johtaa

solujen P107-tasojen modulaatioon kontrolloidun proteolyysin avulla. Olemme aiemmin osoittaneet, että endogeeninen p107, joka kuuluu RB–proteiiniperheeseen ja joka ei ole scfßtrcp: n luonnollinen substraatti, voidaan eliminoida c33a-kohdunkaulan karsinooman soluissa kimeerisen ßTrCP: n ubikitiiniproteiiniligaasin (ßTrCP-E7N) ektooppisella ilmentymisellä, jossa on HPV-onkoproteiinin E7 (E7N) n-terminaalisista 35-aa-jäämistä johdettu P107-sitova peptidi (1). Monien soluproteiinien toimintaa sanelee kuitenkin niiden solunsisäinen runsaus, eikä pelkästään niiden läsnäolo tai puuttuminen. Tähän mennessä ei ole ollut luotettavaa menetelmää, jolla nisäkässolujen solunsisäisiä proteiinipitoisuuksia voitaisiin tarkasti moduloida.

selvitimme ensin, voitaisiinko p107-pitoisuuksia systemaattisesti vähentää säätelemällä erilaisia määriä ßTrCP-E7N: ää. ihmisen c33a-kohdunkaulan karsinooman solut saivat lisääntyviä annoksia rekombinanttia adenovirusta, joka kantoi ßTrCP-e7n: ää, tai kontrolliadenovirusta 24 tunnin ajan. Infektio oli 100%, jopa pienimmällä käytetyllä annoksella, arvioituna adenoviruksen kantaman GFP: n ilmentymisen perusteella kaikissa vastaanottajasoluissa (tietoja ei näy). Kuten kuvassa. 1 (Ylempi) endogeeniset p107-tasot pienenivät järjestelmällisesti 78%: iin, 25%: iin ja 5%: iin vakaan tilan pitoisuuksista, kun c33a-soluja transduktioitiin rekombinantilla ßTrCP-E7N-adenoviruksella, kun AD1-kontrolliviruksen mois oli 10, 35 ja 80 mutta ei samoja annoksia. Siksi suunniteltu SCFßTrCP-BP tarjoaa yksinkertaisen ja toistettavissa olevan keinon vähentää kohdeproteiinien kokonaismääriä määritellyillä tasoilla biologisiin toimintoihin kohdistuvien annosvaikutusten määrittämiseksi.

P107 liittyy vakaasti sykliini A: han ja Cdk2: een suuren affiniteetin sitoutumiskohdan kautta jakautuvissa soluissa (13-15). Tutkittaessa, altistuvatko nämä P107: ään liittyvät proteiinit myös ßTrCP-E7N: n kohdennetulle hajoamiselle, tehtiin immunoblottaus Ad-F-TrCP-e7n-viruksen infektoimissa c33a-soluissa. Kuten kuvassa. 1, endogeeniset sykliini A: n ja Cdk2: n tasot pysyivät muuttumattomina, kun taas p107: n säätely väheni dramaattisesti. F-TrCP-E7N ei myöskään vaikuttanut kohdentamattoman β-aktiinin pitoisuuksiin (Kuva. 1). Tämä tulos antoi vahvaa näyttöä siitä, että suunniteltu ßTrCP-E7N ubikitiiniproteiiniligaasi nimenomaan hajottaa kohdesubstraattia p107, mutta ei siihen liittyviä proteiineja.

spesifisen Translationaalisesti muutetun Kohdeproteiinin alapopulaation selektiivinen hajoaminen. Solun proteiinin muuttaminen translaation jälkeisellä tasolla, kuten fosforylaatio, on perustavanlaatuinen keino, jota solut käyttävät säätelemään proteiinin toimintaa tai antamaan uusia toimintoja. Kokeelliset välineet tiettyyn translaation jälkeiseen muunnostapahtumaan liittyvän funktion leikkelemiseen ovat tällä hetkellä rajalliset. Koska proteiini knockout toimii translaation jälkeisellä tasolla, joka tunnistaa kohdeproteiinit suoraan, yksi sovellus on luoda erityinen E3, joka pystyy valitsemaan alipopulaation translationaalisesti muunnetuista proteiineista hajoamista varten sen sijaan, että tuhoaisi koko populaation.

HPV16 E7: n havaittiin sitoutuvan selektiivisesti RB: n hypofosforyloituun muotoon (16). Selvitimme, pystyisikö kimeerinen ßTrCP-E7N ubikitiini-proteiiniligaasi erottamaan hypo – ja hyperfosforyloidun RB: n ja valitsemaan hajoamiseen vain hypoformin. Ihmisen u2os-osteosarkoomasolut ilmentävät RB: n molempia muotoja, jotka voidaan helposti tunnistaa niiden erilaisen elektroforeettisen liikkuvuuden perusteella SDS/sivulla (Kuva. 2A, kaista 1) (17). Näiden kahden RB-lajin identiteetti varmistettiin lisäksi immunoblottauksella käyttäen vasta – aineita, jotka ovat spesifisiä joko hypo-tai hyperfosforyloiduille RB-muodoille (Kuva. 2A, kaistat 2 ja 3). U2os-solut infektoituivat rekombinantilla Ad-F-TrCP-E7N: llä tai kontrolloiduilla Ad1-adenoviruksilla 48 tunnin ajan, ja RB-P: n ja RB: n vakaan tilan tasot analysoitiin samanaikaisesti Western-blottauksella käyttäen anti-RB monoklonaalista vasta-ainetta, joka tunnistaa molemmat muodot. Sen mukaisesti, että E7N sitoutui ensisijaisesti hypofosforyloituun RB: hen, F-TrCP-E7N: n ektooppinen ilmentyminen johti hypofosforyloidun RB: n eliminoitumiseen, kun taas hyperfosforyloitu RB-P jätettiin ennalleen (Kuva. 2b Ylempi, vertaa kaistoja 4-6 kaistoja 1-3). Tämä tulos korostaa F-TrCP-E7N ubikitiiniproteiiniligaasin kykyä valita erityinen RB: n alapopulaatio hajoamista varten, mikä perustui kohdeproteiinin tiettyjen translaation jälkeisten muutosten tilaan.

täyspitkällä HPV16 E7: llä saattoi olla yhteisvaikutuksia sykliinistä riippuvaisten kinaasinestäjien p21Waf1: n ja p27Kip1: n kanssa, mutta sitova domeeni yhdistettiin C-terminaaliseen domeeniin (jäämät 40-98) e7n-fragmentin (jäämät 18-20) sijaan. F-TrCP-E7N: n spesifisyyden tutkimiseksi samoista U2OS-soluuutteista tutkittiin myös p21waf1: n ja p27Kip1: n vasta-aineita. Kuten kuvassa. 2B (keskellä), p21waf1: n ja p27Kip1: n vakaan tilan tasot pysyivät muuttumattomina. Yhdessä suunniteltu F-TrCP-E7N osoitti proteolyyttistä spesifisyyttä RB-perheen proteiineja kohtaan, mutta ei muita solusyklin säätelijöitä, kuten Cdk2, sykliini A, p21Waf1 ja p27Kip1.

rakenteeseen perustuva mutageneesi tuottaa erittäin spesifisen ßTrCP-E7N Ubikitiiniproteiiniligaasin. Kimeerinen ßTrCP-E7N pystyy edelleen sitomaan endogeenisia ßTrCP-substraatteja, kuten IKB: tä, β-kateniinia ja ATF4: ää (3-7). ßTrCP-E7N: n yliekspressio saattaa häiritä näiden paikallisten substraattien hajoamista. Toisaalta endogeenisen substraatin sitoutuminen ßTrCP-E7N: ään saattaa häiritä aiotun substraatin asianmukaista sijoittamista ubikitiinin hyväksymiseksi ubikitiinikonjugoituvasta entsyymistä ja siten vähentää kohdennetun hajoamisen tehokkuutta (Fig. 3AUpper). Lisäksi ßTrCP vuorovaikuttaa pseudosubstraatti hnRNP-U: n kanssa, joka kytkee ßTrCP: n ja sen johdannaiset tumaan ja estää niiden vuorovaikutuksen substraattien kanssa (21). Ottamalla käyttöön ßTrCP: n aminohappojäämien erityisiä mutaatioita sen sitoutumisen estämiseksi β-kateniiniin, IkB: hen tai hnRNP-U: hun ennakoimme parantavamme paitsi spesifisyyttä myös suunnitellun ßTrCP-E7N: n saatavuutta aiotun substraatin rekrytoimiseksi (Kuva. 3ALower).

ßTrCP: n substraattia sitova domeeni sisältää seitsemän WD40-toistoa C-terminaalialueella, jotka taittuvat tyypilliseen seitsenlapaiseen β-potkurirakenteeseen, joka säilyy WD40-proteiineissa (3-7). Koska WD40-proteiinien β-potkurirakenteen yleinen eheys on kriittinen niiden toiminnan kannalta, standardoitu deleetiomutageenisuus aiheuttaa todennäköisesti suuria rakenteellisia muutoksia, eikä sitä näin ollen voida soveltaa substraattisitoutumiskohtien määrittelyyn ßTrCP: llä. WD40-proteiinien tunnettua kiderakennetta voidaan kuitenkin hyödyntää tunnistamaan pintojen jäämiä, jotka osallistuvat βtrcp: n substraattien sitomiseen. Rakenteeseen perustuvan mutageenisen lähestymistavan tarkoituksena oli tunnistaa ja mutatoida viisi positiivisesti varautunutta jäämää (R285, K365, R474, R521 ja R524), joiden ennustettiin oleskelevan WD40 β-potkurin yläpinnalla ja jotka osallistuvat sitoutumiseen WD40-proteiineihin (Kuva. 3b) (22). Tämä lähestymistapa esitettiin yksityiskohtaisesti Tukimenetelmissä, jotka julkaistaan tukitietoina PNAS-verkkosivustolla. Katso myös kuva. 6, joka julkaistaan tukitietona PNAS-verkkosivustolla. Lisäksi näiden Lys/Arg-jäämien substituutiot eivät todennäköisesti muuta ßTrCP: n kokonaisrakennetta.

käyttämällä QuikChange multisite-directed mutagenesis kit (Stratagene), olemme samanaikaisesti mutatoituneet nämä jäämät Glu. Tällä lipulla merkityllä yhdistemutantilla, jonka nimi on F-TrCP(m1) – E7N, testattiin sen sitoutumista sekä endogeeniseen (IkB) että aiottuun (p107) tyrmäyskohteeseen. HeLa-solut transfektoitiin ohimenevästi F-TrCP(m1)-e7n: llä tai F-TrCP-E7N: llä, ja niiden yhteisvaikutukset IkB: n ja p107: n kanssa määritettiin koimmunopresipitaatiolla. F-TrCP-E7N: llä ja F-TrCP: llä oli samanlaiset affiniteetit fosforyloituneen IkB-proteiinin kanssa, kun taas yhdisteen M1-mutaatiot poistivat F-TrCP(m1) – E7N: n sitoutumisen (Kuva. 3c keskellä). Sen sijaan samanlaisia P107-pitoisuuksia havaittiin F-TrCP-E7N: n tai F-TrCP(m1)-E7N: n immunokomplekseissa (Kuva. 3c alempi), mikä osoittaa, että suunniteltu F-TrCP(m1)-e7n ubikitiini–proteiiniligaasi on täysin toimiva värvättäessä aiottuja solukohteita. Nämä tulokset ovat linjassa Fig: n rakenteellisten ennusteiden kanssa. 3B, ja edelleen määritellä aminohappo jäämiä ßTrCP kriittinen endogeenisen substraatin tunnistamista.

suunnitellun F-TrCP(m1)-E7N: n tehoa degeneroituvassa endogeenisessa P107: ssä analysoitiin edelleen. C33A-solut kokransfektoitiin F-TrCP: llä, F-TrCP-E7N: llä tai F-TrCP(m1)-E7N: llä yhdessä CD19-ekspressioplasmidin kanssa. Neljäkymmentäkahdeksan tuntia verensiirron jälkeen solut kerättiin ja rikastettiin niitä varten, jotka saivat transfektoituja plasmideja, käyttämällä immunomagneettisia helmiä, jotka oli konjugoitu anti-CD19-monoklonaaliseen vasta-aineeseen. Endogeeniset p107-pitoisuudet määritettiin tämän jälkeen immunoblottauksella. Kuten kuvassa. 3D, kohdunulkoinen ilmentyminen F-TrCP(m1)-E7N johti 95%: n endogeenisten P107-tasojen vähenemiseen, kun taas P107: n 82%: n aleneminen havaittiin F-TrCP-E7N: llä (Kuva. 3D Ylempi, vertaa kaistat 4 ja 3). F-TrCP(m1)-E7N: n ilmentymisellä ei myöskään ollut havaittavaa vaikutusta tuumorinekroositekijä (TNF)-α: n indusoimaan IKB: n hajoamiseen alkuperäisen SCFßTrCP: n toimesta eikä p27kip1: n tuhoutumiseen scfskp2: n ubikitiiniproteiiniligaasien toimesta (tietoja ei näy). Siksi suunnitellun F-TrCP: n(m1)-E7N: n kohdunulkoinen ilmentyminen ei vaikuta SCF: n ubikitinaatioaktiivisuuteen litistämällä endogeenisten F-box-proteiinien yhteisiä SCF: n ydinkomponentteja (Skp1, CUL-1 ja Rbx1/Roc1).

kohdennettua P107-hajoamista arvioitiin edelleen yksittäisissä c33a-soluissa epäsuoralla immunofluoresenssimäärityksellä. Johdonmukaisesti p107 hävitettiin suurelta osin C33a-soluista, jotka ilmaisivat F-TrCP-E7N tai F-TrCP(m1)-E7N, mutta ei pelkästään F-TrCP (Kuva. 3 E). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että eliminoimalla endogeenisten ßTrCP-substraattien sitoutumispaikat suunniteltu F-TrCP(m1)–e7n ubikitiiniproteiiniligaasi osoitti lisääntynyttä spesifisyyttä ja vankkaa proteolyyttistä aktiivisuutta aiottuun kohteeseen nähden.

minimaalinen Sitoutumiskohde Kohdistuspeptidinä tehokkaaseen Substraattirekrytointiin. Saavuttaaksemme substraatin rekrytoinnin korkean spesifisyyden ja minimoidaksemme muiden soluproteiinien epäspesifisen kohdentamisen testasimme, voisiko e7n: n (nimetty e7m) pienin P107/RB-vuorovaikutusalue, joka sisältää jäämiä 21-29 E7: stä, jotka ulottuvat lxcxe-motiiviin (23), saavuttaa P107: n tehokkaan sitomisen ja hajoamisen. Rakennettiin kimeerinen ubikitiini–proteiiniligaasi, jossa ßTrCP ja E7m sidottiin kovalenttisesti yhteen joustavalla 20-aa-spacerilla, joka koostui 10 kopiosta Gly-Ser-toistoja (nimetty 10gs). F-TrCP-E7N tai F-TrCP-10GS-E7m transfektoitiin ohimenevästi c33a-soluiksi, ja niiden sitoutumista endogeeniseen p107: ään arvioitiin immunopresipitaatiolla uutteissa, jotka valmistettiin proteasomin estäjällä MG132 tapahtuneen käsittelyn jälkeen tämän yhteisvaikutuksen aiheuttaman hajoamisen estämiseksi. Kuten kuvassa. 4A (kaistat 2 ja 3), F-TrCP-10GS-E7m: n affiniteetti P107: ään oli hieman suurempi kuin alkuperäisen F-TrCP-E7N: n. F-TrCP-E7N: n ja F-TrCP-10GS-E7m: n tehokkuutta P107: n hajoamisessa c33a-soluissa ohimenevän transfektion avulla arvioitiin edelleen, kuten kuvassa. 3D. kuten kuvassa. 4B, F-TrCP-E7N ja F-TrCP-10GS-E7m indusoivat jopa 92-ja 95-prosenttisesti P107: n säätelyä, mikä osoittaa, että suunniteltu ßTrCP, jossa on pienin P107: ää sitova domeeni, toimii yhtä tehokkaasti kuin alkuperäinen F-TrCP-e7n hajottavissa kohdeproteiineissa.

Retroviraalivälitteinen suunniteltu ßTrCP: n toimitus endogeenisten kohteiden pysyvään hajoamiseen. Seuraavaksi tutkimme, voitaisiinko ubikitiini-proteiiniligaasit ilmaista vakaasti, jotta aiottu kohde hajoaisi pysyvästi. HL-60 promyelosyyttiset leukemiasolut transdukoitiin rekombinanttisilla retroviruksilla, jotka ilmentävät PBMN-GFP: tä, F-TrCP(m1)-E7N: ää tai kontrollia F-TrCP-E7N(ΔDLYC), jolloin RB/p107-sitoutumiskohta poistettiin (1). Infektoituneet solut, joissa oli kromosomaalisesti integroituneet kimeeriset F-TrCP-transgeenit, eristettiin FACS-lajittelulla, joka perustui GFP: n ilmentymiseen viruksista, ja endogeenisen p107: n hajoamista arvioitiin infektoituneista HL-60-soluista joko välittömästi tartunnan jälkeen (kuva. 5A)tai 3 kuukauden viljelyn jälkeen kasvualustassa (Kuva. 5b). Lisäksi, koska kaksi muuta RB-perheen proteiinia, RB ja p130, ilmaistaan myös HL-60-soluissa, tutkimme, voiko yksittäinen F-TrCP-E7N samanaikaisesti kohdistaa koko RB-proteiiniperheen hajoamista, jotka ovat vuorovaikutuksessa e7n: n saman lxcxe-motiivin kanssa. ektooppinen ilmentymä retroviraalisesti transduktoidusta F-TrCP-E7N: stä indusoi RB: n hypofosforyloidun muodon dramaattisen alasäätelyn sekä p107: n (kuva. 5A) ja p130 (tietoja ei näy) HL-60-soluissa joko välittömästi tartunnan ja Faks-lajittelun jälkeen (kuva. 5A)tai 3 kuukautta tartunnan ja jatkuvan viljelyn jälkeen (kuva. 5B, kaista 3). Sen sijaan F-TrCP-E7N: n(ΔDLYC) stabiili ilmentyminen HL-60-soluissa ei vaikuttanut p107, RB: n muuttumiseen (Kuva. 5A, kaista 3) ja P130-tasot (tietoja ei näy). Yhdenmukainen sen havainnon kanssa, että F-TrCP-E7N ensisijaisesti hajottaa hypofosforyloitua RB: tä U2OS-soluissa (Kuva. 2), hyperfosforyloitujen RB-lajien väheneminen F-TrCP-E7N: n stabiililla ilmentymisellä oli vähäisempää verrattuna hypofosforyloituun muotoon HL-60-soluissa (Kuva. 5A, vertaa kaistaa 2 PRB ja pRB-P).

all-trans retinoiinihapolla (ATRA) hoidettaessa HL-60-solut poistuvat solusyklistä ja erilaistuvat lopullisesti. Hypofosforyloidun RB: n kertymistä havaittiin, minkä on aiemmin raportoitu edistävän Atran aiheuttamaa kasvun pysähtymistä, kun taas hyperfosforyloitua RB: tä ei ollut havaittavissa (24, 25). Sen tutkimiseksi, voidaanko SCFßTrCP-kone käyttää myös solusyklin poistumisen aikana, HL-60-soluja, jotka ilmentävät vakaasti F-TrCP-E7N: ää tai F-TrCP(m1) – E7N: ää, käsiteltiin 1 µM ATRALLA 72 tunnin ajan, ja RB-perheen proteiinien hajoamista arvioitiin. F-TrCP-E7N: ää stabiilisti ilmentävien HL-60-solujen RB -, P107-ja P130-tasot laskivat 95%, 98% ja 85% verrattuna kontrollin pbmn-GFP-viruksella infektoituneisiin soluihin (Kuva. 5B, kaista 2). Koska ATRA aktivoi myös geenien transkription Moloney-hiiren leukemiaviruksen LTR: n (Pbmn-GFP (26)) valvonnassa, F-TrCP-E7N: n lisääntynyt ilmentyminen ATRA-hoidossa todennäköisesti edisti P107: n, p130: n ja hypofosforyloidun RB: n tehokasta alasäätelyä (Kuva. 5b).

RB-perheen proteiinien vaikutusta normaaliin solusyklin etenemiseen on tutkittu hiiren alkion fibroblasteissa, joissa on häiriöitä RB -, p107-ja p130-geeneissä, ja niiden on todettu olevan reagoimattomia signaaleihin, jotka aiheuttavat G1: n pysähtymisen, kuten kasvutekijän vetäytymisen tai DNA-vaurion (27, 28). Kuitenkin, kollektiivisia vaikutuksia RB perheenjäsenten tuumorisolujen proliferaatiota ei ole tutkittu, koska tehokas Käänteinen geneettinen työkaluja. Tämän tutkimuksen F-TrCP: tä(m1)-E7N ilmentävät vakaat HL-60-solut antoivat meille mahdollisuuden arvioida, miten kaikkien kolmen RB-perheen proteiinin puutteelliset kasvainsolut reagoivat G1-pysäytyssignaaleihin. Eksponentiaalisesti kasvavissa HL – 60-soluissa, jotka ilmensivät RB-perheen proteiinien konstitutiivista hajoamista F-TrCP(m1)-E7N, havaittiin solusyklin etenemisen huomattavaa kiihtymistä verrattuna kontrollin pbmn-GFP-viruksen infektoimiin soluihin (Kuva. 5c vasemmalla). Tämä tulos on yhdenmukainen RB–/–, p107–/– ja P130–/– kolminkertainen knockout hiiren alkion fibroblasteissa (27, 28) Havaittujen G1– s-siirtymien heikentyneen kontrollin kanssa.

ATRA-hoito esti G1-S-faasimuutoksen kontrollin pbmn-GFP infektoimissa HL-60-soluissa (Kuva. 5C) tai F-TrCP-E7N(ΔDLYC) – virus (tietoja ei näy), joka on yhdenmukainen sen kanssa, mitä raportoitiin tartuttamattomista HL-60-soluista (Kuva. 5c) (24). Myös pBMN–F-TrCP(m1)-E7N/HL-60-soluissa havaittiin G1-s-siirtymän aluksi viivästymistä 48 tunnin kuluttua Atran jälkeen. Täydellistä G1-estoa ei kuitenkaan voitu saavuttaa myöhemmässä vaiheessa (72-96 h), ja solut jatkoivat solusyklin etenemistä (Kuva. 5c). Kontrollin pbmn-GFP/hl-60-solut sen sijaan estyivät kaikki G1: ssä 72-96 tunnin välillä. nämä havainnot viittaavat siihen, että RB-perheenjäsenten F-TrCP(m1)–E7N-välitteinen hajoaminen heikentää kasvupysähdyksen loppuunsaattamiseen tarvittavaa myöhäistä ATRA-vastetapahtumaa, kun taas G1-s: n etenemisen varhainen vaimeneminen ei juurikaan vaikuttanut. Lisäksi solumäärät vähenivät dramaattisesti 72-96 tuntia ATRA-hoidon jälkeen, mikä johtui massiivisesta solukuolemasta Atran indusoiman solusyklin poistumisen ja erilaistumisen aikana (29). Silmiinpistävää on, että hl-60-solut, jotka ilmentävät F-TrCP(m1) – E7N: ää, lisääntyivät subG1-populaatioissa keskimäärin 2-3– kertaisesti verrattuna kontrolliviruksen infektoimiin HL– 60– soluihin (tietoja ei näy), mikä vastaa lisääntynyttä solukuolemaa RB–/–, p107–/-ja P130 – / – kolminkertainen knockout hiiren alkion fibroblastisoluissa kasvua estävissä olosuhteissa (28). Yhdessä F-TrCP(m1)-E7N: n konstitutiivinen ilmentyminen indusoi koko RB-perheen proteiinien alasäätelyä, mikä johtaa kasvun pysähtymisen estymiseen ja solukuolemien lisääntymiseen ATRA-hoidon aikana.

Atran indusoimaan G1: n pysäyttämiseen liittyy useiden solusignaalien / komponenttien koordinoitu säätely, joka vaikuttaa negatiivisesti solusykliin (tarkasteltu ref. 30). Dimberg ym. (31) ilmoitti, että ATRA laukaisee myelooisissa soluissa tapahtumasarjan, johon liittyy p21waf1: n ilmentymisen varhainen lisääntyminen, p27kip1: n stabiloituminen ja myöhemmin RB: n defosforylaatio G1: n pysähtymisen alkaessa. Koska ßTrCP (m1)-E7N heikentää vain RB-perheen jäseniä eikä sillä ole vaikutusta p21waf1: n ja p27kip1: n stabiiliuteen, on todennäköistä, että tämä vaikuttaa vain myöhäiseen, RB-riippuvaiseen ATRA-vasteeseen, joka on yhdenmukainen pbmn-F–TrCP(m1) – E7N/HL-60-solujen resistenssin kanssa G1-pidätyksen 72-96 h täyttämiseksi (Kuva. 5c). Atra: n havaittu varhaisen kasvun estyminen 48 tunnin kohdalla (Kuva. 5C) voitaisiin katsoa johtuvan ainakin osittain p21waf1: n ja p27kip1: n säätelystä, joiden stabiilisuuteen konstitutiivinen F-TrCP(m1)-E7N-ilmaisu (Figs. 2 ja 5).