proteiinikomponenttien valmistus käyttöönvalmistukseen

E. coli-translaatiolaitteen komponentit, mukaan lukien translaatiotekijät ja aaRS, valmistettiin edellä kuvatulla tavalla 46. Myös rnasep-komponenttien, M1-RNA: n ja C5-proteiinin valmistus valmistettiin edellä kuvatulla tavalla 29. Muutimme C5-proteiinin protokollaa saostamalla sen 80% tyydyttyneellä ammoniumsulfaatilla ja liuottamalla sen dialysoimalla puskuria a vastaan (50 mM natriumasetaatti pH 6,5, 5 mM EDTA, 0,25 M NaCl ja 7 mM 2-merkaptoetanoli). Saatu sakka otettiin talteen sentrifugoimalla ja liuotettiin dialysoimalla puskuria B, jossa on 50 mM HEPES-KOH pH 7,6, 100 mM NH4Cl, 6 M ureaa ja 10 mM ditiotreitolia (DTT). Liuenneet proteiinit levitettiin 5 mL: n HiTrap SP HP-kolonniin (#17115101, GE Healthcare, USA), pestiin puskurilla B, joka sisälsi 7 mM 2-merkaptoetanolia 10 mM: n DTT: n korvikkeena, ja eluoitiin lineaarisella gradientilla 100 mM-2 M NH4Cl puskurissa B. C5-proteiinia sisältävät fraktiot analysoitiin SDS-Pagella, otettiin talteen, dialysoitiin puskuria D (50 mM HEPES-KOH pH 7,6, 0,8 M NH4Cl, 10 mM MgCl2, 2 m ureaa, 7 mm 2-MERKAPTOETANOLIA), sitten dialysoidaan puskuria D vastaan ilman ureaa. Tuloksena olevat liuokset konsentroitiin käyttäen Amicon Ultra 3 kDa: ta (#UFC800324, Merck Millipore, USA) ja dialysoitiin puskuria D vastaan ilman, että urea sisälsi 50% glyserolia. Puhdistettu C5-proteiini varastoitiin -30 °C: ssa.huomaamme, että voimme jakaa kaikki plasmidit pyynnöstä.

modifikaatioentsyymien valmistus iVTtRNAs: lle

modifikaatioentsyymit iVTtRNAs: lle valmistettiin seuraavasti. TsaB: n, TsaC: n, TsaD: n, TsaE: n, TrmD: n, GlyA: n, MnmC: n, MnmE: n ja gidan E. coli-geenit monistettiin E. coli A19-genomista käyttäen asianmukaisia alukkeita (lisätietoja 5). Monistetut geenit TsaC: lle, TsaD: lle, Tsae: lle, Glyalle, MnmC: lle, MnmE: lle ja Gidalle kloonattiin pET15b: ksi (#69661, Merck Millipore, USA) pieninä ubikitiinin kaltaisina modifioijina (SUMO) proteiinifuusioproteiineina, joissa His-tag, SUMO protein ja modifikaatioentsyymit järjestettiin tandemly-järjestyksessä. Tsab: n ja TrmD: n geenit kloonattiin Pet15b: ksi His-tag-fuusioproteiiniksi. Kaikki geenit kloonattiin Gibson assembly-tekniikalla (#E2611, New England Biolabs, USA). Tuloksena olevat plasmidit muunnettiin E. coli BL21 (DE3)–kannaksi ja kasvatettiin 1 lb-elatusaineessa OD660-arvoon 0, 6-1, 0 lämpötilassa 37 °C. Yliekspressio aiheutui IPTG: n lisäämisestä lopulliseen pitoisuuteen, joka oli 1 mM TsaB: lle, TsaC: lle, TsaD: lle, TsaE: lle ja TrmD: lle, tai 0,1 mM GlyA: lle, MnmC: lle, MnmE: lle ja Gidalle. Kun 3 tuntia oli viljelty 37°C: n lämpötilassa, solut kerättiin talteen. TsaB -, TsaC -, TsaE -, TrmD-ja mnme-yli-ilmentyneet solut suspendoitiin uudelleen 40 mL: aan Lysis-puskuria (50 mM Hepes-KOH, pH 7, 6, 1 M NH4Cl, 10 mM MgCl2 ja 7 mM 2-merkaptoetanoli), ja sonikaatio häiritsi niitä. Tuloksena saatu lysaatti sentrifugoitiin ja supernatantti otettiin talteen ja sekoitettiin 5 mL: aan täydellistä His-tag-Puhdistushartsia (#05893801001, Roche, Sveitsi) 1 tunnin ajan rotaattorilla. Hartsi pestiin 100 mL: lla Lyysipuskuria ja sen jälkeen proteiini eluoitiin 25 mL: lla eluutiopuskuria (50 mM Hepes-KOH, pH 7,6, 400 mM KCl, 10 mM MgCl2, 400 mM imidatsoli ja 7 mM 2-merkaptoetanoli). TsaB ja TrmD konsentroitiin Amicon Ultra 3 kDa: lla (#UFC800324, Merck Millipore, USA) ja sitten dialysoitiin Varastopuskuria vastaan (50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 500 mM KCl, 10 mM MgCl2, 7 mM 2-merkaptoetanoli ja 30% glyserolia). Ne olivat flash jäädytetty nestemäisellä typellä ja varastoidaan -80°C. Tsac, TsaE, ja MnmE, Ulp1 (#12588018, Thermo Fischer Scientific, USA) lisättiin talteen jakeet lopullinen pitoisuus 23 µg/ml poistaa His-merkitty SUMO proteiinia. Fraktiot dialysoitiin Katkaisupuskuria (50 mM Hepes-KOH, pH 7,6, 100 mM KCl ja 7 mM 2-merkaptoetanoli) vastaan yön yli, kun taas Katkaisupuskurissa oli 500 mM KCl MnmE-valmistusta varten. Dialysoituihin näytteisiin sekoitettiin jälleen 5 mL täydellistä his-tag-Puhdistushartsia rotaattorilla. Sitten kerättiin läpivirtausfraktiot, jotka sisältävät muutosentsyymejä. Talteen otetut näytteet konsentroitiin Amicon Ultra 3 kDa: lla TsaE: lle tai Amicon Ultra 10 kDa: lla (#UFC901024, Merck Millipore, USA) TsaC: lle ja MnmE: lle. Ne dialysoitiin Varastopuskuria vastaan, flash jäädytettiin nestemäisellä typellä ja varastoitiin -80 °C: n lämpötilaan.Glyavalmistuksessa kaikki Puskurit sisälsivät 10% glyserolia ja muut toimenpiteet olivat samat kuin MnmE-valmisteessa. Tsadin todettiin olevan kaikuluotauksen jälkeen liukenematon. Siksi proteiinia pelletoitiin sentrifugoimalla 20 400 × g: n lämpötilassa 4 °C: ssa 45 minuutin ajan ja se suspendoitiin uudelleen Lysis-puskuriin, jota täydennettiin 4-prosenttisella Triton X-100: lla. Suspensiota pelletoitiin jälleen sentrifugoimalla 20 400 × g 45 minuutin ajan. Pelletti liuotettiin Lysis-puskuriin täydennettynä 6 M urealla. Toinen menettely oli sama kuin MnmE-valmiste, paitsi että kaikki Puskurit sisälsivät 2 M ureaa. MnmC-valmisteessa kaikki vaiheet his-merkityn SUMO-proteiinin poistamiseen asti olivat samat kuin Glyavalmisteessa. Koska Mnmc ei sitoutunut spesifisesti His-tag-puhdistushartsiin, valittiin puhdistus anioninvaihtokromatografialla. Ulp1-käsittelyn jälkeen liuos dialysoitiin IEX-puskuria vastaan (50 mM Hepes-KOH, pH 7, 6, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2 ja 7 mM 2-merkaptoetanoli), minkä jälkeen liuos levitettiin 5 mL: n HiTrap Q HP-kolonniin (#17115401, GE Healthcare, USA). Kolonni pestiin 25 mL: lla IEX-puskuria ja sen jälkeen MnmC eluoitiin vuorausgradientillä 100 mM-1 M KCl IEX-puskurissa. Amicon Ultra 30 kDa (#UFC903024, Merck Millipore, USA) konsentroi mnmc: tä sisältävät fraktiot, dialysoi varastopuskuria vastaan, flash jäätyi nestemäisellä typellä ja varastoitiin -80°C: ssa.huomaamme, että voimme jakaa kaikki plasmidit pyynnöstä.

Ivttrna: n valmistaminen

kunkin iVTtRNA: n geenit (lisätietoja 1) kloonattiin pGEMEX-1-vektoriin (#P2211, Promega, USA) xbai-ja Bamhi-rajoitusalueiden välillä. DNA-mallit in vitro-transkriptiota varten PCR-monistettiin käyttämällä T7-promoottorialustaa forward primerina ja sopivia käänteisalusteita kullekin iVTtRNA: lle (lisätieto 1). Jokainen Käänteinen aluke sisälsi 2 ’- metoksimuunnoksen toisessa nukleotidissa 5 ’ -terminuksesta estääkseen templaattiriippumattoman ylimääräisen nukleotidi28: n lisäämisen. Tuotteet puhdistettiin fenoli / kloroformi / isoamyylialkoholi (25:24:1) uuttamalla, minkä jälkeen etanoli saostettiin, ja saostimet liuotettiin veteen. Run-off transcription of precursor iVTtRNAs with 27 extra nucleotides introduced at the 5′-terminus (5′-GGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGA-3′) was performed using the resultant DNA templates for 3 h at 37°C in 20 mL reaction mixtures containing 30 nM T7 RNA polymerase, 1 mM each ATP, GTP, CTP, and UTP, 40 mM HEPES-KOH pH 7.6, 20 mM MgCl2, 1.5 mM spermidine, 5 mM DTT, 20 μg PCR products, and 0.2 U/mL inorganic pyrophosphatase (#10108987001, Roche, Switzerland). Tämän jälkeen reaktioseoksiin lisättiin C5-proteiinista ja M1-RNA:sta koostuvat RNaasi-P: n komponentit 150 nM: ssä 27 ylimääräisen nukleotidin poistamiseksi, ja reaktioita inkuboitiin 1 tunnin ajan 37 °C: ssa.Transkriboidut ivttrnat käsiteltiin sitten happamalla fenoliuutteella, jota seurasi kloroformi/isoamyylialkoholi (10: 1) – uutto, minkä jälkeen ne puhdistettiin anioninvaihtokromatografialla. Ivttrnoja sisältävät näytteet lastattiin 10 mL: n HiTrap Q HP-kolonniin (#17115401, GE Healthcare, USA) ja pestiin Q-puskurilla (20 mM HEPES-KOH pH 7,6 ja 200 mM KCl). ivttrnat eluoitiin lineaarisella gradientillä 200 mM-1 M KCl Q-puskurissa. Urea-PAGE-menetelmällä määritellyt kohde-ivttrnoja sisältävät fraktiot otettiin talteen isopropanolisaostuksella, ja saostuneet ivttrnat liuotettiin veteen ja varastoitiin -80°C: ssa käyttöön asti. Huomaamme, että voimme jakaa kaikki plasmidit pyynnöstä.

Ivttrna: n modifikaatio

t6A37 modifikaatio suoritettiin reaktioseoksessa, joka sisälsi 50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 300 mM KCl, 20 mM MgCl2, 5 mM DTT, 50 mM NaHCO3, 1 μM CaCl2, 1 mM ATP, 1 mM Thr, 5 μM TsaC, 5 μM TsaB, 5 μM TsaD, 5 μM TsaE, 4 A260 unit/mL tRNAIleGAU or tRNAAsnGUU or tRNAPheGAA. m1G37 modification was performed in the reaction mixture containing 50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 200 mM KCl, 10 mM MgCl2, 36.4 μM S-adenosyl methionine (SAM), 1.5 μM TrmD, 10 A260 unit/mL tRNAProGGG or tRNAPheGAA. mnm5U34 was performed in the reaction mixture containing 50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 150 mM KCl, 12.5 mM MgCl2, 5 mM DTT, 500 μM FAD, 1 mM tetrahydrofolate, 4 mM GTP, 2.5 mM NADH, 0.2 mM pyridoksaali-5′ – fosfaatti, 1 mM Ser, 1 mM Gly, 36, 4 µM SAM, 0, 1 yksikkö/µL rekombinantti Rnaasin estäjä (#2313 a, TaKaRa, Japani), 10 µM GlyA, 3 µM GidA, 3 µM MnmE, 2, 5 µM mnmc, 6 A260 yksikkö/mL trnagluuc tai tRNAGluCUC. Kun trnas oli inkuboitu 37°C:ssa 2 tunnin ajan t6A37-ja m1G37-modifikaatioiden osalta tai 4 tunnin ajan mnm5U34-modifikaatioiden osalta, se käsiteltiin happamalla fenoliuutteella, jota seurasi kloroformi/isoamyylialkoholi (10: 1) – uutto ja otettiin talteen isopropanolisaostuksella. Saostuneet trnat liuotettiin veteen ja varastoitiin -80 °C: n lämpötilaan. Mnm5u34-modifikaatiossa reaktio suoritettiin jälleen talteen otetulla tRNAs: llä. Niitä käsiteltiin happamalla fenoliuutolla, jota seurasi kloroformi / isoamyylialkoholi (10: 1) uutto, suolattu MicroSpin G-25-kolonnilla (#27532501, GE Healthcare, USA) ja talteen isopropanolisaostuksella. Saostuneet trnat liuotettiin veteen ja varastoitiin -80 °C: n lämpötilaan.muunnostehokkuuden määrittämiseksi käytettiin 57,1 µM thr: ää 1 mM Thr: n sijasta ja seosta ilman TsaD: tä käytettiin kontrollina t6a37-modifioinnissa. 36.4 µM S–adenosyylimetioniinia käytettiin ja M1G-modifikaation kontrollina käytettiin seosta ilman TrmD: tä ja mnm5u34-modifikaation kontrollina ilman Gidaa. Inkuboinnin jälkeen 37 °C: ssa aliquotit (10 µL) vedettiin pois ja havaittiin Whatman 25 mm GF/C-suodatinlevyillä (#1822-025, GE Healthcare, USA). Suodatinlevyt pestiin kahdesti 10-prosenttisella TCA: lla, sitten etanolilla, minkä jälkeen radioaktiivisuus mitattiin nestemäisellä tuikelaskurilla. Mnm5u-muunnoksen kvantifiointia varten trnas puhdistettiin kuten edellä ja sitten 0,02 A260-yksikkö havaittiin suodatinlevyillä sen sijaan.

Aminoasylaatio

Aminoasylaatiokokeita tehtiin aiemman raportti47. Reaktioseokset (10 µL) sisälsivät 100 mM HEPES-KOH pH 7,6, 15 mM MgCl2, 40 mM KCl, 1 mM DTT, 4 mM ATP, 1 yksikkö/µL rekombinantti Rnaasin estäjä (#2313 A, TaKaRa, Japani), 50 nM tai 1, 5 µM aaRS, joka vastaa kutakin aminohappoa, 20 µM-aminohappo tai 68 µM Asn asparagiiniaminoasylaatiossa, ja 2 A260 unit/mL tRNA. Metylaation mittaamiseen käytettiin sen sijaan 0,6 µM met: n ja 3,4 µM: n kylmän L-metioniinin seosta. Cys saatiin pelkistämällä kystiiniä 50 mM: n DTT: llä 37 °C: ssa 15 minuutin ajan. Kysteinylaation mittaamisessa DTT-pitoisuus oli 5 mM.kun käytettiin alkuperäisiä tRNA-seoksia, lisättiin 40 A260 unit/mL tRNA-seoksia (#10109541001, Sigma-Aldrich, USA). Inkuboinnin jälkeen 37°C: ssa 30 minuutin ajan aliquotit (8 µL) vedettiin pois ja havaittiin Whatman 25 mm GF/C-suodatinlevyillä (#1822-025, GE Healthcare, USA). Suodatinlevyt pestiin kahdesti 10-prosenttisella TCA: lla, sitten etanolilla, minkä jälkeen radioaktiivisuus mitattiin nestemäisellä tuikelaskurilla.

OKTAPEPTIDISYNTEESI puhtaan järjestelmän kanssa

OKTAPEPTIDEJÄ koodaavat DNA-mallit PCR-monistettiin sopivilla alukkeilla (Lisätietoja 2) käyttäen pURE1-vektoria (#PUREV001, BioComber, Japani), joka sisältää T7-promoottorijakson, ja ribosomien sitoutumiskohtaa (Shine-Dalgarno-sekvenssi) mallina. Vahvistetut DNA-mallit puhdistettiin QIAquick PCR-puhdistussarjalla (#28104, QIAGEN, Saksa). Oktapeptidien synteesireaktioissa oli 50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM kaliumglutamaatti, 13 mM magnesiumasetaatti, 2 mM spermidiini, 1 mM DTT, 2 mM ATP, 2 mM GTP, 1 mM UTP, 1 mM CTP, 20 mm kreatiinifosfaatti, 10 µg/mL 10-formyyli-5,6,7,8-tetrahydrofoolihappo, 0,2 µM ribosomi, 4 nM DNA-malli, proteiinipitoiset puhtaat systeemikomponentit mukaan lukien translaatiotekijät ja entsyymit, aminohapot ja tRNAs. Proteiinipitoisten puhtaan järjestelmän komponenttien pitoisuudet oli kuvattu aiemmassa protokollassa46. Huomaamme, että kaikki 20 aarssia olivat mukana tässä kokeessa DNA-malleista ja testikodoneista riippumatta. Aminohappojen koostumus ja pitoisuus, jotka riippuvat testikodoneista, on lueteltu lisätiedoissa 2. IVTtRNAs: n koostumus riippuu mallista, ja reaktiot suoritettiin käyttäen iVTtRNAs-perusjärjestelmää (lisätieto 2) testattaessa iVTtRNAs: ää tai ilman sitä (lisätieto 2). Kunkin iVTtRNA: n pitoisuudeksi vahvistettiin 6 µM. Kun käytettiin alkuperäisiä tRNA-seoksia, niiden tilalle lisättiin 56 A260 unit / mL tRNA-seoksia (#10109541001, Sigma-Aldrich, USA). Reaktioita suoritettiin 60 minuutin ajan 37 °C: ssa ja aliquotit vedettiin pois, laikattiin Whatman 3 MM suodatinpapereille (#1822-025, GE Healthcare, USA), keitettiin 10%: ssa TCA: ta 90 °C: ssa 30 minuutin ajan deasylaattiaminoasyyli-RNA: ksi. 10%: n TCA-liukenemattoman fraktion radioaktiivisuus mitattiin nestemäisellä tuikelaskurilla.

proteiinisynteesiä puhtaalla systeemillä

proteiinisynteesiä kokeiltiin PUREfrex 2.0 kit-valmisteella (#PF201, GeneFrontier Corporation, Japani) ilman Trna-seoksia liuoksessa I (Puskuriseos). Lisäsimme 0.2 µM Met, 4 nM PCR-monistettu DNA-malli DHFR-tai sfGFP-lauseketta varten (lisätietoja 3) ja tietty määrä iVTtRNA-seosta tai alkuperäistä tRNA-seosta. Reaktiot suoritettiin 30 tai 37 °C: n lämpötilassa 12 tunnin ajan, ja syntetisoidut proteiinit analysoitiin.

syntetisoitujen proteiinien

syntetisoitujen DHFR-ja sfGFP-proteiinien analyysi, joka sisälsi radioaktiivista Metiä, analysoitiin 15% SDS-Pagella, ja geelikuva visualisoitiin Bas-5000 Bio-imaging analyzerilla (GE Healthcare, USA). SfGFP-ekspression aika-kurssianalyysi tehtiin mittaamalla sfGFP-fluoresenssi 3 minuutin välein StepOne qRT-PCR-järjestelmällä (#4376373, Applied Biosystems, USA). Synteettisen sfGFP: n fluoresenssikuvat reaktioseoksissa saatiin LAS-4000-instrumentilla (GE Healthcare, USA). Syntetisoidun DHFR: n aktiivisuus mitattiin edellä kuvatulla tavalla 44. Reaktioseokset (2 mL) sisälsivät 50 mM MES-KOH pH 7,0, 25 mM TRIS-HCl pH 7,0, 25 mM etanoliamiinia, 100 mM NaCl, 10 mM 2-merkaptoetanolia, 0.1 mM EDTA: ta, 100 µM dihydrofoolihappoa ja 10 µL: n määräosa puhdasta reaktioseosta, ja niitä inkuboitiin 37°C: ssa 15 minuutin ajan. Seuraavaksi 20 mM NADPH: ta lisättiin lopulliseen 200 µM pitoisuuteen, ja absorbanssin lasku 340 nm: ssä mitattiin 10 minuutin ajan V-550-spektrofotometrillä (Jasco, Japani). Yksi DHFR-yksikkö määriteltiin entsyymimääräksi, joka tarvitaan käsittelemään 1 µmol dihydrofoolihappoa 1 minuutissa 37 °C: n lämpötilassa.

LC-MS-analyysi synteettisistä proteiineista

DHFR LIPPUSEKVENSSIN ollessa päätepisteessään (lisätietoja 3) syntetisoitiin PUREfrex 2: lla.0 pakki (#PF201, GeneFrontier Corporation, Japani) ilman Trna-seoksia liuoksessa I (Puskuriseos). Lisäsimme lisäksi DHFR: ään 4 nM: n PCR-monistetun DNA-mallin, joka on merkitty LIPPUSEKVENSSILLÄ sen C-päätepisteessä (lisätietoja 3) ja määrätyllä määrällä iVTtRNA-seosta tai alkuperäistä Trna-seosta. Reaktiot suoritettiin 30 °C: ssa 12 tunnin ajan. syntetisoitu DHFR puhdistettiin Anti-FLAG m2-magneettisilla Helmillä (#M8823, Sigma-Aldrich, USA). Reaktioseosten aliquotit (55 µL) sekoitettiin 245 µL LIPPUPESUPUSKURIIN (50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 150 mm NaCl, 20 mm Mg(OAc)2) ja edelleen sekoitettuna 30 µL: n helmiin 1 tunnin ajan. Helmet pestiin 210 µL: lla LIPPUPESUPUSKURIA, minkä jälkeen ne pestiin puskurilla ilman Mg(Oac)2 kahdesti (210 µL ja 180 µL). Tämän jälkeen DHFR eluoitiin 50 µL: lla LIPPUPESUPUSKURIA ilman Mg(Oac)2: ta, mutta sitä täydennettiin 100 µg/mL 3xFLAG-peptidillä (#F4799, Sigma-aldrich, USA) sen jälkeen, kun sitä oli sekoitettu kevyesti 1 tunnin ajan. näytteiden valmistelu LC-MS-analyysia varten suoritettiin faasinsiirtopinta-aktiivisen aineen (PTS) avustaman protokollan48 mukaisesti. 40 µl eluoituihin näytteisiin lisättiin 4 µL tiheää PT-puskuria (100 mM natriumdeoksikolaattia, 100 mM natrium-n-lauroyylisarkosinaattia ja 500 mM NH4HCO3). Ne pelkistettiin 10 mM: n TCEP: llä 37 °C: ssa 30 minuutin ajan, alkyloitiin 20 mM: n jodiasetamidilla 37 °C: ssa 30 minuutin ajan ja sammutettiin 20 mM: n KYS: llä. Jokainen reaktioliuos jaettiin kahteen osaan. Yksi sulatettiin 10 ng/µl Lys-C: llä (#90051, Thermo Fisher Scientific, USA) ja 10 ng/µl trypsiinillä (#90057, Thermo Fisher Scientific, USA) 37 °C: ssa yön yli. Toinen sulatettiin 10 ng/µl Asp-N: llä (#90053, Thermo Fisher Scientific, USA) 37 °C: ssa yön yli. Mädätyksen jälkeen 10% trifluorietikkahappoa (TFA) lisättiin lopulliseen 1%: n konsentraatioon ja reaktioliuokset sentrifugoitiin 15 000 × g: n kokoon 5 minuutin ajan pesuaineiden saostamiseksi. Supernatantit suolattiin itsevalmistetulla tips49-vaiheella ja kuivattiin Speedvacilla. LC-MS-analyysi tehtiin Orbitrap-massaspektrometrillä (LTQ Orbitrap Velos Pro, Thermo Fisher Scientific, USA), joka on varustettu nanospray-ionilähteellä (Nanospray Flex, Thermo Fisher Scientific, USA) ja nano-LC-järjestelmällä (UltiMate 3000, Thermo Fisher Scientific, USA). Kuivatut peptidiseokset liuotettiin liuokseen, joka sisälsi 5% asetonitriiliä ja 0,1% TFA: ta, ja jokainen näyte levitettiin nano-LC-järjestelmään. Peptidit tiivistettiin ansapylvään avulla (#164535, 0.075 × 20 mm, 3 µm, Acclaim PepMap 100 C18, Thermo Fisher Scientific, USA) ja sitten erotettu nanokapillaarikolonnilla (#NTCC-360/100-3-153, 0.1 × 150 mm, 3 µm, C18, Nikkyo Technos, Japani), jossa käytetään kahta liikkuvaa faasia A (0,1% muurahaishappoa) ja B (asetonitriili ja 0,1% muurahaishappoa), joissa gradientti (5% B 5 min, 5-45% B 45 min, 45-90% B 1 min ja 90% B 4 min) virtausnopeudella 500 nL/min. Elution oli suoraan sähkösprayed (2.2 kV) osaksi MS (positiivinen tila, skannausalue 200-1500 m/z, 60,000 FWHM resoluutio)50.