incPRINT–menetelmä RNA–proteiinikompleksien tunnistamiseksi

RNA-proteiini-interaktioiden tunnistamiseksi systemaattisesti elävissä soluissa kehitimme menetelmän, joka mittaa solujen interaktioita minkä tahansa merkityn testirna: n ja minkä tahansa merkityn testiproteiinin välillä. IncPRINT-periaate on MS2-merkityn testi-RNA: n ja lipulla merkityn testiproteiinin ohimenevä kaksoisekspressio hek293t-soluissa, jotka ilmentävät vakaasti MS2 coat-proteiiniin (MS2CP) fuusioitua luciferaasi-ilmaisinta genomisesti integroidusta plasmidista (Kuva. 1). Testi-RNA kytketään lusiferaasi-detektoriin MS2-MS2CP-interaktion kautta; RNA-lusiferaasikompleksi puhdistetaan yhdessä Flag-merkityn testiproteiinin kanssa, joka on aktivoitu solulysaateista anti-FLAG-vasta-aineella (Kuva. 1). DNA: n yhdistämät epäsuorat RNA–proteiini-interaktiot eliminoituvat DNaasi-hoidolla solulyysivaiheen jälkeen. Jokaisen RNA–proteiinin vuorovaikutuksen toteamiseksi RNA-MS2 puhdistetaan yhdessä TESTILIPULLA merkityn proteiinin kanssa mitattavalla lusiferaasiluminesenssilla (Kuva. 1). Testiproteiini-ekspressiotasojen kontrolloimiseksi testiproteiinien runsaus mitataan ELISA-menetelmällä käyttäen toista Anti-FLAG-vasta-ainetta, joka on yhdistetty piparjuuriperoksidaasiin (HRP) (Kuva. 1). IncPRINT-menetelmä on skaalaltaan joustava, ja sitä voidaan käyttää matala-tai suuritehoisena määrityksenä. Mahdollistaaksemme solujen RNA-proteiinin vuorovaikutusten systemaattisen, suurikapasiteettisen tunnistamisen, loimme räätälöidyn kirjaston, jossa on ∼3000 ihmisen lipulla merkittyä proteiinia, mukaan lukien ∼1500 tunnettua RBPs: ää (refs: n perusteella. 10,11), ∼1300 transkriptiotekijää12 ja ∼170 kromatiiniin liittyvää proteiinia. Merkittyä proteiinipitoisuutta voidaan muokata sopivaksi halutulle kokeelliselle asetukselle.

incPRINT havaitsee luotettavasti solujen RNA–proteiinien vuorovaikutukset

incprintin perustamiseksi teimme sarjan pienimuotoisia kokeita käyttäen ∼1 kb: n säilynyttä lncRNA Xistin aluetta, jota kutsutaan A-toistoksi, jäljempänä Xist(A)13. Koska useat Xist (A)-proteiinin vuorovaikutukset ovat vakiintuneet7, ne toimivat kontrolleina ensimmäisissä incPRINT-kokeissamme. Kehitimme Konstruktion ilmaisemaan Xist(a)-MS2: ta ja määritimme Xist (a)-MS2-RNA: n kyvyn olla vuorovaikutuksessa valittujen aiemmin tunnistettujen Xist: tä sitovien proteinien 7,14,15 kanssa. RNA-ekspression säätelyyn käytettiin erottelematonta poly (A)-sitovaa proteiinia PABPC3: A ja negatiivisena kontrollina EGFP: tä (Enhanced Green Fluorescent Protein). incPRINT luminescence havaitsi Xist(a)-MS2: n spesifisiä yhteisvaikutuksia SPEN: n, RBM15: n, RBM15B: n, YTHDC1: n, HNRNPC: n, SRSF7: n ja RALYN kanssa, kun taas HNRNPU: n raportoitiin sitovan täyspitkää Xist: tä, mutta ei erityisesti Xist(a)7: ää, ja EGFP: n basal-sitoutuminen (Kuva. 2 a). RNaasi-hoito poisti luciferaasilla mitatun RNA-proteiinin interaktiosignaalin, kun taas ELISA-menetelmällä Havaittujen testiproteiinien ilmentyminen pysyi pääosin muuttumattomana (Fig. 2a, täydentävä Kuva. 1a), joka osoittaa, että merkittyjen proteiinien ja lusiferaasi-detektorin väliset vuorovaikutukset olivat RNA: n silloittamia.

testatun RNA: n merkitsemiseen käytettyjen MS2-varren silmukoiden määrän optimoimiseksi Xist(a) fuusioitiin kahteen, neljään, kuuteen, kymmeneen tai 24 MS2: n varren silmukkaan, ja niiden yhteisvaikutuksia kontrolliproteiinien kanssa testattiin pienimuotoisessa incPRINT-kokeessa. Luminesenssin intensiteetin kasvu korreloi suoraan MS2-varren silmukoiden määrän kasvuun kymmeneen runkosilmukkaan, eikä sitoutuminen EGFP-kontrolliin lisääntynyt merkittävästi (täydentävä Kuva. 1b). Siksi kaikissa myöhemmissä incPRINT-kokeissa RNAS merkittiin kymmenellä MS2-varren silmukalla.

sen määrittämiseksi,esiintyivätkö incprintin havaitsemat RNA–proteiini-interaktiot soluissa vai esiintyivätkö ne vasta in vitro solujen lysis16,17, 18 jälkeen, mitattiin ja verrattiin kahden riippumattoman kokeen luminesenssisignaalia. Ensimmäisessä kokeessa Xist (a)-MS2-RNA ja FLAG-merkityt testiproteiinit transfektoitiin samassa solupopulaatiossa edellä kuvatulla tavalla. Toisessa kokeessa Xist (a)-MS2–RNA ja FLAG-merkityt testiproteiinit transfektoitiin erikseen kahdessa eri solupopulaatiossa ja yhdistettiin toisiinsa vasta solulyysivaiheen jälkeen, mikä mahdollisti RNA-proteiinikompleksien muodostumisen yksinomaan in vitro (täydentävä Fig. 1c). Huomasimme, että interaktiot havaittiin ensisijaisesti, kun Xist(a)-MS2 RNA ja lipulla merkityt proteiinit transfektoitiin (standard incPRINT-ehto; Fig. 2b). Nämä tulokset viittaavat siihen, että aina kun interaktiosignaali havaittiin incprintillä, se johtui soluissa muodostuneista RNA–proteiinikomplekseista, kun taas RNA–proteiinikompleksien liittyminen solun hajoamisen jälkeen näyttäytyi merkityksettömänä taustana incPRINT-spesifisissä olosuhteissa (Fig. 2b). Yhdessä nämä kokeet osoittavat, että incPRINT mittaa solujen RNA-proteiinin vuorovaikutusta luminesenssilukeman avulla.

RNA-proteiini–interaktioiden suuren läpimenon havaitseminen

testataksemme incprintin skaalautuvuutta RNA–proteiini-interaktioiden systemaattiseen tunnistamiseen, kyselimme räätälöidystä kirjastostamme ~3000 lipulla merkittyä ihmisproteiinia (mukaan lukien ∼1500 tunnettua rbps10,11, ∼1300 transkriptio factors12 ja ∼170 kromatiiniin liittyvää proteiinia) Xist(a)-MS2: lla. IncPRINT-tunnistettujen RNA-proteiini-interaktioiden luottamuksen vahvistamiseksi kaikki interaktiot määritettiin biologisina kaksoiskappaleina, jolloin kullekin testatulle RNA–proteiiniparille saatiin kaksi luminesenssia (RNA–proteiini-interaktioiden voimakkuus) ja kaksi Elisa-arvoa (testiproteiini-ekspressiotaso). Kun riittämättöminä ilmaistut proteiinit oli suodatettu pois (KS. ”menetelmät” – kohta), 2405 proteiinin yhteisvaikutustiedot analysoitiin. incprintin toistettavuutta arvioitiin laskemalla biologisten kaksoiskappaleiden korrelaatiopisteet molemmille luminesenssille (Kuva. 2c; R2 = 0.87) ja ELISA-signaalit (Kuva. 2d; R2 = 0, 99). Luminesenssin ja ELISA-arvojen välillä ei havaittu korrelaatiota, mikä viittaa siihen, että vuorovaikutusintensiteetit eivät johtuneet pelkästään proteiinin ilmentymistasoista (Kuva. 2 e). Yhteenvetona voidaan todeta, että incPRINT on skaalautuva suurikapasiteettinen menetelmä, joka mittaa toistettavasti RNA–proteiinin vuorovaikutusta solussa.

incPRINT tunnistaa heikosti ilmentyvien RNA: iden proteomin

seuraavaksi pyrimme testaamaan, pystyykö incPRINT luotettavasti tunnistamaan proteiineja, jotka ovat vuorovaikutuksessa alhaisilla endogeenisillä tasoilla ilmaistujen transkriptien kanssa. Alhaiseen kopiolukuun RNAs liittyvien proteiinien tunnistaminen on yleensä haastavaa RNA: n affiniteettikaappaus-MS-lähestymistapoja käytettäessä johtuen RNA: n puhdistusten tyypillisesti alhaisesta tehokkuudesta ja massaspektrometrian vaatimasta suuresta materiaalimäärästä. Koska Firre on toiminnallisesti tärkeä lncrna, joka moduloi korkeamman kertaluvun ydinarkkitehtuuria kromosomeissa19 ja on melko alhainen endogeeninen runsaus (∼20 molekyyliä solua kohti perustuen RNA-Seq-tietoihin eri hiirikudoksissa), arvioimme sen RBP-interaktomia incprintillä. MS2: n tägäämä täyspitkä Firre-transkriptio ilmaistiin ∼40-kertaisesti endogeenista FIRREÄ korkeammalla hek293t-soluissa, joita käytetään incprintissä (Supplementary Fig. 2 a). Kuten endogeenisen transkript19: n osalta on raportoitu, Firre-MS2 oli ensisijaisesti lokalisoitu tumaan(täydentävä Kuva. 2b). Kuulustelemalla kirjastomme ~3000 proteiineja, incPRINT tunnistettu joukko erityisiä proteiineja Firre interactors (Kuva. 3a, punaiset pisteet; lisätiedot 1), kun taas suurin osa proteiineista ei ollut vuorovaikutuksessa Firren kanssa (kuva. 3a, harmaat pisteet; lisätiedot 1). Tärkeää on, että incPRINT tunnisti sekä tunnettuja että uusia Firre-vuorovaikutuksessa proteiineja. Ctcf ja HNRNPU, jotka aiemmin on raportoitu kahdessa riippumattomassa tutkimuksessa sitomaan Firreä ja olemaan tärkeitä sen toiminnalle19,20, tunnistettiin myös incPRINT (Fig. 3 A). Validoida Sitominen uusia Firre interactors, analysoimme koodata eCLIP data21. ECLIP-tiedot, jotka ovat saatavilla seitsemälle incPRINT-tunnistetulle Firre-vuorovaikutteiselle RBPs: lle, vahvistivat niiden sitoutumisen Firre: iin k562-solulinjassa, vahvistaen edelleen incPRINT-menetelmää (Supplementary Fig. 2C; lisätiedot 2). Firre in nuclear organization19: n roolin mukaisesti joukko Incprintin tunnistamia Firre-interaktoreita olivat kromatiiniin liittyvät proteiinit, mukaan lukien CHD1, POU5F1, JARID2, EPC1, SATB1, MECP2, AEBP2 ja CTCF (lisätietoja 1). Protein domain-analyysit osoittivat, että Firre-interacting proteins were significantly enriched for the RNA recognition motif (RRM) (Fig. 3b; lisätiedot 3).

sen määrittämiseksi, vaadittiinko incprintiltä RNA: n yli-ilmentymistä, jotta voitiin onnistuneesti tunnistaa RNA: han sitoutuvat proteiinit alhaisilla endogeenisillä pitoisuuksilla, testattiin joukko proteiineja, joiden Firre-MS2-pitoisuudet vaihtelivat yllä kuvatusta yli-ilmentymästä hek293t-solujen endogeeniseen FIRRE-pitoisuuteen verrattaviin pitoisuuksiin (Supplementary Fig. 2d, e). Vaikka RNA: n yliekspressio johti korkeampiin interaktiopisteisiin, mikä mahdollisti niiden paremman erottumisen taustasignaalista, lusiferaasisignaali oli vahvasti havaittavissa taustasignaalin yläpuolella käytettäessä Firre-MS2-laimennoksia (Supplementary Fig). 2d). Tärkeää on, että tämä signaali ei liittynyt testiproteiinin ekspressiotasoihin (täydentävä Kuva. 2 e). Yhdessä nämä tiedot osoittavat incprintin hyödyllisyyden tunnistettaessa proteiineja, jotka liittyvät transkripteihin, jotka ilmaistaan alhaisilla endogeenisillä tasoilla.

incPRINT tunnistaa RNA-aluespesifiset vuorovaikutuskumppanit

koska monet lncrnat toimivat modulaarisina tukirakenteina mahdollistaen tiettyjen RBPs: ien sitoutumisen diskreettiin RNA-domains1, 5,halusimme testata, pystyykö incPRINT tunnistamaan RNA-aluespesifisiä vuorovaikutuksia. Ihanteellinen todiste-periaatteen molekyyli on lncRNA Xist, koska sen tärkeä rooli nisäkkäiden X-kromosomin inaktivaatiossa (XCI)22,23, ja sen modulaarinen rakenne ja toiminta. ∼17 kb pitkä Xist transkriptio sisältää useita säilyneitä sekvenssin alueita (kutsutaan toistoja A: sta F: ään), jotka suorittavat erillisiä toimintoja XCI-prosessin aikana, mukaan lukien geenin hiljentämisen aloittaminen (toistaminen A: ssa), X – inaktiivisen tilan ylläpitäminen (F-ja B – toistot) ja xistin asianmukainen kromosomien lokalisointi ja fokaalinen kertyminen (C-ja E-toistot)13,24,25,26,27,28,29,30,31,32 (Kuva. 4 A). Lisäksi useissa riippumattomissa tutkimuksissa on aiemmin tunnistettu ja validoitu joukko funktionaalisia proteiinien yhteisvaikutuksia täyspitkän Xist7: n kanssa.,14,15,26,28,33,34,35. Pyrimme soveltamaan incPRINT kolmeen säilyneitä alueita hiiren Xist, eli, Xist (a), Xist(F), ja Xist(C) (Fig. 4 A). Ilmaistuna incprintissä käytetyissä hek293t-soluissa jokainen Xist-MS2-fragmentti osoitti eri tason ekspressiota endogeeniseen Xistiin verrattuna, vaihdellen ∼60-kertaisesta lisäyksestä Xist (A) lähes endogeeniseen ekspressiotasoon Xist(C) (Supplementary Fig. 3 A). Kaikki yksittäiset Xist-MS2-fragmentit sijaitsivat mieluiten tumassa, samoin kuin niiden täyspitkä endogeeninen vastine (Supplementary Fig. 3b). Jokainen Xist-alue (ts., Xist (A), Xist(F) ja Xist(C)) kuulusteltiin meidän kirjasto ~3000 proteiineja. Eri tasoilla ilmaistujen yksittäisten Xist-alueiden signaalien vertailu (Supplementary Fig. 3C) kunkin Xist-alueen yhteisvaikutusarvot normalisoitiin käyttäen MS2 RNA: n sitoutumistietoja (lisätieto 4). Normalisointia varten määriteltiin 200 proteiinin joukko, jolla oli MS2-RNA-aineiston parhaimmat luciferaasipisteet, kaikkien MS2-merkittyjen RNAs: ien yhteisiksi sideaineiksi. Tämän jälkeen jokaisesta aineistosta tunnistettiin yhteiset sideaineet, ja niiden yhteisvaikutuspistemäärä (mediaani) laskettiin kullekin testatulle RNA: lle ja sitä käytettiin raa ’an luminesenssin intensiteetin normalisointiin kussakin aineistossa (KS. ”menetelmät” – osio). MS2-tietoja ei käytetty sitovana spesifisyyskontrollina, koska monet RBPs: t tunnistavat alhaisen kompleksisuuden RNA motifs36: n myös MS2-tunnisteessa, ja koska proteiinin sitoutuminen MS2: een ei sulje pois mahdollista funktionaalista vuorovaikutusta testattavan RNA: n kanssa. Kuten Firre, huomasimme, että suurin osa proteiineista ei sitoutunut mihinkään testatuista Xist-fragmenteista (Kuva. 4B-d, harmaat pisteet; lisätiedot 4), kun taas tiettyjen proteiinijoukkojen tunnistettiin olevan vuorovaikutuksessa kunkin yksittäisen Xist-alueen kanssa (kuva. 4B-d, punaiset pisteet; lisätiedot 4). Tärkeää on, että incPRINT-tunnistettujen Xist-vuorovaikutuksessa olevien proteiinien joukossa löysimme aiemmissa tutkimuksissa tunnistettuja xistin tunnettuja vuorovaikutuskumppaneita, jotka sitovat täyspitkän transkript7, 14, 15 (merkitty Fig. 4b-d, täydentävä Taulukko 1). Verrattaessa incprint-tunnistettujen proteiinien joukkoa ja niiden vuorovaikutuspisteitä kullekin Xist-alueelle (lisätietoa 4), havaitsimme, että jokainen Xist-fragmentti oli vuorovaikutuksessa vastaavalle alueelle ominaisten proteiinien kanssa, ja pieni osa RBPs: stä sitoutui kaikkiin kolmeen Xist-alueeseen (Kuva. 4 e). Näin ollen incprintin soveltaminen kolmeen xistin säilyneeseen alueeseen mahdollisti rbps: n tunnistamisen ja määrittämisen tietyille RNA-alueille,jotka olivat aiemmin päättäneet sitoa täyspitkän Xist-transkript7,14, 15 (Kuva. 4E; tunnetut Xist-vuorovaikutuksessa olevat proteiinit on merkitty oikealla). Esimerkiksi incPRINT tunnisti SPENIN Xist (A)-spesifiseksi interaktoriksi (Fig. 4e), vahvistaen aiemmat löydöt7, 8. Samoin, rbm15, RBM15B ja YTHDC1 tunnistettiin incPRINT vuorovaikutuksessa erityisesti Xist(A) ja Xist(F), mutta ei Xist(C), vahvistaa niiden raportoitu sitova 5’ loppuun Xist7, 9 (Kuva. 4 e). Lisäksi tunnistimme Xist (C)-spesifisen yhteisvaikutuksen HNRNPU: n (tunnetaan myös nimellä SAF-a) kanssa,jonka on aiemmin osoitettu olevan mukana Xist-lokalization7,14, 33 (Kuva. 4 e, täydentävä Taulukko 1). Validoida RNA-alue-spesifinen Xist-proteiini vuorovaikutus, koodata eCLIP data21 saatavilla 14 incPRINT-tunnistettu proteiineja, joista useat ovat uusia Xist-vuorovaikutuksessa RPBs, vahvisti sitoutumisensa XIST vuonna k562 rivi (täydentävä Kuva. 3d; lisätiedot 2), vahvistaa edelleen spesifisyys menetelmämme. Funktionaalinen ero kolmen Xist-alueen proteiin interaktomien välillä vahvistettiin geenien ontologian (GO) termin rikastusanalyysien avulla. Yhdenmukaisesti yksittäisten Xist-alueiden differentiaalifunktioiden kanssa, Xist(A)- ja Xist (F)-liitännäisproteiinit rikastuivat RNA: n käsittelyyn osallistuville RBPs: ille, kun taas C-toistoalue oli ensisijaisesti vuorovaikutuksessa transkription säätelyyn osallistuvien DNA: ta sitovien proteiinien kanssa (Supplementary Fig). 3 e, f). Yhdessä GO-analyysin kanssa proteiinidomeenianalyysi osoitti, että Xist(a)-vuorovaikutteisia proteiineja rikastettiin SPOC-(Spen paralog ja ortolog C-terminaali) ja RRM-proteiinidomeeneille, Xist(F) – vuorovaikutteisia proteiineja rikastettiin RRM-domeenille ja Xist(C) – vuorovaikutteisia proteiineja ei esiintynyt erityistä rikastumista (Fig. 4f; lisätiedot 3), jossa korostetaan incPRINT-tunnistettujen proteiinisarjojen erityisyyttä kullekin Xist-alueelle. Yhteenvetona incPRINT onnistui löytämään tunnetut Xist-proteiinin vuorovaikutukset ja paljastetut uudet RBPs: t. Tunnistamalla tietyt proteiinijoukot, jotka ovat vuorovaikutuksessa modulaarisen lncRNA: n yksittäisten säilyneiden alueiden kanssa, olemme osoittaneet, että incPRINT mahdollistaa aluekohtaisen RNA-proteiinin vuorovaikutusten osoittamisen.

incPRINT tunnistaa toiminnallisia RNA–proteiinin vuorovaikutuksia

koska Xistillä on hyvin tunnettu solutoiminto geenien hiljentämisessä XCI: n aikana, halusimme testata, ovatko osa incprintillä paljastuneista Xist-proteiinin interaktioista toiminnallisesti merkityksellisiä. Painopiste oli zzz3-proteiinissa, joka on vuorovaikutuksessa kaikkien kolmen testatun Xist-alueen kanssa, ja RBM6: ssa, joka osoittaa spesifisempää sitoutumista Xist(A) – ja Xist(F) – alueisiin (Fig. 4 e). Ensinnäkin varmistimme Xist: n vuorovaikutuksen rbm6: n ja ZZZ3: n kanssa endogeenisissä olosuhteissa testaamalla Xist: n koesadetta molempien proteiinien kanssa hiiren alkion kantasoluissa. Proteiinit HA-koodattiin polymorfisessa TX1072 ES-solulinjassa, joka mahdollistaa doksisykliinin indusoiman Xist-ekspression, joka laukaisee XCI: n ilman differentiaatiota 31,37,38,39. RNA-immunopresipitaatio (RIP) sen jälkeen, kun doksisykliini indusoi Xist-ja UV-ristisidoksia soluissa ja sen jälkeen qRT-PCR-analyysit osoittivat Xist-transkription rikastuneen merkittävästi RBM6-ja ZZZ3-proteiineilla, mikä vahvisti niiden yhteisvaikutuksen in vivo (Kuva. 5 A, b). Erityisesti, incPRINT myös tunnistettu rbm6 vuorovaikutuksessa Firre. RIP qRT-PCR havaitsi Firren erityisen vuorovaikutuksen RBM6: n kanssa, mutta ei ZZZ3: n kanssa, mikä vahvisti Firre-RBM6: n sitoutumisen endogeenisissä olosuhteissa ja vahvisti incPRINT-tuloksemme (Kuva. 5 A, b).

seuraavaksi testataksemme, onko rbm6: lla ja ZZZ3: lla vaikutusta XCI: hen, käytimme yksisoluista RNA: ta fluoresoivaa in situ-hybridisaatiota (RNA FISH) arvioidaksemme endogeenisen Lamp2: n ilmentymistä, X-linkittynyttä geeniä, joka normaalisti hiljenee XCI: n initiation40. Kun doksisykliinin indusoima Xist-ilmentymä, rbm6: n, Zzz3: n ja positiivisen kontrolli-Spen (täydentävä Kuva. 4a, b) johti lampp2: n hiljentymiseen, kun taas sen XCI-indusoima monoallelinen ilmaisu pysyi muuttumattomana thap7: n ehtyessä, joka ei ollut vuorovaikutuksessa Xistin kanssa ja jota käytettiin negatiivisena kontrollina (Kuva. 5c, d; täydentävä Kuva. 4c; täydentävä Taulukko 2). Xist: n (-doksisykliiniolojen) puuttuessa Lamp2: n ekspressio pysyi muuttumattomana yllä olevien proteiinien ehtyessä (täydentävä Kuva. 4d; täydentävä Taulukko 2). Tärkeää on, että X-kromosomin hiljentymisen viat eivät johtuneet Xist/Tsix: n muuttuneesta ilmentymästä yksittäisten proteiinien ehtyessä (täydentävä Kuva. 4 e). Yhteenvetona voidaan todeta, että toiminnallisesti tärkeiden interaktorien tunnistaminen incPRINT-tunnistettujen RBPs: ien joukosta osoittaa incprintin löytöpotentiaalin.