tulokset

ensin selvitimme,asuvatko CD63 ja H, K-ATPaasi samassa solulokerossa mahalaukun parietaalisoluissa. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että rotan parietaalisoluissa esiintyy korkeita CD63-pitoisuuksia (22). Immunofluoresenssimikroskopia rotan vatsan jäätyneissä osissa osoittaa, että CD63: a esiintyy useimmissa rotan mahalaukun soluissa, mukaan lukien parietaalisolut (Kuva. 1 A). CD63 kolokalisoituu osittain HKA: n kanssa parietaalisoluissa. Lisäksi analysoimme erittäin puhdistetun TVE-valmisteen sikamahasta (C. T. Okamoton ystävällinen lahja). H, K-ATPaasin osuus on ≈50% samankaltaisten valmisteiden proteiinipitoisuudesta (23). Western blot-analyysi osoittaa, että CD63: a esiintyy runsaasti tässä puhdistetussa tves-valmisteessa(Kuva. 1b).

tutkiaksemme mahdollista in situ-yhteisvaikutusta CD63: n ja H,K-ATPaasin välillä teimme vetokokeita biotinyloidulla tomaattilektiinillä. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että tämä lektiini sitoutuu spesifisesti ja yksilöllisesti hkß: ään mahavalmisteissa (24-27). Blottasimme TVE-valmisteen anti-HKß mAb: lla ja biotinyloidulla tomaattilektiinillä varmistaaksemme, että lektiini liittyy nimenomaan glykosyloituun HKß: iin (Kuva. 1C). Tämän jälkeen käytimme biotinyloitua tomaattilektiiniä eristämään proteiineja, jotka ovat vuorovaikutuksessa TVE-valmisteen hkß: n kanssa. Western blot-analyysi osoittaa, että CD63 saostuu tomaattilektiinistä (Kuva. 1D), joka osoittaa, että CD63 ja H, K-ATPaasi liittyvät toisiinsa in situ ja viittaa siihen, että tämä yhteys voi olla fysiologisesti merkityksellinen. TVE-valmisteen esikäsittely 4%: n SDS: llä ja sen jälkeen 20-kertainen laimennus lysis-puskuriin vähensi saostuneen CD63: n määrää merkittävästi. Saostuneen HKß: n määrä ei muuttunut tällä käsittelyllä (tietoja ei näy). Nämä tiedot viittaavat siihen, että CD63: n esiintyminen alasvedossa johtuu sen yhteydestä hkß: ään eikä CD63: n ja tomaattilektiinin suorasta yhteydestä.

tutkiaksemme cd63: n ja HKß: n välisen vuorovaikutuksen funktionaalista merkitystä, siirsimme cos-7-soluja cDNA: lla, joka koodaa kani HKß: ää joko yksittäin tai yhdessä cDNA: n kanssa, joka koodaa lipulla merkittyä CD63-konstruktiota (CD63-FL). Olemme osoittaneet, että hkß: n ei tarvitse kokoontua HKA: n kanssa päästäkseen solun pintaan transfektoiduissa COS-soluissa (20). Käytimme CD63-konstruktiota, jonka N-terminaalissa on lippu-epitooppilappu, koska CD63: n C-terminaalissa on tyrosiinipohjainen motiivi, jota tarvitaan tämän tetraspaniinin (13) solunsisäisessä kaupassa.

HKß: llä ja CD63-FL: llä kuoritut cos-solut altistettiin immunopresipitaatiolle anti-FLAG pAb-menetelmällä. Immunopresipitoidun materiaalin Western blot-analyysi osoittaa, että HKß kopresipitoi CD63: n kanssa (kuva. 2, HKß + CD63-FL). CD63-FL-ja HKß-proteiinit koimmunopresipitoivat erilaisissa pesuaineissa, mukaan lukien 2% CHAPS, 1% Brij 96 ja 1% Triton X-100. Cd63: n ja HKß: n välinen assosiaatio on yksi harvoista kuvatuista tetraspaniinikomplekseista, joka selviytyy Triton X-100: ssa tapahtuvasta liukoisuudesta ja edustaa siten todennäköisesti suoraa vuorovaikutusta (28). Β-alayksiköllä on kaksi muotoa: ßm (kypsä), jota muunnetaan monimutkaisilla hiilihydraateilla, ja ßc (ydin), jota muunnetaan runsasmanoosisilla hiilihydraateilla (29). Molemmat muodot kopresipitoivat CD63: n kanssa, joskin sakkaa sisältävän ßc: n ja ßm: n suhde vaihtelee liukoisuusolosuhteiden funktiona.

HKß: ää ei havaittu lipun immunoprecipitaatioissa, jotka tehtiin pelkästään HKß: llä transfektoiduille soluille, mikä osoittaa, että lipun pAb: llä ei ole vuorovaikutusta β-alayksikön kanssa (kuva. 2, HKß). HKß ei koimmunopresipitoi lipun kanssa pAb-seosta, joka on peräisin CD63-FL:llä ja β-alayksiköllä transfektoiduista soluista valmistettujen lysaattien seoksesta (50: 50, vol/vol), mikä vahvistaa, että yhteisvaikutus tapahtuu In vivo (Kuva. 2, toinen kaista). Lipulla PAB inkuboidut näytteet eivät saosta lysosomaalista proteiinilamppua-1, mikä osoittaa, että cd63-FL: n ja HKß: n välinen vuorovaikutus on spesifistä eikä cd63-osaston epätäydellisen liukoisuuden artefakti (Kuva. 2).

tämän jälkeen selvitimme, vaikuttaako hkß: n ja CD63: n yhteisvaikutus β-alayksikön subsellulaariseen lokalisointiin. HKß on läsnä solun pinnalla transitiivisesti transfektoituneissa COS-soluissa (Kuva. 3 A-C). Β-alayksikön uudelleenjakautuminen solunsisäisiin CD63: a sisältäviin vesikkeleihin tapahtuu selvästi, kun COS-soluja cotransfektoidaan sekä HKß: llä että CD63-FL: llä (Fig. 3 D-F). Sulkiaksemme pois sen mahdollisuuden, että tämä muuttunut lokalisointi voisi olla cd63: n yliekspression epäspesifinen vaikutus, tutkimme CD63: n ekspression vaikutusta aqp4: n jakautumiseen. Aqp4 on vesikanava, joka on parietaalisolujen basolateraalisissa plasmakalvoissa. Se ei käy läpi säänneltyä endosytoosia ja eksosytoosia H,K-ATPaasin (30, 31) kanssa. Tämä kanava ei koimmunopresipitoi CD63-FL: n kanssa cotransfektoitujen COS-solujen Triton X-100-lysaatissa (Kuva. 4 A). Kun kotransfektoidut solut visualisoidaan immunofluoresenssikongokaalimikroskopialla, CD63: a sisältävässä lokerossa ei ole AQP4: ää (Kuva. 4B), mikä osoittaa, että CD63: n indusoima uudelleenjakautuminen solunsisäisiin rakkuloihin on spesifistä proteiineille, jotka ovat vuorovaikutuksessa tämän tetraspaniinin kanssa.

tutkiaksemme HKß: n cd63-välitteisen uudelleenjaon mekanismeja hyödynsimme viimeaikaista työtä, joka on leimannut cd63: n solunsisäistä kauppaa. Rous ym. (13) osoitti, että CD63: n äärimmäisessä C-terminaalissa esiintyvä tyrosiinipohjainen motiivi on vuorovaikutuksessa sovittimen alayksiköiden μ2 ja μ3 kanssa. Μ2-proteiini kuuluu heterotetrameeriseen AP-2-kompleksiin. Tämä kompleksi on läsnä plasmakalvossa ja yhdistää lastiproteiinit klatriinikerrokseen välittäen niiden endosytoosia (14). Μ3-proteiini kuuluu heterotetrameeriseen AP-3-kompleksiin. Tämä kompleksi osallistuu lysosomaaliseen tähtäykseen ja sitä esiintyy sekä trans-Golgi-verkostossa että vesikulaariosastossa, joka kolokalisoituu osittain endosomien kanssa (12). Kun CD63: n JEVM-tyrosiinipohjainen motiivi mutatoituu AEVM: ksi, CD63 ei kykene vuorovaikutukseen μ2: n tai μ3: n kanssa ja se ilmenee pääasiassa solun pinnalla (13). Kun HKß koekspressoidaan lipulla merkityllä CD63-AEVM-konstruktiolla, sekä CD63-AEVM että β-alayksikkö jakautuvat solun pinnalle (Kuva. 3 G-I). Näin ollen HKß: n solunsisäiseen jakautumiseen vaikuttavat cd63: n sytoplasmahäntään upotetut salakuljetussignaalit.

kun CD63: n hännässä oleva JEVM-sekvenssi mutatoituu YEVIKSI, modifioitu motiivi jatkaa vuorovaikutustaan μ3: n kanssa, mutta ei enää assosioidu μ2: n (13) kanssa. CD63-YEVI lokalisoituu pääasiassa myöhäiseen endosomaalinen-lysosomaaliseen lokeroon, todennäköisesti siksi, että muuttunut tetraspaniiniproteiini siirtyy suoraan tähän lokeroon sen ensimmäisen biosynteettisen kulun jälkeen Golgin läpi (13). Plasmakalvoon saapuvan CD63-YEVIN pienen populaation sisäistyminen on heikentynyt, koska se ei voi enää olla vuorovaikutuksessa μ2: n (13) kanssa. Kun HKß ja lipulla merkitty CD63-YEVI konstruktio koekspressoidaan COS-soluissa, suuri osa CD63–YEVISTÄ lokalisoituu myöhäiseen endosomaaliseen lysosomaaliseen lokeroon; β-alayksikkö jää kuitenkin solun pinnalle eikä jakaudu uudelleen solunsisäiseen lokeroon (Fig. 3 J-L). Koimmunoprecipitaatioanalyysi vahvistaa, että HKß voi liittyä sekä CD63-YEVIIN että CD63-AEVM: ään (tietoja ei näytetä). Nämä tiedot viittaavat siihen, että jotta HKß voidaan jakaa cd63-positiiviseen solunsisäiseen lokeroon, näiden proteiinien on oltava vuorovaikutuksessa solun pinnalla ja ne on endosytoitava kompleksina.

selvittääksemme, vastaako solunsisäisissä vesikkeleissä havaittu HKß proteiinia, joka oli endosytoitu solun pinnalta, havaitsimme β-alayksikön sisäistymisen eksogeenisen CD63-ilmentymän läsnä ollessa ja ilman sitä. COS-solut kokransfektoitiin hkß: llä ja CD63-FL: llä. Tämän jälkeen solut jäähdytettiin 4°C: seen endosytoosin pysäyttämiseksi ja pintaan merkittiin hkß mAb. Merkittyjä soluja inkuboitiin 37°C: ssa 40 minuutin ajan endosytoosin jatkamiseksi. Inkubaation jälkeen solut jäähdytettiin 4°C: n lämpötilaan ja pinnaksi merkittiin Cy5-konjugoitu vuohien anti-hiiri IgG. Solut kiinnitettiin ja inkuboitiin anti-FLAG pAb: llä, minkä jälkeen ne merkittiin sekä fluoreseiini-isotiosyanaattikonjugoidulla vuohi-anti-hiiri-IgG: llä että rodamiini-konjugoidulla vuohi-Anti-kani-IgG: llä. Näin pinnalle jäänyt HKß visualisoitiin Cy5-kanavalla, sisäistetty HKß visualisoitiin fluoreseiini-isotiosyanaattikanavalla ja CD63-FL visualisoitiin rhodamiinikanavalla. Tämä analyysi osoitti, että sisäistetty β-alayksikkö kolokalisoituu CD63: lla, mikä viittaa siihen, että CD63: lla kolokalisoituneen hkß: n pooli on johdettu endosytoosin kautta solukalvosta (Fig. 5 E-H). Soluissa, jotka eivät yliekspressoi CD63: a, esiintyy paljon vähemmän sisäistettyä β-alayksikköä 40 minuutin inkubaation jälkeen(kuva. 5 A-D).

kvantitoidaksemme hkß: n sisäistämisen ja varmistaaksemme edelleen, että hkß ja CD63 yhtyvät solun pinnalla, teimme solun pinnan biotinylaatiokokeita. Ensimmäisessä kokeessa COS-solut transfektoitiin pelkällä β-alayksiköllä ja biotinyloitiin biotiini-SS-n-hydroksisukkinimidiesterillä 4°C: ssa.Kaksoisnäytteitä inkuboitiin 37°C: ssa eripituisia aikoja endosytoosin jatkamiseksi. Solut palautettiin 4°C: n lämpötilaan, ja jokaisesta aikapisteestä poistettiin yksi levy jäljellä olevasta solupinnan biotiinista altistamalla se kalvopäällysteiselle pelkistysaineelle Mesnalle. Solut lysättiin ja inkuboitiin streptavidiinihelmillä. Streptavidiinihelmiin liittyvät proteiinit erotettiin SDS/PAGE-menetelmällä, ja kalvot koetteli hkß mAb (Kuva. 6 A). Β-alayksikön fraktio solun pinnalla ei muutu merkittävästi 37°C: n internalisaation edetessä. Ensimmäisen 10 minuutin jälkeen pieni osa pintamerkitystä HKß: stä eristetään solun sisälle, ja pinnan suhde sisäistettyyn HKß: iin pysyy korkeana. Nämä tiedot viittaavat siihen, että β-alayksikkö, joka ei liity CD63: een, joko sisäistyy hyvin hitaasti tai sisäistyy, mutta kierrätetään nopeasti takaisin pinnalle, aivan kuten transferriinireseptori.

seuraavaksi pyrittiin luonnehtimaan CD63: een yhdistävän HKß: n käyttäytymistä. COS-solut kokransfektoitiin hkß: llä ja CD63-FL: llä. Solut biotinyloitiin ja riisuttiin edellä kuvatulla tavalla. CD63: een liittyvän hkß: n populaation eristämiseksi solulysaattia inkuboitiin FLAG pAb: lla ja proteiini A: n konjugoiduilla agaroosihelmillä. Immunopresipitoitu aine eluoitiin pienellä määrällä puskuria, joka sisälsi 3% SDS: ää, laimennettiin 30-kertaiseksi 1% Triton X-100: lla ja inkuboitiin streptavidiinihelmillä. Streptavidiinihelmiin liittyvät proteiinit erotettiin SDS/PAGE-menetelmällä ja koetteli hkß mAb (Kuva. 6b). Soluille, joille ei tehty strippausprotokollaa, tässä läntisessä blotissa havaittu signaali edustaa cd63: een liittyvien pintamerkittyjen β-alayksiköiden kokonaispoolia, mukaan lukien kompleksit, jotka olivat vielä plasmakalvolla, ja kompleksit, jotka oli sisäistetty vesikkeleiksi. Strippausprotokollan kohteena olleille soluille signaali edustaa cd63: een liittyvän β-alayksikön populaatiota, joka oli solun pinnalla biotinylaation aikana ja joka myöhemmin internoitiin ja suojattiin MesNa-nauhalta.

0-min aikapisteessä biotinyloitunutta HKß: ää havaitaan helposti sitoutumattomista soluista peräisin olevissa anti-FLAG-immunopresipitaateissa, mikä osoittaa, että hkß ja CD63 pystyvät yhtymään solun pinnalla. Kaikki 0-min aikapisteessä talteen otettu biotinyloitu HKß on herkkä Mesnan kaistaleelle. MESNA-reagenssilta suojatun CD63: een liittyvän biotinyloidun β-alayksikön määrä kasvaa, kun solujen annetaan inkuboitua 37°C: ssa.itse asiassa pinnalla olevan ja CD63: een liittyvän HKß: n määrä 0 minuutin kuluttua on suunnilleen sama kuin Cd63: een liittyvän hkß: n määrä, joka on suojattu strippaukselta 45 minuutin kuluttua. Nämä havainnot viittaavat siihen, että cd63: een liittyvä β-alayksikkö on sisäistynyt eikä palaa solun pinnalle.