ihmisen solupinnan merkkiepiteeliseulonta

hESC-ja hPSC-RPE-solut dissosioitiin yksittäissoluiksi Tryplen avulla 5-10 minuutin ajan. Optiset vesikkelit dissosioitiin yksittäissoluiksi TrypLE Selectillä (Gibco, Invitrogen) 10 minuutin ajan, minkä jälkeen fyysinen dissosiaatio tapahtui 20 G: n neulalla. Jotta nämä eri populaatiot voitaisiin analysoida samanaikaisesti samassa näytteessä, hESC -, hPSC-RPE-solut ja optiset vesikkelisolut merkittiin celltrace™ CFE: llä (0, 25 µM) 7 minuutin ajan 37 °C: ssa tai Celltrace™ violetilla (5 µM) 20 minuutin ajan 37 °C: ssa valmistajan protokollan (Thermo Fisher Scientific) mukaisesti. Sitten kolme solutyyppiä värjättiin BD Lyoplate™ – Seulontapaneeleilla (BD Biosciences) valmistajan protokollan mukaisesti. Solujen viivakoodaus mahdollisti kolmen soluryhmän helpon erottamisen toisistaan ja näytteen vaihtelun minimoimisen seulonnan aikana. Näytteet analysoitiin 96-kuoppalevyillä lsrfortessa, jossa oli 405, 640, 488, 355 ja 561 nm laserit (BD Biosciences) tai Sytoflex, jossa oli 405, 638, 488 ja 561 nm laserit (Beckman Coulter). Elinkyvyttömät solut jätettiin pois analyysistä käyttäen 7-AAD (7-aminoaktinomysiini D) – nukleiinihappoväriainetta (BD Biosciences). Aineisto analysoitiin FlowJo v. 10-ohjelmiston (Tree Star) avulla. Solupinnan merkkinäyttö suoritettiin kerran 3D-optisille vesikkeleille ja kerran hPSC-RPE-päivälle 60.

soluviljelmä

hESC-linjat HS980 ja HS983 on aiemmin johdettu ja viljelty ksenovapaissa ja määritellyissä ehdoissa30 (Swedish Ethical Review Authority: 2011/745:31/3). Luovuttajat antoivat tietoon perustuvan suostumuksensa hESC-linjojen johtamiseen ja myöhempään käyttöön. WICELLILTÄ saatiin WA09/H9 hESC-linja, joka sovitettiin syöttöaineettomalle viljelmälle hrLN-521: llä (10 µg / mL, Biolamina). Soluja ylläpidettiin kloonisella etenemisellä hrLN-521-pinnoitetuilla levyillä NutriStem hPSC XF-väliaineessa (biologiset teollisuudenalat), 5% CO2/5% O2-inkubaattorissa ja syötettiin entsymaattisesti suhteessa 1:10 5-6 päivän välein.

hiPSC-linjat CTRL-7-II, CTRL-9-II, CTRL-12-I ja CTRL-14-II on ystävällisesti toimittanut Karolinska Institutet iPSC Core facility (Ruotsin eettinen Arviointiviranomainen: 2012/208-31/3, 2010/1778-31/4). Luovuttajat antoivat tietoon perustuvan suostumuksensa hiPSC-linjojen johtamiseen ja myöhempään käyttöön. Soluja ylläpidettiin kloonisella lisäyksellä hrLN-521-pinnoitetuilla levyillä (Biolamina) NutriStem hPSC XF-väliaineessa (biologiset teollisuudenalat), 5% CO2/5% O2-inkubaattorissa ja syötettiin entsymaattisesti suhteessa 1:10 5-6 päivän välein.

ohivuotoa varten yhdistelmäviljelmät pestiin kahdesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ilman Ca2+: A ja Mg2+: A ja inkuboitiin 5 minuutin ajan 37 °C: ssa, 5% CO2 / 5% O2 tryple Selectillä. Tämän jälkeen entsyymi poistettiin huolellisesti ja solut kerättiin tuoreeseen esilämmitettyyn NutriStem hPSC XF-väliaineeseen hellävaraisella pipetoinnilla, jotta saatiin yksisoluinen suspensio. Kennot sentrifugoitiin 300 × g: n tarkkuudella 4 minuutin ajan, pelletti suspendoitiin uudelleen tuoreeseen esilämmitettyyn NutriStem hPSC XF-väliaineeseen ja kennot pinnoitettiin tuoreelle hrLN-521-pinnoitetulle astialle. Kaksi päivää kulun jälkeen väliaine vaihdettiin tuoreeseen esilämmitettyyn NutriStem hPSC XF-väliaineeseen ja vaihdettiin päivittäin.

hPSC-RPE monolayer differentiation

porrastettu protokolla, joka kuvaa differentiaatioprotokollaa, löytyy osoitteesta Protocol Exchange36. hESC tai hiPSC pinnoitettiin Solutiheydellä 2,4 × 104 solua/cm2 laminiinipäällysteisillä astioilla (20 µg/mL) NutriStem hPSC XF-mediumilla. Rho-kinaasi-inhibiittoria (Y-27632, Millipore) lisättiin 10 µM: n pitoisuutena ensimmäisen 24 tunnin aikana, kun taas soluja säilytettiin 37 °C: ssa, 5% CO2/5% O2. 24 tunnin kuluttua hPSC-kasvualusta korvattiin erilaistumisalustalla NutriStem hPSC XF ilman perustavaa fibroblastikasvutekijää (bFGF) ja muuntava kasvutekijä-β (TGFß) (biologiset teollisuudenalat) ja solut asetettiin 37 °C: n lämpötilaan, 5% CO2/21% O2. Levitykseen lisättiin 6.päivästä alkaen 100 ng/mL Activin A: ta (r&D Systems). Soluja syötettiin kolme kertaa viikossa ja säilytettiin 30 päivän ajan. Tämän jälkeen trypsiini tehtiin TrypLE Selectillä (Gibco, Invitrogen) 10 minuutin ajan 37 °C: ssa, 5% CO2: ssa. Entsyymi poistettiin huolellisesti ja solut kerättiin tuoreeseen esilämmitettyyn NutriStem hPSC XF-väliaineeseen ilman bFGF: ää ja TGFß: ää hellävaraisella pipetoinnilla yksisolususpension saamiseksi. Kennot sentrifugoitiin 300 × g: n tarkkuudella 4 minuutin ajan, pelletti suspendoitiin uudelleen, se johdettiin solusiivekkeen (ø 40 µm, BD Biosciences) läpi ja kennot kylvettiin laminiinipäällysteisiin astioihin (hrLN-111 ja hrLN-521 20 mg/mL) eri solutiheyksillä 1, 4 × 106-1, 4 × 104 solua/cm2. Uusittuja soluja ruokittiin kolmesti viikossa seuraavien 30 päivän aikana NutriStem hPSC XF-mediumilla ilman bFGF: ää ja TGFß: ää. HPSC-RPE in vitro-eriytymisessä 3D-suspensiossa EBs noudatimme aiemmin julkaistua protocol10-protokollaa. Pluripotentit kantasolut viljeltiin lyhyesti rhln-521: n yhtymäkohdaksi ja kaavittiin käsin EBs: n tuottamiseksi 1000 µL: n pipetin kärjellä. Tämän jälkeen EBs: ää viljeltiin suspensiona matalilla Kiinnityslevyillä (Corning), joiden tiheys oli 5-7 × 104 solua/cm2. Eriyttäminen tehtiin mittatilaustyönä NutriStem hESC XF-mediumilla, jossa bFGF ja TGFß on eliminoitu mediamuutoksella kahdesti viikossa. Kymmenen mikromoolia Rho-kinaasin estäjää (Y-27632, Millipore) lisättiin suspensioviljelmiin vain ensimmäisen 24 tunnin aikana. 5 viikon erilaistumisen jälkeen EBS: stä leikattiin mekaanisesti pigmentoituneet alueet skalpellilla. Tämän jälkeen solut irrotettiin TrypLE Select-valmisteella, minkä jälkeen ne huuhdeltiin 20 G: n neulalla ja ruiskulla. Solut kylvettiin solusiivilän (ø 40 µm, BD Biosciences) läpi LN-pinnoitettuihin astioihin, joiden solutiheys oli 0.6-1, 2 × 104 solua/cm2 ja ruokitaan kahdesti viikossa samalla edellä mainitulla erilaistumisalustalla. Kirkkaita kenttäkuvia hankittiin Nikon Eclipse TE2000-s-mikroskoopilla ja Canon SX170 IS-kameralla kuvattiin pigmenttiä kaivojen päältä.

kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR

kokonais-RNA eristettiin käyttäen Rneasy Plus Mini-pakkausta ja hoidettiin rnaasivapaalla Dnaasilla (molemmat qiagenista). Komplementaarinen DNA (cDNA) syntetisoitiin käyttämällä 1 µg kokonais-RNA: ta 20 µL: n reaktioseoksessa, joka sisälsi satunnaisia heksameerejä ja Superscript III-käänteiskopioijaentsyymiä (Gibco, Invitrogen) valmistajan ohjeiden mukaan.

Virtaussytometria

solujen lajittelu suoritettiin hPSC-RPE-viljelmillä 21 tai 30 päivän erilaistumisen jälkeen. Soluja inkuboitiin mainituilla konjugoituneilla vasta-aineilla jäällä 30 minuutin ajan. FMO-kontrollit sisällytettiin kuhunkin sairauteen negatiivisten ja positiivisten solujen tunnistamiseksi ja porttikieltoisten solujen tunnistamiseksi. Värjätyt solut lajiteltiin BD FACS Aria Fusion Cell Lajittelijalla (BD Biosciences) käyttäen FACSDiva Sofware v8.0.1-ohjelmaa.

heti lajittelun jälkeen 70 000 solua, jotka oli laimennettu 100 µL: aan 2% FBS: ää ja 1 mM EDTA: ta (Sigma), sytospinnattiin 5 minuutin ajan 400 kierrosta minuutissa lasilevyille. Diojen annettiin kuivua yön yli huoneenlämmössä, minkä jälkeen ne kiinnitettiin 4-prosenttiseen metanolittomaan formaldehydiin huoneenlämmössä 10 minuutin ajaksi ja immunofluoresenssivärjättiin.

immunofluoresenssi

histologia ja kudos-immunosuppressiivinen

välittömästi eutanasian jälkeen laskimoon annetulla 100 mg / kg pentobarbitaalilla (Allfatal vet. 100 mg/mL, Omnidea), silmät oli enukleoitu ja bleb-injektioalue merkitty vihreällä Kudosmerkinnällä (TMD) (Histolab-tuotteet). 100 µL: n kiinnitysliuos (FS), joka koostui 4-prosenttisesta puskuroidusta formaldehydistä (Solvenco AB), injektoitiin silmän lasiaiseen ennen FS: ään kiinnittämistä 24-48 tunnin ajaksi ja parafiiniin upottamista. Neljän mikrometrin sarjalohkot tuotettiin TMD-merkityn alueen läpi ja joka neljäs osa värjättiin hematoksyliini–eosiinilla.

immunostisoivissa aineissa diat depaffinoitiin ksyleeniin, dehydratoitiin lajiteltuihin alkoholeihin ja huuhdeltiin ddH2O: lla ja Tris-puskuroidulla suolaliuoksella (TBS, pH 7.6). Antigeenia haettiin 10 mM:n sitraattipuskurissa (trinatriumsitraattidihydraatti, Sigma-Aldrich, pH 6.0) 1: 2000 Tween-20: llä (Sigma-Aldrich) 96 °C: ssa 30 minuutin ajan, minkä jälkeen 30 minuutin jäähdytys huoneenlämmössä. Diat pestiin TBS: llä ja estettiin 30 minuutin ajan TBS: llä (abcam) laimennetulla 10% normaalilla aasinseerumilla (Abcam), joka sisältää 5% (w/v) IgG: tä ja proteaasitonta naudan seerumialbumiinia (Jackson Immunoresearch) kostutetussa kammiossa. Estopuskuriin laimennettuja primaarisia vasta-aineita inkuboitiin yön yli 4 °C: ssa:ihmisen mitoottisen laitteen proteiini (numa) (1:200, Abcam ab84680), BEST-1 (1:200, Millipore MAB5466), CD140b/PDGFRB (1:100, Santa Cruz Biotechnology sc-432) ja CD56/NCAM1 (1: 100, Santa Cruz Biotechnology SC-7326, klooni ) (Lisätietoja 2). Sekundaariset vasta-aineet (donkey anti-rabbit IgG (H + L) Alexa Fluor 555 A31572 ja donkey anti-mouse IgG (H + L) Alexa Fluor 647 A31571, molemmat Thermo Fisher Scientificiltä) (Lisätietoja 2) estopuskurissa laimennettuna 1:200 inkuboitiin 1 tunti huoneenlämmössä. Osat asennettiin vectashield Dapi ((4′,6-diamidino-2-phenylindole)) kiinnitysvälineen (Vector Laboratories) alle 24 × 50 mm2 coverslip.

immunohistokemian osalta objektilasit poistuivat, minkä jälkeen tehtiin antigeenihaku (ER2-liuos, pH 9, 20 min, Leica Biosystems) ja cd140b/PDGFRB (1:100, Santa Cruz Biotechnology sc-432) – ja CD56 / NCAM1 (1:100, Santa Cruz Biotechnology SC-7326, klooni) – vasta-aineet (Lisätietoja 2 ) Bond RXm-instrumentille (Leica Biosystems).

kuvat otettiin Olympus IX81-fluoresenssimikroskoopilla tai Zeiss LSM710-NLO-pistekuvausmikroskoopilla. Kuvien jälkianalyysi tehtiin ImageJ-ohjelmiston avulla.

Fagosytoosimääritys

Fluoreseiini-isotiosyanaatilla merkityt naudan positiot eristettiin ja ne antoi ystävällisesti tohtori E. F. Nandrot Institut de la Visionista Pariisista37. hPSC-RPE-soluja viljeltiin transwellin kalvolla (0, 33 cm2, Corning), joka oli päällystetty hrLN-521: llä 20 µg/mL 1 kuukauden ajan kylvön jälkeen. Soluja inkuboitiin 37 °C: ssa tai 4 °C: ssa 16 tunnin ajan 2,42 × 106 sulatetulla POS/Transwellillä laimennettuna DMEM: llä (Dulbecco ’s modified Eagle’ s medium) tai CO2-riippumattomalla väliaineella (molemmat Thermo Fisher Scientific-valmisteesta). Inkubaation jälkeen solut sammutettiin Trypansinisellä liuoksella 0.2% (Gibco, Invitrogen) 10 minuutin ajan huoneenlämmössä, kiinteänä 4% metanolittomalla formaldehydillä (Polysciences) huoneenlämmössä 10 minuutin ajan ja permeabiloituna 0, 3% Triton X-100: lla d-PBS: ssä 15 minuutin ajan. Solurajojen visualisointiin käytettiin rodamiinifalloidiinivärjäystä (1:1000, 20 min huoneenlämmössä, Biotinum 00027) (lisätiedot 2). Tumakkeet värjättiin Hoechst 33342: lla (1: 1000, 20 min huoneenlämmössä, Invitrogen).

kuvat hankittiin Zeiss LSM710-NLO-pistekuvauksen konfokaalimikroskoopilla. Kuvien jälkianalyysi tehtiin Imaris-ohjelmalla (Bitplane) ja POS-määritykset tehtiin CellProfiler 2.1.1-ohjelmistolla. Käytetyt moduulit: LoadImages, ColorToGrey, IdentifyPrimaryObjects, Measureobjectseshape, SaveImages ja ExportToSpreadsheet. Objektit tunnistettiin tyypillisellä halkaisijaltaan 10-40 pikselin yksiköllä käyttäen kahta luokkaa, Global, Otsu, Painotettu varianssin raja-arvomenetelmä, jossa 0,01 ja 1,0 ala-ja ylärajaa, ja 2,1 korjauskerroin, jossa paakkuuntuneet kohteet erotettiin intensiteetin perusteella.

entsyymi-immunologinen määritys

hPSC-RPE-soluja viljeltiin eri substraateilla päällystetyillä Transwellikalvoilla (0, 33 cm2, Millipore). Supernatantit sekä hPSC-RPE apikaaliselta että tyvipuolelta (eli transellin ylä-ja alalokerosta) kerättiin 60 tunnin kuluttua väliaineen vaihtamisesta. PEDF: n eritystasot mitattiin kolmena kappaleena kunkin tilan osalta, kun kaupallisesti saatavilla olevia ihmisen PEDF ELISA-pakkauksia (BioVendor RD191114200R) käytettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti 60 päivän viljelyn jälkeen. Optisen tiheyden Sreadings mitattiin SpectraMax 250 Microplate Reader (Molecular Devices) – laitteella. Tulokset esitetään keskiarvona ± sem.

Teer-mittaukset

Transepiteeliset sähkövastuksen RPE-kennot, jotka on pinnoitettu Transwelleillä (0,33 cm2, Millipore), mitattiin Millicellin Sähkövastusjärjestelmän voltti-ohm-mittarilla (Millicell ERS-2, Millipore) valmistajan ohjeiden mukaan. 60 päivän viljelmät tasapainotettiin inkubaattorin ulkopuolella huoneenlämmössä 15-20 minuutin ajan ennen koetta. Mittaukset tehtiin muuttumattomassa viljelyaineessa kolmena kappaleena kutakin tilaa varten, kunkin kaivon kolmessa eri kohdassa. Tarkemmassa analyysissä käytettiin keskiarvoja. Taustavastus määritettiin samassa väliaineessa olevasta nollaviljelmästä, joka oli päällystetty vastaavalla substraatilla mutta ilman soluja, ja vähennettiin vastaavasta koe-tilasta. Mittaukset ilmoitetaan resistanssina ohmeina kertaa pinta-ala neliösenttimetreinä (Ω × cm2). Tulokset esitetään keskiarvona ± sem.

Pyyhkäisyelektronimikroskopiassa

hPSC-RPE-soluja kasvatettiin 60 päivän ajan transwell-inserteillä, jotka oli päällystetty ln521: llä (20 µg / mL). Ne vahvistettiin upottamalla 2,5-prosenttiseen glutaarialdehydiin 0,1 M fosfaattipuskurissa, pH 7,4. Transwellin kalvo leikattiin ja pestiin MilliQ-vedessä ennen etanolin porrastettua dehydrausta ja kriittisen pisteen kuivausta hiilidioksidilla (Leica EM CPD 030). Insertit asennettiin näytteiden kantoihin hiililiimalla ja sputterilla, joka oli päällystetty ohuella platinakerroksella (Quorum Q150T ES). Pyyhkäisyelektronimikroskopiakuvat hankittiin Ultra 55 – kenttäemission pyyhkäisyelektronimikroskoopilla (Zeiss, Oberkochen, Saksa) 3 kV: n teholla ja se2-detektorilla.

Siirtoelektronimikroskopia

hPSC-RPE-kennoja kasvatettiin 60 päivän ajan transellenteillä, jotka oli päällystetty ln521: llä (20 µg / mL). Ne vahvistettiin upottamalla 2,5-prosenttiseen glutaarialdehydiin 0,1 M fosfaattipuskurissa, pH 7,4. Transwellin kalvo leikattiin pois ja ohuiksi suikaleiksi, huuhdeltiin 0,1 M fosfaattipuskurissa, minkä jälkeen jälkisitoutuminen 2% osmiumtetroksidiin 0,1 M fosfaattipuskurissa, pH 7,4, 4 °C: ssa 2 tunnin ajan. Kalvokaistaleisiin tehtiin vaiheittainen etanolin dehydraatio ja lopulta tasaiseksi upotettiin LX-112. Ultrathiinijaksot (~50-60 nm) valmistettiin Leica EM UC7: llä ja vastakohtana oli uranyyliasetaatti, jota seurasi lyijysitraatti. Siirtoelektronimikroskopiakuvaus tehtiin 80 kV: n teholla toimivalla Hitachi HT7700-siirtoelektronimikroskoopilla (Hitachi High-Technologies) ja digitaalikuvat hankittiin Veleta CCD-kameralla (Olympus Soft Imaging Solutions).

yksisoluinen RNA-sekvensointi bioinformaattisessa analyysissä

Kuusikymmenpäiväinen hPSC-RPE-solut dissosioitiin tryple Select-menetelmällä ja kulkeutuivat solusiivekkeen (ø 40 µm, BD Biosciences) läpi. Ne suspendoitiin uudelleen pitoisuudeksi 1000 solua / µL 0, 04% BSA: ssa PBS: ssä. Solut kuljetettiin 4 °C: n lämpötilassa eukaryoottisen yksisoluisen genomiikan laitokseen (ESCG, SciLifeLab, Tukholma, Ruotsi), jossa valmistettiin 3′ cDNA-kirjasto yksisoluista RNA-sekvensointia varten 10x Genomics Platformilla (10x Genomics) NovaSeq 6000-ohjelmiston avulla. Cell Ranger 2.1.1 (10x Genomics) putki käytettiin muuntaa Illumina base call tiedostot fastq muotoon, kohdista sekvensointi lukee HG19 transkriptome käyttäen STAR aligner38, ja tuottaa ominaisuus-viivakoodi matriisit. Cell Ranger quality-control suodatetut solut (cd140b+GD2 -, CD140b+CD184−, uusitut 1:20 ja hESC− näytteet) analysoitiin R-versiossa 3.5.1 (R Core Team)39 käyttäen Seurat suite-versiota 2.3.440, 41. Lisäksi laadunvalvontamittareiksi valittiin RPE-solut, joilla oli yksilöllisesti ilmaistut geenit (≥2000 – ≤5000), UMIs-solut (≥10 000 – ≤30 000) ja UMI-kartoituksen prosenttiosuus MT-geeneistä (≥0, 025 – ≤0, 10). Samoin hESC, jossa on yksilöllisesti ilmaistut geenit (≥2000 – ≤8000), UMIs (≥10 000 – ≤80 000) ja UMI-kartoituksen prosenttiosuus MT-geeneistä (≥0, 025 – ≤0, 10). Tämän suodatusvaiheen tuloksena saatiin lopulliset tiedot 616, 725, 779 ja 905 solua CD140b+GD2−, CD140b+CD184−, uudelleen 1:20-ja HEC-näytteille. Ennen dimensionaalisuuden vähentämistä pääkomponenttianalyysillä (PC), solun ja solun välinen vaihtelu Geeniekspressiossa, jota ohjaavat UMIs, mitokondrion geeniekspressio ja solusyklin vaiheet taantuivat datan skaalauksen prosessissa42. Vaihtuvat geenit RPE-näytteissä valittiin niiden normalisoidun keskimääräisen ekspression ja dispersion perusteella (ekspression cut-off = 0, 0125–5 ja pohjadispersion cut-off = 0, 5). PC: n valinnassa arvioitiin pcheatmap -, jackStraw -, PC: n keskihajonnat ja Clustree-analyysit 43. Ensimmäiset 15 kpl käytettiin tSNE projection44-ja ryhmittelyanalyysiin (resoluutio = 0,1, perplexity = 40).

soluryhmiä analysoitiin kahdella lähestymistavalla. Top differentiaaligeenit tunnistettiin ensin kullekin klusterille Wilcoxonin rank-sum-testillä. Toissijainen, allekirjoitus geeniekspressio (moduuli pisteet) laskettiin erilaistumaton hESC ja useita solutyyppejä läsnä ihmisen verkkokalvolla. Mesodermin merkkiaineita ilmentävät solut jaettiin manuaalisesti erilliseen klusteriin seuratin interaktiivisten piirto-ominaisuuksien avulla. Tiedot ladataan arrayexpress (EMBL-EBI) – katso lisätietoja alla.

Eläimet

Pohjois-Tukholman eläinkokeiden eettisen komitean (DNR N25 / 14) hyväksymisen jälkeen tutkimuksessa käytettiin 10 Uuden-Seelannin valkoista albiinokaniinia (toimittanut Lidköpings rabbit farm, Lidköping, Ruotsi), jotka olivat 5 kuukauden ikäisiä ja painoivat 3, 5-4, 0 kg. Kaikki kokeet tehtiin lausunnon mukaisesti eläinten käytöstä Silmätutkimuksessa ja Näkötutkimuksessa.

Subretinaalisiirto

hPSC-RPE-monokerrokset pestiin PBS: llä, inkuboitiin Tryplellä ja dissosioitiin yksisolususpensioksi. Solut laskettiin Neubauerin hemosytometrikammiossa käyttäen 0,4-prosenttista Trypaninsinistä (Thermo Fisher Scientific Corp.), sentrifugoitiin 300 × g: n kokoon 4 minuutin ajan, ja soluselletti suspendoitiin uudelleen juuri suodattimella steriloituun PBS: ään, jolloin lopullinen pitoisuus oli 1000 solua/µL. Tämän jälkeen solususpensio allikoitiin aseptisesti 600 µL: n yksikköön ja pidettiin jäissä leikkaukseen asti.

Eläimet nukutettiin antamalla lihaksensisäisesti ketamiinia 35 mg/kg (Ketaminoli, 100 mg/mL, Intervet) ja ksylatsiinia 5 mg / kg (Rompun vet. 20 mg/mL, Bayer Animal Health) ja pupillit laajentuivat 0, 75% syklopentolaatin ja 2, 5% fenyyliefriinin (APL) sekoituksella. Mikrokirurgia tehtiin kummallekin silmälle käyttäen 2-porttista 25 G transvitreal pars plana-tekniikkaa (Alcon Accurus, Alcon Nordic) edellin45 kuvatulla tavalla. Solususpensio vedettiin 1 mL: n ruiskuun, joka oli liitetty jatkoputkeen ja 38 g: n polytip-kanyyliin (MedOne Surgical Inc). Ilman vitrectomiaa kanyyli työnnettiin ohimolokeron läpi. Oikean kärjen asettamisen jälkeen, joka varmistettiin fokaalisella verkkokalvon leimahduksella, 50 µL solususpensiota (vastaa 50 000 solua) ruiskutettiin hitaasti subretinaalisesti ~6 mm näköhermon pään alapinnan alapuolelle muodostaen yhtenäisen bleb: n, joka näkyi selvästi leikkausmikroskoopilla. Kärki pidettiin huolellisesti Bleb: n sisällä injektion aikana refluksitaudin minimoimiseksi. Instrumentin poiston jälkeen itsestään sulkeutuviin saumattomiin sklerotomioihin kohdistettiin kevyttä painetta. Kaksi mikrogrammaa (100 µL) intravitreaalista triamsinolonia (Triescence, Alcon Nordic) annettiin 1 viikko ennen leikkausta, eikä leikkauksen jälkeisiä antibiootteja annettu.

tilastot ja uusittavuus

tilastollisissa analyyseissä tehtiin kaksisuuntainen varianssianalyysi ja post hoc-monivertailuja Tukeyn testikorjauksella, jotta voitiin arvioida in vitro-eroja arvioitujen tiheyksien välillä ja lajittelua uusittuihin olosuhteisiin TEER-ja PEDF-eritystesteissä.

kaikki määritykset tehtiin sokkouttamatta. Tilastolliset parametrit, mukaan lukien n: n määritelmät ja tarkka arvo (esim.kokeiden kokonaismäärä, toistot jne.), poikkeamat, P-arvot ja tilastollisten testien tyypit ilmoitetaan luvuissa, vastaavissa kuviolegendoissa ja tässä jaksossa. Tilastollinen analyysi tehtiin käyttäen Prism 7: ää (GraphPad-ohjelmisto, versio 7.0 c). Kaikissa tapauksissa tilastollinen analyysi tehtiin vähintään kolmen biologisesti riippumattoman kokeellisen toisinnon tiedoista. Ryhmien väliset vertailut suunniteltiin ennen tilastollista testausta, eikä tavoitevaikutuskokoja ollut ennalta määrätty. Käyrissä näkyvät virhepalkit edustavat vähintään kolmen riippumattoman kokeen keskiarvoa ± sem. Kaikki mikrografit näkyvät ovat edustavia kuvia kolmesta itsenäisestä kokeesta, ellei toisin mainita(esim. Kuva. 1c).

raportointikooste

lisätietoja tutkimuksen suunnittelusta on tämän artikkelin yhteydessä olevassa Nature Research Reporting Summary-julkaisussa.