CPZ vaimentaa koliittia riippumatta TRPV1: stä
Haastaaksemme mekanismin, jolla CPZ-peräruiskeet vaimentavat kokeellista koliittia, indusoimme dekstraanisulfaattinatriumia (DSS) koliittia villityyppisissä koliiteissa (WT) ja TRPV1: ssä.puutteelliset hiiret (kukin ryhmä N = 8). Vaikka ristiriitaisia raportteja on olemassa, TRPV1-vajavaiset hiiret kehittivät DSS-koliitin ja laihtumisen samassa määrin kuin laboratoriossamme olevat kongeneettiset WT-hiiret, mikä vastaa tuloksiamme tnbs-koliitin mallista, jonka olimme aiemmin julkaisseet7,8,9,10,11,12. CPZ-peräruiskeiden hoidossa käytimme samaa CPZ-pitoisuutta (531 µM), jonka aiemmin raportoitiin heikentävän DSS (5%) – koliittia rats8: ssa. Koliitin kulkua seurattiin päivittäin kehon painomittauksilla ja tähystyksellä. Kahdesti päivässä CPZ: n (531 µM) peräruiskeet heikensivät DSS− koliittia samassa määrin sekä WT: llä että TRPV1−/ – hiirillä, mikä näkyi parantuneena endoskooppisena pisteytyksenä ja vähentyneenä ruumiinpainon menetyksenä (Kuva. 1A-C). H&E distaalisen paksusuolen tahrat 7 päivän DSS-kokeen lopussa paljastivat tuhoutuneen limakalvokudosarkkitehtuurin, jossa verrokkien suolissa oli lukuisia soluttautuneita immuunisoluja. Tämä oli jyrkkä vastakohta laajalle ehjälle limakalvolle ja sille, ettei CPZ-hoidetuilla hiirillä ollut merkittävää immuunisoluinfiltraatiota molempien genotyyppien suolissa (Fig. 1D). Näiden havaintojen mukaisesti histologinen pistemäärä laski voimakkaasti CPZ-hoidetuilla hiirillä, joilla oli molemmat genotyypit (Fig. 1 E).
CPZ aktivoi TRPA1
in vivo havainto, että CPZ-peräruiskeet estivät tehokkaasti koliittia TRPV1-mutanttihiirillä, asetti kysymyksen CPZ: n TRPV1-riippumattomista neuronaalivaikutuksista. Koska TRPA1: n oli osoitettu olevan ratkaiseva eri tulehdusmalleissa, mukaan lukien kolitis6, 12, 14, testasimme vaikuttaako CPZ TRPA1: een.
CPZ: n indusoimat ionivirrat hTRPA1: n kautta
Patch clamp-kokeet suoritettiin jännitekiinnitystilassa hek293t-soluilla, jotka ilmentivät rekombinanttia hTRPA1: tä (hTRPA1-HEK293t-soluja). CPZ (10 µM) indusoi -60 mV: n pitopotentiaalilla sisäänpäin virtaavan virran, jonka selektiivinen TRPA1-antagonisti HC-030031 (HC, 10 µM) esti lähes täysin (93%: n inhibitio, N = 5) (Kuva. 2 A). Kaikissa soluissa, joissa kirjattiin CPZ: n indusoima sisäänpäin suuntautuva virta, karvakroli (100 µM) on vakiintunut TRPA1-agonisti, joka myös aiheutti suuria sisäänpäin suuntautuvia virtauksia samalla pitopotentiaalilla, mikä osoittaa hTRPA1: n toiminnallisen ilmentymisen. Näihin hTRPA1-HEK293-kennoihin kohdistettiin myös jänniterampit -100 – +100 mV 400 ms: n kestosta joka 4 s (kuva. 2b). CPZ-indusoitu, virta-jännite-suhde näytti hieman ulospäin oikaisua ja kääntymispotentiaali lähellä 0 mV (Kuva. 2C). CPZ: n (10 µM) herättämät virrat estivät HC (10 µM). Vaikutus oli voimakkaampi negatiivisilla potentiaaleilla (89% ± 5%: n inhibitio -80 mV: ssä, keskiarvo ± SD, n = 7) kuin positiivisilla potentiaaleilla (80% ± 9%: n inhibitio +80 mV: ssä).
Kapsatsepiini (CPZ) aktivoi heterologisesti ilmaistun ihmisen TRPA1: n.
(a) CPZ (10 µM) herättää hTRPA1-välitteisiä virtoja transfektoiduissa hek293t-soluissa. Huomaa, että selektiivinen TRPA1-antagonisti HC030031 (HC, 10 µM) estää virtaukset täydellisesti. (B) hTRPA1-transfektoidussa hek293-kennossa esitetyt edustavat ramppivirrat 400 ms: n jänniterampeilla -100 – +100 mV sovelletaan 4 s: n välein. jokainen symboli edustaa virran amplitudia -80 mV: ssä (neliöt) ja +80 mV: ssä (ympyrät). HC esti voimakkaasti CPZ: n indusoiman virran. C) esimerkkejä yksittäisistä ramppivirroista, jotka vastaavat B: n täytettyjä symboleita ja numeroita.D) CPZ (50 µM, 10 s) herättää suuria kalsiumin transientteja hTRPA1-HEK293-soluissa (musta jälki, n = 128). HC (20 µM; punainen jälki, n = 209) ja A-967079 (10 µM; sininen jälki, n = 140) estivät täysin vasteen CPZ: lle. Data represent means (suorat viivat) ± SEMs (katkoviivat). E) CPZ: N (10 µM) aiheuttama hTRPA1: n aktivaatio riippuu pitoisuudesta. HTRPA1-HEK293-soluja (n = 52) stimuloitiin lisäämällä CPZ-pitoisuuksia 20 sekunnin ajan 3 minuutin välein. Harmaa jälki: siirtämättömät hek293-solut (n = 101) altistettiin samoille CPZ-pitoisuuksille. F) CPZ: N (1 µM) aiheuttama hTRPA1: n aktivoituminen edellyttää kolmea kriittistä kysteiiniä kanavan n-terminaalissa. Black trace: n = 123 HEK293-solujen, jotka ilmentävät WT hTRPA1: tä, vaste CPZ: n (1 µM), karvakrolin (100 µM) ja allyyli-isotiosyanaatin (AITC, 50 µM) peräkkäisiin sovelluksiin. Gray trace: n = 165 HEK293-solujen reaktio, joka ilmentää mutanttia hTRPA1-3c: tä samaan ärsyke-jaksoon. Huomaa, että hTRPA1-3c-mutantin vaste CPZ: lle ja AITC: lle heikkeni huomattavasti, mutta ei karvakrolille. G) genotyyppien välinen ero CPZ-herkkyydessä poistui 100 µM CPZ: llä. (H) CPZ: n aiheuttama hTRPA1: n aktivoituminen voidaan estää N-asetyylikysteiinin (NAC) haaskalla. Black trace: kontrollikokeissa hTRPA1-HEK293-solut altistettiin CPZ: lle (50 µM; 60 s; n = 74). Punainen jälki: erillisessä kokeessa solut altistettiin ensin 30 sekunnin ajan CPZ: n (50 µM) ja NAC: n (15 mM) yhdistelmälle, minkä jälkeen CPZ: tä annettiin yksinään vielä 30 sekunnin ajan (N = 83).
CPZ: n aiheuttama kalsiumin sisäänvirtaus hTRPA1: n kautta
CPZ: n selektiivinen vaikutus TRPA1: een vahvistettiin käyttämällä kalsiummikrofluorimetriatekniikkaa. hTRPA1-HEK293-soluja stimuloitiin kahdella CPZ: n (50 µM) hakemuksella 10 sekunnin ajan 5 minuutin välein (Kuva. 2D). Selektiivisiä antagonisteja HC (20 µM) ja A-967079 (10 µM) levitettiin 1 minuutin ajan ennen ensimmäistä CPZ-altistusta ja sen aikana. Molemmat antagonistit kumosivat CPZ-vasteen kokonaan. On syytä huomata, että HC: n poistuminen johti kalsiumtulvaan, joka todennäköisesti johtui CPZ: n jäännösvaikutuksesta, kun taas tätä off-vaikutusta ei ollut A-967079: n tapauksessa, joka saattaa irrota hitaammin (Kuva. 2D). Sitten analysoimme CPZ: n vaikutusten pitoisuusriippuvuutta. Kohonneita CPZ-pitoisuuksia (100 nM, 500 nM, 5 µM ja 50 µM) levitettiin hTRPA1-HEK293-soluihin 20 sekunnin ajan kukin 3 minuutin välein. Alkaen 100 nM: stä kaikki CPZ: n pitoisuudet herättivät kalsiumin transientteja yhä suuremmilla amplitudeilla (Kuva. 2 E). Karvacrolia (100 µM) levitettiin kokeen lopussa funktionaalisen TRPA1-ekspression kontrollointiin, mutta karvacrolin vaste 50 µM CPZ: n jälkeen oli huomattavan pieni, mikä viittaa ristiinherkkyyteen. Siirtämättömille hek293-soluille tehtiin samat CPZ-sovellukset, ja vain suurin testattu pitoisuus (50 µM) lisäsi kalsiumin määrää vain vähän. Odotimme, että CPZ liittäisi kolme kriittistä kysteiinijäämää kanavan n-terminaaliseen domeeniin, koska se on elektrofiilinen yhdiste. HEK293-soluille, jotka ilmentävät WT hTRPA1: tä, ja kolmoiskysteiinimutantti hTRPA1-3c: tä (C621S, C641S, c665s), tehtiin CPZ-sovellus (1 µM, 20 s), jota seurasi ei-elektrofiilinen agonisti karvakroli (100 µM, 20 s) ja erittäin elektrofiilinen AITC (50 µM, 30 s). Ionomysiiniä käytettiin kokeen lopussa positiivisena kontrollina. 1 µM CPZ: n herättämän kalsiumin muuttujan amplitudi pieneni huomattavasti (>80%) hTRPA1-3C: tä ilmentävissä soluissa verrattuna WT hTRPA1: tä ilmentäviin soluihin (Kuva. 2F), kun taas genotyyppien välinen ero CPZ-herkkyydessä poistui 100 µM CPZ-pitoisuudella (Kuva. 2G). AITC-vaste heikkeni mutanttisoluissa, kun taas karvakroli aiheutti suuria kalsiumionitransientteja sekä WT-että 3C-mutanteissa. Yhdessä nämä soluvasteet osoittavat, että CPZ: n suhteellisen suuri teho riippuu kolmesta kriittisestä kysteiinistä. Kun CPZ: n pitoisuus on kuitenkin 100-kertainen, muut sitoutumiskohteet ottavat hoitaakseen hTRPA1: n aktivoitumisen. Tämä suuri lipofiilisen CPZ: n pitoisuus voi myös olla vuorovaikutuksessa solun lipidikalvon kanssa, aktivoiden epäsuorasti TRPA1: tä, kuten aiemmin on osoitettu lipopolysakkaridien lipidikomponentille A16. Lisäksi elektrofiilisen raadonsyöjän läsnä ollessa N-asetyylikysteiini (NAC) kyllästyvänä pitoisuutena (15 mM) 50 µM CPZ ei pystynyt aiheuttamaan vastetta. NAC: n poistamisen jälkeen CPZ aiheutti suuria kalsiumtransientteja hTRPA1-transfektoiduissa hek293t-soluissa (Kuva. 2H), joka vahvistaa, että CPZ toimii elektrofiilisena agonistina hTRPA1: lle.
CPZ aktivoi AITC-herkkien dorsal root ganglion (DRG) – neuronien alapopulaation
DRG-neuronien toimintaa ylläpidettiin primaariviljelyssä ja tutkittiin kalsiumfluorimetrialla. Soluja stimuloitiin CPZ: llä (50 µM, 20 s), jota seurasivat AITC (100 µM, 30 s), kapsaisiini (CAP, 1 µM, 10 S) ja KCl (60 mM, 30 s). Kuva 3A havainnollistaa esimerkkejä DRG-hermosoluista, jotka reagoivat kaikkiin näihin neljään ärsykkeeseen. Tyypillinen osa DRG-neuroneista aktivoitui AITC: llä (301 906 neuronista, 33%, n = 8 hiirtä), mikä osoitti TRPA1: n funktionaalista ilmentymää. Näiden AITC-herkkien neuronien alipopulaatio aktivoitui myös CPZ: llä (185 301 neuronista, 61%). Herkkyys CPZ: lle rajoittui lähes kokonaan AITC-reagoiviin neuroneihin. Kaikkiaan 200 CPZ-herkästä neuronista 185 (93%) aktivoitui myös AITC: llä, mikä osoittaa herkkyyksien voimakasta yhteneväisyyttä CPZ: n ja AITC: n kanssa (kuva. 3). Kuten hTRPA1: tä ilmentävien hek293-solujen tapauksessa, CPZ: n herättämät kalsiumtransientit DRG-neuroneissa olivat konsentraatiosta riippuvaisia EC50-arvolla, joka arvioitiin 30 µM CPZ: ksi, ja pieni AITC-vaste 100 µM CPZ: n jälkeen viittasi jälleen ristiinherkkyyteen (Kuva. 3B, C). Kuvassa 3D esitetään CPZ -, CAP-ja AITC-vasteiden päällekkäisyys WT DRG-neuroneissa annetuilla pitoisuuksilla: 14% DRG-neuroneista reagoi AITC: hen mutta ei CAP: hen (125/906), 16% vastasi CAP: iin mutta ei AITC: hen, kun taas CPZ indusoi kalsiumtransientteja 78%: ssa neuroneista, jotka reagoivat sekä AITC: hen että CAP: hen (137/176). Havaittujen vaikutusten spesifisyyden osoittamiseksi TRPV1−/− ja TRPA1 – / – DRG-neuronit altistettiin edellä mainitulle protokollalle. Noin 90% TRPV1-puutteellisista DRG-neuroneista, jotka olivat AITC-herkkiä, vastasivat myös CPZ: lle (509/572 solua), kun taas yksikään testatuista 448 TRPA1-puutteellisista DRG-neuroneista ei osoittanut kalsiumin virtaa vastauksena CPZ: lle (100 µM), kuten FIG: n edustavat esimerkit osoittavat. 3 E, F.
Kapsatsepiini (CPZ) aktivoi hiiren TRPA1: tä selkäjuuren hermosoluissa.
(a) CPZ (50 µM) aktivoi AITC (100 µM)-herkkien hiiren dorsal root ganglion (DRG) – neuronien alapopulaation. Yksittäiset vasteet kolmesta eri AITC-ja kapsaisiini (CAP, 1 µM) – herkästä DRG-hermosolusta, jotka aktivoituivat CPZ: llä. CPZ: tä haettiin 20 sekunnin ajan, AITC: tä 30 sekunnin ajan ja CAP: ia 10 sekunnin ajan 4 minuutin välein, mikä mahdollisti palautumisen. KCL: ää (60 mM) levitettiin kokeen lopussa viljeltyjen neuronien elinkelpoisuuden varmistamiseksi. (B) n = 135 AITC-herkkien neuronien keskimääräinen vaste kolmeen eri CPZ-pitoisuuteen (25, 50, 100 µM, 20 s kukin). Huomaa Ca2+ transienttien amplitudin konsentraatio-riippuvuus. Suorat jäljet edustavat keskiarvoa ja pistemäiset jäljet Semejä. (C) CPZ: n indusoiman i: n Pitoisuusriippuvainen kasvu AITC-herkissä DRG-neuroneissa normalisoitui depolarisoivaksi ärsykkeeksi KCL: llä (60 mM). EC50 = ∼30 µM laskettiin sovittamalla annos-Vastefunktioon. Tiedot edustavat kahta koesarjaa ja osoittavat keskiarvot ± sem; CPZ: N 1, 10, 25 µM: n = 169, CPZ: n 25, 50, 100 µM: n = 138. D) havainnollistetaan CPZ-, AITC – ja CAP-herkkien DRG-neuronien populaatioita ja niiden päällekkäisyyttä. Yhteensä 906: sta kuvaillusta neuronista (jotka on valittu KCl: n vasteen perusteella) 200 (22%) aktivoitui CPZ: llä (50 µM), 301 (33%) AITC: llä (100 µM) ja 323 (36%) CAP: lla (1 µM) (fraktioiden yksityiskohtainen analyysi, KS.si-Kuvan selitys 3). (E) CPZ (100 µM, 20 s) aktivoi AITC (100 µM, 20 s)-herkkiä DRG-neuroneja TRPV1-puutteellisilta hiiriltä. Yksittäisiä vasteita eri AITC-herkiltä neuroneilta, jotka aktivoituivat CPZ: llä. Noin 90% (509/572 solua) TRPV1: n puutteellisista DRG-neuroneista, jotka olivat AITC-herkkiä, reagoivat CPZ: lle. CAP (1 µM, 10 s) ei indusoinut Ca2+− transientteja TRPV1−/ – neuroneissa. (F) CPZ: n (100 µM) aiheuttaman Ca2+-tulvan puute TRPA1: n puutteellisissa DRG-neuroneissa. Yksittäiset vasteet eri CAP (1 µM)-herkistä DRG-neuroneista (448 testatusta neuronista), joita CPZ tai AITC (10 µM) eivät aktivoineet.
TRPA1: n kautta tapahtuva systeeminen siedätyshoito lieventää kipua
sen jälkeen kun olimme havainneet, että CPZ on voimakas TRPA1-agonisti, ymmärsimme, miksi ensimmäiset CPZ-peräruiskeet (kahdesti päivässä) olivat ilmeisen kivuliaita WT-hiirille. Sitten määritimme CPZ: n (531 µM) peräruiskeen aiheuttaman nosifensiivisen käyttäytymisen terveillä eläimillä (kukin n = 6) laskemalla kiemurtelureaktiot ja kirjaamalla viskeromotoriset refleksivasteet (vmrs) vatsan lihaksen seinämän integroidun elektromyografian (EMG) avulla (kuva. 4 A,B). Toistettaessa kahdesti päivässä tehtyjä CPZ-hoitoja totesimme, että TRPA1: n tyrmäyksissä ei näkynyt kipuun liittyvää käytöstä missään vaiheessa. Lisäksi WT-hiirillä esiintyi aluksi voimakkaiden kipuvasteiden asteittaista vähenemistä ja jyrkkää laskua 3. päivän tienoilla, mikä johti lopulta täydelliseen siedätyshoitoon molemmissa nocifensive-parametreissä. Tämä koolon kipuaistimuksen häviäminen muuten normaaleilla hiirillä lisäsi odotuksia siitä, että peräruiskeet olisivat saattaneet antaa CPZ: lle riittävän farmakodynaamisen määrän systeemisen hypoalgesian aiheuttamiseksi. Tämän hypoteesin testaamiseksi käytimme silmänpyyhintätestiä, jossa käytettiin AITC: tä (100 µM) ja korkkia (1 mM) (Kuva. 4C, D) (n = 6). Molemmissa testeissä silmänpyyhintämäärät heikkenivät selvästi WT-hiirillä, joita oli hoidettu CPZ-peräruiskeilla (12-16 tuntiin asti ennen testiä). Nämä vaikutukset välittyivät todennäköisimmin TRPA1: n siedätyshoitona eikä TRPV1-estona, sillä TRPV1-puutoksesta kärsivät hiiret eivät olleet herkkiä sinappiöljyn (AITC, 100 µM) tiputukselle silmään samassa määrin kuin WT-hiiret (Kuva. 4c). Päinvastoin, CPZ peräruiskeet olivat tehottomia TRPA1 – / – hiirillä, kun nämä hiiret haastettiin CAP-insillaatioilla silmään (Kuva. 4D).
Kapsatsepiiniemärit turruttavat paikallisia ja kaukaisia kipuvasteita.
(A) akuutit kiemurtelureaktiot CPZ: n (531 µM) peräruiskeiden seurauksena ensimmäisten 5 minuutin aikana levityksen jälkeen. Toistuvat CPZ peräruiskeet (kahdesti päivässä) johtivat asteittaiseen kiemurteluvasteiden vähenemiseen. WT-hiirillä havaittiin dramaattinen askelvähennys viiden peräruiskeenannoksen jälkeen. Sen sijaan TRPA1−/− hiirillä, joita hoidettiin CPZ: llä (531 µM) tai WT-hiirillä, joita hoidettiin vehicle (PBS) – peräruiskeilla, näkyi vain muutamia vääntymiä, jotka tapahtuivat ensimmäisten 30 s: n aikana (kukin n = 6). (B) Visceromotor responses (Vmrs) to CPZ enemas. CPZ-peräruiskeet kahdesti päivässä johtivat VMRS: n jatkuvaan vähenemiseen WT-hiirillä samaan tapaan kuin kiemurtelureaktiot. VMR: t vasteena ajoneuvolle eivät poikenneet merkitsevästi CPZ− peräruiskeista TRPA1−/ – (molemmat n = 6). (A,B) WT CPZ group verrattuna ajoneuvoryhmään. (C) toistuvat CPZ-peräruiskeet heikentävät silmien pyyhkimistä AITC: lle (100 µM). Sekä WT− että TRPV1−/ – hiirillä, joita hoidettiin CPZ-peräruiskeilla, silmänpyyhintämäärät vähenivät huomattavasti verrattuna ajoneuvoon (molemmat N = 6). Kontrollit olivat WT-hiiriä, joilla ei ollut peräruiskeita vastaanottavan ajoneuvon (PBS) tippoja silmään. (D) CPZ-peräruiskeet heikentävät silmien pyyhkimistä suojukseen (1 mM). WT vehicle− hiirillä ja TRPA1−/−-hiirillä, joita hoidettiin CPZ-peräruiskeilla kahdesti päivässä 7 d: n ajan, havaittiin lukuisia SILMÄPYYHINTÄREAKTIOITA, jotka johtuivat CAP-peräruiskeista silmään 12 tunnin kuluttua viimeisestä CPZ-peräruiskeesta (molemmat n = 6). WT hiirillä, joita hoidettiin CPZ-peräruiskeilla, silmänpyyhintämäärät vähenivät huomattavasti. E) terminen ja F) molempien takaraajojen mekaaninen vetäytymiskynnys suun kautta annettavan CPZ (531 µM) – tai AITC (500 µM) – lääkityksen aikana juomaveden välityksellä. (E) CPZ ja AITC, joka oli yli 10 d verrattuna ajoneuvolla käsiteltyyn ryhmään, lisäsivät asteittain 3-5 d: n aikana poistoviivettä säteilylämmön stimulaatioon, joka normalisoitui 2 viikon kuluessa poistumisesta (kukin n = 6). F) Elektrodynaamisella von Frey-hehkulangalla tehtävän stimulaation mekaaniset kynnysarvot eivät osoittaneet järjestelmällistä suuntausta kummassakaan yhdisteessä (kummassakin N = 6). Kaikki toistuvat mittarit ANOVA ja dunnettin jälkitesti, paitsi (C, D) Mann Whitney U-testi.
koska toistuvat peräruiskeet ovat epämiellyttävä antoreitti, testasimme peroraalisen CPZ: n (531 µM) mahdollisen nociceptiivisen vaikutuksen juomavedessä. Yli 10 päivän juomisohjelma oli hyvin siedetty eikä selviä haittavaikutuksia ilmennyt. CPZ: n jatkuvan oraalisen annostelun aikana käpälänvetoviive säteilylämmön stimulaatioon (Hargreaves-menetelmä) lisääntyi asteittain molemmissa takaruumiissa (Kuva. 4 E). Toleranssiaika oli noin kaksinkertaistunut 7.päivänä ja pysyi merkittävästi koholla 2. päivästä 10. päivään. Kun puhdasta juomavettä oli käytetty 2 viikkoa, vetäytymisviiveet olivat palautuneet lähtötasolle. Elektrodynaaminen von Frey-hehkulangan mekaaninen reagointikyky stimulaatioon lineaarisesti kasvavalla voimalla ei vaikuttanut merkittävästi kymmenen päivän CPZ-juomisen aikana (Kuva. 4 F). Heräsi kysymys, edustiko lämpö ja kemiallinen hypoalgesia TRPA1-agonistien desensitisoinnin luokkavaikutusta vai oliko se spesifinen CPZ: lle. Niinpä annoimme AITC: tä samanlaisessa ja hyvin siedetyssä pitoisuudessa (500 µM) juomaveden kautta. Sama CPZ: lle kuvattu annos johti tassun vetäytymisviiveen asteittaiseen lisääntymiseen säteilylämmön stimulaatioon, joka oli huomattavasti pienempi kuin CPZ: n indusoima annos (Fig. 4 E). Mekaaninen reagointikyky ei muuttunut AITC-juomahoidon aikana (Kuva. 4 F).
CPZ aiheuttaa TRPA1/TRPV1: n jatkuvan desensitisaation, joka ilmentää peptidergisiä aistineuroneja
tämän jälkeen kysyimme, voiko CPZ: n aiheuttama kokonaisten eläinten desensitisaatio toistua solutasolla. Tätä varten teimme kalsiumkuvantamiskokeita eristetyillä DRG-neuroneilla, joita oli saatu kontrollihiiristä ja eläimistä, joita oli hoidettu 7 päivän ajan kahdesti päivässä CPZ-peräruiskeilla. Nämä hermosolut pidettiin kulttuurissa 16-24 tunnin ajan NGF: n läsnä ollessa. Kaikkiaan 399 neuronia kontrollihiiriltä ja 584 neuronia peräruiskeella hoidetuilta hiiriltä kuormitettiin Fura-2: lla ja aitc: n, karvacrolin, CAP: n ja KCL: ää sisältävän liuoksen herättämät kalsiumtransientit kirjattiin. Näiden TRPA1 (AITC ja karvacrol)-ja TRPV1 (CAP) – agonistien vasteet eivät merkittävästi poikenneet DRG-neuroneissa verrokkieläimistä ja peräruiskeella hoidetuista eläimistä (Kuva. S1). TRPA1 mRNA-lauseke (qPCR) oli kuitenkin noin kaksi kertaa aseteltu lumbosacral DRG: ssä, joka valmistettiin välittömästi lopullisen CPZ-peräruiskeen jälkeen (kuva. S2), kun taas TRPA1: n ilmentymisessä ei havaittu muutoksia, kun 24 tuntia oli kulunut in vivo lopullisen peräruiskeen jälkeen. TRPV1 mRNA ei muuttunut kummassakaan tapauksessa. TRPA1-geenin ekspression transkriptio oli siis tapahtunut useiden CPZ-peräruiskeiden vuoksi, mutta se kääntyi nopeasti päinvastaiseksi, kun CPZ: n tarjonta lopetettiin. DRG: n viljelyolosuhteissa sama epigeneettinen kääntyminen oli todennäköisesti tapahtunut ja kaikki jäljellä oleva CPZ oli todennäköisesti huuhtoutunut pois, joten mitään jäännösherkistymistä ei todellisuudessa voitu odottaa. Koska solumallit eivät vastanneet koko eläinten siedätyshoitoa kestänyttä CPZ: n aiheuttamaa siedätyshoitoa in vivo, etsimme toista vahvaa indikaattoria yllättävästä systeemisestä vaikutuksesta. Suurin osa nociseptiivisistä neuroneista on peptidergisiä, ja ne ilmentävät pääasiassa kalsitoniinigeeniin liittyvää peptidiä (CGRP)ja substanssia P (sp) 15,17. Depolarisaation yhteydessä, kuten KCL: n ja kalsiumin virratessa, jänniteporttisten kalsiumkanavien aktivoitumisen seurauksena, nämä neuropeptidit vapautuvat hermokuiduista kvas efferentissä toiminnossa (neurogeeninen tulehdus). Toisaalta aktivoidut TRP-kanavat ovat itsessään erittäin hyviä kalsiumjohtimia, eivätkä ne tarvitse minkään jännitesidonnaisen natrium-tai kalsiumkanavan tukea herättääkseen cgrp18: n vesikulaarisen eksosytoosin. Siten CGRP: n stimuloitu vapautuminen voi toimia (peptidergic) nociceptor-aktivaation indeksinä. Vastaavasti vasoaktiivisilla neuropeptideillä on erilaisia vaikutuksia tulehdusprosessiin sinänsä ja peptidergisen sensorisen neuronipopulaation heikentymisen tai desensitisaation on osoitettu heikentävän koliitti19, 20, 21. Sen määrittämiseksi, onko CPZ (531 µM) peräruiskeet desensitize kautta TRPA1, paikallisesti ja systeemisesti, käytimme eristetty hiiren paksusuolen ja ihon valmisteet. Terveiden c57bl/6-hiirten colonit (N = 8) altistettiin CPZ: lle (100 µM), joka aiheutti massiivisen CGRP: n vapautumisen (Kuva. 5); AITC: n (100 µM) myöhempi käyttö 5 min tai 15 min CPZ: n jälkeen (kuva. 5A, B) ei voinut enää indusoida CGRP: n vapautumista, mikä viittaa syvälliseen akuuttiin TRPA1-agonistin toiminnalliseen cross-desensitisaatioon. Tämä vaikutus ei voi johtua ehtymisestä, sillä sitä seurannut KCl (60 mM) – vaste oli normaali. CPZ: llä (531 µM) toistuvasti in vivo, kahdesti päivässä 7 d: n aikana hoidettujen hiirten paksusuolet eristettiin ja testattiin 12-16 tunnin kuluttua viimeisestä peräruiskeesta. CPZ (100 µM) ja AITC (100 µM) eivät kumpikaan aiheuttaneet CGRP: n vapautumista tässä tilassa (kuva. 5C, D); erityisesti CAP: n (30 nM) aiheuttama CGRP: n vapautuminen väheni voimakkaasti, mutta ei poistunut (Kuva. 5 E). Sen sijaan KCL: n (60 mM) indusoima CGRP: n vapautuminen epäspesifisellä depolarisaatiolla ei ollut ainoastaan vähentämätöntä, vaan itse asiassa parannettua CPZ: n peräruiskeiden jälkeen. Tämä osoitti, että koolonhermosyyt eivät olleet tyhjentyneet CGRP: stä, vaan ne olivat pikemminkin ylipitkiä, mutta ne olivat pohjimmiltaan pysyvästi turtuneet TRPA1: n ja TRPV1: n kautta tapahtuvaan kemialliseen aktivaatioon (n = 6). Lopuksi myös ihon valmiste, joka eristettiin 12-16 tuntia viimeisen CPZ-peräruiskeen jälkeen, osoitti, että AITC: n (100 µM) ja CAP: n (1 µM) indusoima CGRP: n vapautuminen väheni voimakkaasti käyttäytymistesteissä havaitun kehon laajuisen desensitisaation mukaisesti (Fig. 5F, G, KS. Kuva. 4a-F) (n = 6).
kapsatsepiinin (CPZ) aiheuttama peptidergisten tuntohermojen paikallinen ja systeeminen desensitisointi, joka johtuu kalsitoniinigeeniin liittyvän peptidin muuttuneesta vapautumisesta (CGRP).
(a) akuutti CGRP: n vapautuminen WT-hiirten eristetyistä paksusuolivalmisteista CPZ: n (100 µM) indusoimana; myöhemmät sinappiöljyaltistukset (AITC, 100 µM) eivät indusoi CGRP: n vapautumista, kun taas KCL: n (60 mM) aiheuttama epäspesifinen depolarisaatio tehoaa normaalisti. Tiedot ovat keskiarvoja + SEMs (n = 8). (B–D) CPZ: n (100 µM)- ja AITC: n (100 µM)-indusoima CGRP: n vapautuminen poistui hiiriltä, joita oli aiemmin hoidettu CPZ: n peräruiskeilla kahdesti päivässä 7 d: n ajan release-koetta edeltävään päivään asti, kun taas CAP: n (1 µM)-indusoima CGRP: n paksusuolen vapautuminen väheni voimakkaasti, mutta ei poistunut näillä hiirillä kontrolleihin verrattuna. (**P < 0, 01, ***P < 0, 001, Mann Whitneyn U-testi, jokainen n = 6). (E) samoin AITC: n (100 µM) indusoima CGRP: n vapautuminen poistui hiirten takaruumiista eristetyissä ihonäytteissä, joita oli aiemmin hoidettu CPZ-peräruiskeilla. (F) sen sijaan CAP: n (1 µM) aiheuttama CGRP: n vapautuminen näiden hiirten iholta väheni voimakkaasti kontrolleihin verrattuna. (**P < 0, 01, ***P < 0, 001, Mann Whitneyn U-testi, jokainen n = 6). Huomaa, että kaikki KCL (60 mM)-vasteet desensitisoidun CPZ-ja AITC-vasteen jälkeen olivat normaaleja (B,C,E), kun taas epätäydellisesti desensitisoidun CAP-stimuloidun neuronipopulaation (D, F) KCL-vasteet pienenivät yhtä paljon kuin kaikissa kontrollikokeissa,mikä viittaa CGRP-kaupan ehtymiseen, joka estyy CPZ/AITC-herkän neuronin alapopulaation tehokkaalla desensitisoinnilla.
