteen näkökohtia kemiallisin ja mekanistisin termein eri resursseissa.

CSA-pitoisuus

CSA: n tärkeimmät tiedot ovat proteiinijäämät kokeellisesti määritetyistä atomirakenteista, jotka määritellään katalyyttisiksi. Jäämät nimetään katalyyttisiksi siten, että ne täyttävät jonkin seuraavista kriteereistä: i) suora osallistuminen katalyyttiseen mekanismiin; ii) muuttaa toisen katalyyttiseen mekanismiin suoraan osallistuvan jäämän tai vesimolekyylin pKA: ta; iii) siirtymätilan tai välivaiheen stabilointi; ja iv) substraatin aktivointi. Huomaa, että se ei sisällä jäämiä, jotka osallistuvat yksinomaan ligandien sitomiseen ja eroavat siten muista resursseista, kuten UniProtKB-merkinnöistä. Tallennetun ATDB-rakenteen osalta tehdään merkintöjä, joissa saattaa olla useita katalyyttipaikkoja yhden syötteen sisällä.

katalyyttisten jäämien merkinnät tehdään joko manuaalisella kuratoinnilla tai sekvenssivertailulla. Alustavasta talousarvioesityksestä valitaan käsin kirjattavat kohdat rakenteen laadun ja katalysoidun reaktion käytettävissä olevan kokeellisen näytön perusteella. Tähän sisältyvät katalyyttimekanismia koskevat yksityiskohdat, jotka on mahdollisuuksien mukaan validoitu myös kokeellisilla tiedoilla. Huomautusten antajat antavat lyhyen vapaan tekstin kuvauksen entsyymistä sekä yksityiskohtaisemman yhteenvedon entsyymimekanismista. Myös itse reaktio esitetään ja merkitään näyttämään molekyylirakenteiden muutokset ja sidosjärjestyksen/valenssin muutokset käyttäen atomi–atomi-sovitusalgoritmia, joka on toteutettu small molecule subgraph detector (SMSD) – ilmaisimella (5). Kunkin katalyyttialueen kunkin jäämän osalta kirjataan jäämän toiminnallinen osa sekä sen tehtävä ja kohde, joka on kuvattu käyttäen valvottua sanastoa ja lyhyttä vapaamuotoista kuvausta siitä, miten jäännös suorittaa tehtävän. Evidence tagit tarjoavat suoran linkin kirjallisuuteen, josta merkinnät on johdettu. Kunkin katalyyttialueen osalta voidaan suorittaa haku palauttamalla kaikki muut CSA: n katalyyttiset paikat, joissa on samat katalyyttijäämät ryhmiteltyinä niiden E. C.-lukujen mukaan. Lisäksi tarjotaan hyperlinkkejä ulkoisiin resursseihin, kuten PDBSum (6) ja IntEnz (7). Tehdään sisäisiä linkkejä muihin merkintöihin, joilla on sama E. C.-numero (8) tai liittymisnumerot tai ate-tunnisteet. Kuviossa 1 on yhteenveto tietuetta varten esitetyistä tietotyypeistä.

tuntemattoman funktion proteiinien ennustamiseen osallistuvat kehittäjät voivat käyttää laajennettua määrää kuratoituja merkintöjä kehitteillä olevien menetelmien kouluttamiseen ja testaamiseen. Lisäksi yksittäiset käyttäjät voivat käyttää sekä kuratoituja että homologisesti johdettuja merkintöjä saadakseen tietoja katalyyttijäännöksistä kiinnostavassa rakenteessa, josta voi olla hyötyä uusien kokeiden suunnittelussa. Käyttökokemusta on parannettu käyttämällä BioJS-kirjastoja (9), jotka tarjoavat 3d-katselupaneelin sekä katalyyttijäämiä korostavan merkityn sekvenssikatseluohjelman.

osana laajempaa resurssien integrointia CSA on yhdistetty sisartietokanta Macieen. CSA: han liittyvien taulukoiden tietokantakaavio esitetään kuvassa 2. CSA on suunniteltu relaatiotietokanta käyttäen tyypillinen Linux, Apache, MySQL ja PHP Alustan apuna JavaScript hyödyntäen BioJS kirjasto.

johdetut katalyyttiset jäämät SEKVENSSIVERTAILULLA

merkinnät merkitään myös automaattisella sekvenssivertailumenetelmällä, jossa käytetään kuratoituja merkintöjä katalyyttisten jäämien päättelyyn. 433 proteiinisekvenssiä MACIE-entsyymimekanismin tietokannasta ja 911-sekvenssejä, jotka ovat ainutlaatuisia CSA: lle, uutettiin ja merkittiin sivuketjun, pääketjun, modifioidun, reagoivan aineen ja katsojajäämien merkinnöillä. PDB: n ja uniprotkb: n tarkistetun osan CSA-homologit yksilöitiin käyttämällä SSEARCH36 (10) – menetelmää, jonka tilastollinen merkitsevyyskynnys on e<10-6. SSEARCH alignments käytti-V-vaihtoehtoa projisoidakseen macie/CSA-sekvenssien yhteen merkittyjen funktionaalisten jäämien identiteetin/konservatiivisen/ei-konservatiivisen tilan PDB: n ja SwissProt: n homologisiin sekvensseihin.

homologisesti johdetuilla merkinnöillä on kuratoiduissa merkinnöissä olevien ulkoisten tietolähteiden linkkien lisäksi myös sisäinen linkki käsin annettuihin merkintöihin, joita käytettiin katalyyttijäämien päättelyyn. CSA 2.0 tarjoaa käsin kuratoidun resurssin 968 entsyymin rakenteista ja niiden katalyyttisistä paikoista, mukaan lukien tiedot kunkin katalyyttijäännöksen funktionaalisesta osasta ja sen roolista entsyymimekanismissa. Sekvenssivertailujen avulla nämä merkinnät laajennetaan vielä 32 216 homologialla merkittyyn rakenteeseen, mikä antaa yhteensä 34 096 huomautusta PDB: hen mahdollisesti talletetuista 49 049 entsymaattisesta rakenteesta. Tämä laajentaa suuresti 177 kuratoitua merkintää ja 2608 merkintää, joita homologia on selittänyt CSA 1.0: ssa. Lisäksi CSA 2.0: ssa on merkinnät 1189 E. C.-numerosta, jotka kattavat kaikki E. C.-luokitusluokat ja alaluokat sekä useimmat alaluokat (kuva 3).

ENTSYYMIMEKANISMIN ontologia

vaikka CSA-ja MACiE-resursseja on kehitetty jonkin verran rinnakkain ja näin ollen niillä on yhteinen tietomalli, on tällä hetkellä haastavaa yhdistää näitä entsyymiarkistoihin resursseissa, kuten UniProtKB, johtuen eroista entsyymin ominaisuuksien määritelmissä ja niiden kuvauksessa käytetyissä sanastoissa. Vaikka kuvaukset ja määritelmät joidenkin tietojen hallussa kaikissa kolmessa tietokannassa on tehty olemassa ontologioissa, kuten GO (11) ja ChEBI (12) ontologia, naimisiin nämä ja soveltaa niitä yhdenmukaisesti kaikki kolme tietokantaa osoittautunut kaukana triviaali.

CSA: ssa ja sen sisartietokannassa Maciessa käytetään kontrolloitua sanastoa, Maciella on tarkempi sanasto, koska se keskittyy entsyymeihin paljon syvällisemmin sisältäen perusteelliset kuvaukset suoritettavista kemiallisista reaktiovaiheista. Samoin uniprotkb: n tarkistettuun osaan (UniProtKB/Swiss-Prot) kerätään myös entsyymeihin liittyviä tietoja laajemmalla proteiinisekvenssitasolla, mukaan lukien tiedot katalyyttisistä jäämistä. Selityksiä tehdään sekä vapaamuotoisena tekstinä että itsenäisesti kehitettyä ohjattua sanastoa käyttäen.

tämän ratkaisemiseksi olemme kehittäneet emon, joka perustuu Macielle ja CSA: lle kehitettyyn ohjattuun sanastoon ja joka toimitetaan OBO-valimolle (13). Tämä sanasto (KS.Lisämateriaali tai http://purl.bioontology.org/ontology/EMO) luotiin kuvaamaan entsyymin reaktioiden aktiivisia komponentteja (kofaktorit, aminohapot ja kognaattiligandit) ja niiden roolia reaktiossa. EMO perustuu tähän virallistamalla keskeisiä käsitteitä, ja niiden väliset suhteet, jotka ovat välttämättömiä entsyymien ja niiden toimintojen määrittelemiseksi. Tämä ei kuvaa ainoastaan entsyymin yleisiä ominaisuuksia, mukaan lukien E. C.-numero (katalyyttinen aktiivisuus), 3D-rakenne ja solujen sijainnit, vaan mahdollistaa myös mekanismin yksityiskohtaisen merkitsemisen. Tämä mekanistinen yksityiskohta voi olla joko bruttotasolla (kokonaisreaktio vain CSA: ssa kuvattuna) tai kemiallisen kokonaismuokkauksen edellyttämien vaiheiden ja komponenttien yksityiskohtaisempi rakeisuus.

EMO mahdollistaa monien eri resurssien vetämisen yhteen, vaikka merkintöjä tehtäisiinkin vain osittain, mikä voisi mahdollistaa epätäydellisten merkintöjen laajentamisen. Tietokantojen välistä viestintää voidaan helpottaa käyttämällä niin yleistä resurssia, että eri termit kartoitetaan yhteiseksi tietomalliksi. Kaikki CSA-kuratoitujen merkintöjen merkinnät on integroitu uniprotkb: n merkintöihin.

3D-mallien luominen

käyttäen vasta kuratoituja merkintöjä on mahdollista rakentaa kolmiulotteisia malleja, jotka koostuvat vain muutamasta aktiivisen kohdan jäämien atomista. Kunkin mallin katalyyttisen jäämän vaihtoehtoiset jäämätyypit voidaan luetteloida mallissa homologisesti johdettujen merkintöjen vastaavista positioista. Tämä laajentaa 149 mallin joukon, joka on rakennettu CSA 1.0: sta yhteensä 584: ään CSA 2.0: sta. Jess, nopea ja joustava algoritmi pienten atomiryhmien proteiinirakenteiden etsimiseen geometristen ja kemiallisten rajoitteiden perusteella (14), voi käyttää malleja uusien rakenteiden etsimiseen mahdollisten katalyyttisten paikkojen löytämiseksi. Tämä on toteutettu uudella palvelimella CSS (http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/CSS/). Tämän asynkronisen palvelun käyttäjät voivat joko ladata oman rakennetiedoston tai pyytää talletettua rakennetta (jos CSA ei ole jo antanut sille huomautusta) haettavaksi uusien mallien avulla. Tulokset asetetaan paremmuusjärjestykseen rmsd: n ja log E-arvon perusteella. Jokaisesta kuratoidusta merkinnästä tehty malli on saatavilla asiaankuuluvalta CSA: n merkintäsivulta sekä kollektiivisesti ladattavissa.

päätelmät

CSA 2.0 tarjoaa uuden nykyaikaisen rajapinnan paljon laajempaan käsin kuratoituun aineistoon entsyymin katalyyttisissä paikoissa esiintyvistä jäämistä ja niiden funktionaalisesta roolista reaktiossa. On otettu käyttöön uusi menetelmä katalyyttijäämien merkintöjen ja tunnistamisen luotettavasti ekstrapoloimiseksi homologisiin rakenteisiin. Lisäksi kuratoiduista merkinnöistä voidaan rakentaa katalyyttisten sivustojen 3D-malleja, joista puolestaan voidaan etsiä uusia rakenteita katalyyttisen sivuston tunnistamista varten uudistetun CSS-palvelun avulla. Lisäksi on kehitetty uusi ontologia, joka mahdollistaa entsyymikatalyysiin liittyvien merkintöjen siirtämisen resurssien välillä. Tätä on käytetty CSA-merkintöjen sisällyttämiseen uniprotkb: hen ja Macieen.

tietokanta löytyy osoitteesta http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/CSA, kun taas CSS-palvelu löytyy osoitteesta http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/CSS. Molemmat ovat yhteensopivia useimpien nykyaikaisten selainten kanssa. Kaikki CSA: n tiedot ovat ladattavissa ja vapaasti akateemisen yhteisön saatavilla.

rahoitus

eturistiriitalaskelma. Ei ilmoitettu.

kiitokset

kirjoittajat haluavat kiittää monien huomautusten laatijoiden työtä, jotka ovat osallistuneet CSA: n kuratoituihin merkintöihin. Haluamme myös kiittää tohtori Syed A. Rahmania merkittyjen reaktiokaavioiden toimittamisesta.

,

,

,

, et al.

,

,

, vol.

(pg.

–

)

,

,

,

,

.

,

,

, vol.

(pg.

–

)

.

,

,

, vol.

pg.

,

, et al.

,

,

, vol.

(pg.

–

)

,

,

Burgess s ,

t ,

, et al.

,

,

, vol.

(pg.

–

)

,

b ,

,

V ,

,

,

, et al.

,

,

, vol.

(pg.

–

)

,

,

,

,

,

,

, et al.

,

,

, vol.

(pg.

–

)

tekijä toteaa