tapaustutkimus: Jännitetykkien natriumkanavien estäjien löytäminen

havainnollistaakseen edellä kuvattuja ionikanavien huumeiden löytämiseen liittyviä kysymyksiä tämän artikkelin loppuosa kuvaa tapaustutkimusta, jossa keskitytään jännitetykkien natriumkanavien estäjien tunnistamiseen kroonisen neuropaattisen kivun hoidossa. Kivun hoito on vakava lääketieteellinen kysymys ja lääketeollisuudessa on suuri ponnistus kehittää uusia hoitoja tähän tilaan. Erityisesti neuropaattisen kivun hoito, joka määritellään International Association for the Study of Pain (IASP) – järjestön määritelmän mukaan ”krooniseksi kivuksi, joka johtuu ääreishermoston primaarisesta leesiosta tai toimintahäiriöstä”, on edelleen merkittävä hoitamaton lääketieteellinen tarve.

on selvää, että jännitteellä varustetut natriumkanavat (Nav1) ovat avainasemassa kipusignalointiin tarvittavien aistihermojen vaikutuspotentiaalien originoinnissa ja leviämisessä. Nonubtype-selektiivisten natriumkanavasalpaajien, kuten novokaiinin, paikalliset sovellukset tarjoavat täydellisen kivunlievityksen johtumislohkon kautta. Tämä lähestymistapa kivunlievitykseen rajoittuu kuitenkin vain hyvin harvoihin sovelluksiin, kuten hammashoitoon, sillä natriumkanavat ovat elintärkeitä myös sydämen, keskushermoston, luurankolihaksen ja ei-reseptoristen sensoristen neuronien johtumiselle. Nav1 – superperheeseen kuuluu 10 jäsentä (Yu ja Catterall, 2004). Näistä alatyypeistä seitsemän, Nav1.1, Nav1.3, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8 ja Nav1.9, esiintyy ääreishermostossa (PNS). Näistä Nav1. 7, Nav1.8 ja Nav1.9 ilmaistaan pääasiassa nociseptiivisillä neuroneilla, ja Nav1.3 on pääasiassa alkion, mutta on jopa säännelty aikuisten PNS loukkaantumisen jälkeen. Tämä rajallinen ilmaisumalli tekee näistä alatyypeistä houkuttelevia kohteita uusien kipulääkkeiden kehittämiselle. Niiden suhteellinen osuus kivun signalointiin, ja erityisesti neuropaattisen kivun signalointiin, on kuitenkin epäselvä ja voi vaihdella kivun eri etiologioiden ja aistien ominaisuuksien kanssa.

yhden Nav1–alatyypin molekyyliselektiivisyyden puuttuessa on mahdollista kohdistaa Nav1-kanavat tiettyyn konformaatiotilaan säilyttäen samalla natriumkanavasta riippuva impulssien johtuminen. Tämän tyyppinen valtiosta riippuva inhibitio on perusta terapeuttiselle ikkunalle, joka nähdään natriumkanavan estäessä antikonvulsantteja ja rytmihäiriölääkkeitä, kuten lamotrigiinia ja lidokaiinia. Näillä lääkkeillä on suurempi affiniteetti avoimissa ja/tai inaktivoiduissa tiloissa oleviin kanaviin kuin lepääviin, suljettuihin kanaviin. Tämä estomekanismi suosii sitoutumista nopeasti ampuvissa tai osittain depolarisoituneissa kudoksissa. Neuropaattisen kivun tulisi olla herkkä tälle estomekanismille, koska sen arvellaan johtuvan vamman aiheuttamista depolarisaatioalueista, hypoteesia, jota tukee systeemisesti subanesteettisinä annoksina annetun lidokaiinin kliininen teho. Lisäksi, nonubtype-valikoiva, valtion riippuvainen lohko voi tarjota suurin teho, koska yksittäiset tyrmäys Nav1.3, Nav1.7, Nav1.8, tai Nav1.9 ei antanut vakuuttavaa näyttöä minkään näistä kanavista hallitsevasta roolista neuropaattisen kivun signaloinnissa.

tämän perustelun perusteella päätettiin aluksi käyttää ei -ubtyyppisiä selektiivisiä, valtiosta riippuvia Nav1-estäjiä ja samalla seurata molekyyliselektiivisyyttä testaamalla samanaikaisesti tärkeitä yhdisteitä Nav1.7: ssä, Nav1.5: ssä (sydämen ensisijainen natriumkanava) ja Nav1.8: ssa.

kalvopotentiaaliin perustuvaa määritystä käytettiin ∼200 000 yhdisteen seulomiseen arvolla Nav1.8, joka on stabiilisti ilmaistu rekombinanttisolulinjassa. Tämä HTS-määritys perustui Aurora Biosciencesin (Priest et al., 2004). Nav1. 8-kanavat esiinkuboitiin testiyhdisteellä ja kemiallisella agonistilla deltametriinillä solunulkoisen natriumin puuttuessa. Myöhemmin natriumin lisääminen johti kalvon depolarisaatioon ja Nav1-lohko määritettiin interferenssinä solun depolarisaatioprosessiin.

vaikka Alkuruutu Nav1: ssä.8 tuotti erilaisia osumia, vain yhtä yhdistettä pidettiin käyttökelpoisena johtolankana lääketieteellisessä kemiassa. Ennen resurssien sitomista tähän lyijyyn yhdistettä, disubstitutoitua sukkinimidia, jota kutsutaan BPBTS: ksi (N-{ metyyli }-N’-(2,2′-bithien-5-yylimetyyli)sukkinimidiksi), tutkittiin yksityiskohtaisesti manuaalisella koko kennon jänniteliittimellä. BPBTS: n havaittiin inhiboivan kaikkia Nav1-alatyyppejä, joiden teho oli samankaltainen, ja inhibitio riippui kalvopotentiaalista ja stimulaatiotaajuudesta. Tämä inhibitorinen mekanismi oli yhdenmukainen yhdisteen suuremman affiniteetin kanssa avoimessa ja inaktivoidussa tilassa oleviin kanaviin verrattuna levossa oleviin kanaviin. Lisäksi BPBTS oli kahta suuruusluokkaa voimakkaampi kuin kliinisesti käytetyt epilepsialääkkeet ja rytmihäiriölääkkeet Nav1-salpaajat, estäen inaktivoidun tilan Nav1. 8, Nav1.7, Nav1.5 ja Nav1.2, Ki-arvot olivat 0, 09, 0, 15, 0, 08 ja 0, 14 µM ja lepotilan Kr-arvot 1, 5, 1, 3, 0, 3 ja 1, 2 µM (Priest et al., 2004).

sellaisenaan bpbts oli houkutteleva johtolanka lääketieteellisessä kemiassa; sen pääasialliset rasitteet ovat heikko farmakokineettinen profiili. BPBTS: n analogien ja julkaistujen Nav1–inhibiittorien profiloinnin aikana, käyttäen kalvopotentiaalipohjaista fluoresoivaa seulontamääritystä, havaittiin muutamien yhdisteiden osalta rakenteellisia eroja fluoresoivassa määrityksessä ja elektrofysiologiassa määritettyjen potenssien välillä. Poikkeamat johtuivat näiden yhdisteiden ja Nav1.7-kanavien avaamiseen käytetyn agonistin veratridiinin välisestä vuorovaikutuksesta. Tämän jälkeen fluoresoivaa määritystä muutettiin siten, että Nav1-kanavat esiinkuboitiin testiyhdisteellä fysiologisissa solunulkoisissa natriumpitoisuuksissa ja Nav1-riippuvainen depolarisaatio aloitettiin agonistisella additiolla (Fig. 1). Tässä modifioidussa määrityksessä mitatut kanavan inhibitoriset potenssit korreloivat erittäin hyvin elektrofysiologisesti määritetyn inaktivoidun tilan inhibition kanssa monissa Nav1-estäjien rakenneluokissa (Felix ym., 2004; Liu et al., 2006).

vaikka bpbts: n analogit eivät ylittäneet alkuperäistä tehoa, lääketieteellinen kemia onnistui parantamaan farmakokineettistä profiilia tuottaen lopulta Trans-N-{metyyli }-N-metyyli-N’-syklopentaani-1,2-dikarboksamidin (CDA54), jonka hyötyosuus suun kautta oli 44%, puoliintumisaika tunti ja puhdistuma 14 ml/min / kg, mikä profiloitiin laajasti in vivo (Brochu et al., 2006). Kahdessa neuropaattista kipua käsittelevässä rottamallissa CDA54 (10 mg/kg suun kautta annettuna) vähensi merkittävästi hermovaurion aiheuttamaa käyttäytymisyliherkkyyttä 44–67%. Sama annos / cda54: n pitoisuus plasmassa ei vaikuttanut akuuttiin nociceptioon (rotan keittolevytesti), motoriseen koordinaatioon (rotorodin testi) eikä sydämen johtumiseen (kardiovaskulaarikoiralta mitatut elektrofysiologiset parametrit). Nämä ominaisuudet ovat vastakohtana nykyisille neuvolassa käytettäville natriumkanavan salpaajille, jotka aiheuttavat rotilla motorisen koordinaation heikkenemistä ja ihmisellä keskushermoston haittavaikutuksia kaikkina tehokkaina annoksina. Mielenkiintoista on, että suun kautta annettuna CDA54: n aivojen ja plasman suhde oli 0, 03. Sen sijaan kliinisesti käytetyt Nav1-salpaajat kerääntyvät keskushermostoon, ja mekletiinin aivojen ja plasman suhde on yli 10. Nämä CDA54: stä saadut tiedot viittaavat vahvasti siihen, että pelkästään PNS: n natriumkanavien esto on tehokasta neuropaattisen kivun eläinmalleissa ja että Nav1-estäjien KESKUSHERMOSTOALTISTUKSEN rajoittaminen on varteenotettava lähestymistapa Nav1-estäjien kehittämiseen parantuneella terapeuttisella indeksillä.

UHTS–kampanja, jossa käytettiin Nav1.7: n estäjien seulomiseksi kuvattua kalvopotentiaalipohjaista määritystä, löysi uudet 1-bentsatsepiini-2-yhden kanavan estäjät (Hoyt et al., 2007; Williams ym., 2007). In vivo arvioituna tämän estäjäryhmän jäsenet olivat suun kautta otettuina tehokkaita jyrsijöiden neuropaattista kipua ja epilepsiaa koskevissa malleissa. Tärkeää on, että jotkut tämän luokan jäsenet osoittivat molekyylisen selektiivisyyden Nav1. 7-kanaville (Williams et al., 2007). Esimerkiksi viikunan yhdiste 2. 2 oli erittäin valtion riippuvainen ja ∼10-kertainen valikoiva Nav1. 7 yli Nav1.8 ja Nav1.5. Voimakkain, joskaan ei alatyypin selektiivinen, tämän luokan jäsen Nav1. 7-estäjät (yhdiste 1, BNZA; Kuva. 2) tritioitiin. BNZA sitoutuu suurella affiniteetilla (Kd 1, 6 nM) rekombinanttiin Nav1, 7-kanavaan. Tämä on ensimmäinen osoitus suuren affiniteetin ligandin sitoutumisesta Nav1. 7: ään ja tarjoaa arvokkaan seulontatyökalun Nav1.7-selektiivisten yhdisteiden etsimiseen. 1-bentsatsepin-2-onin rakennesarjasta saadut tiedot viittaavat siihen, että Nav1.7-selektiivisiä analogeja voidaan tunnistaa, ja sopivilla farmakokineettisillä ja lääkeaineenvaihdunnan ominaisuuksilla tällaisia yhdisteitä voidaan kehittää analgeettisiksi aineiksi, mikä saattaa parantaa siedettävyyttä verrattuna olemassa oleviin lääkkeisiin, joita käytetään neuropaattisen kivun hoitoon. Tuki alatyyppiselektiivisten natriumkanavan estäjien kehittämiselle uusina kipulääkkeinä tulee äskettäisestä raportista suuren affiniteetin Nav1. 8 selektiivisestä lääkeaineesta, joka intraperitoneaalisesti annettuna oli tehokas monenlaisissa jyrsijöiden kipumalleissa(Jarvis et al., 2007).

mahdollinen vaihtoehtoinen tapa etsiä alatyyppiselektiivisiä natriumkanavan estäjiä olisi seuloa yhdisteet, jotka kohdistuvat kanavan porttimekanismeihin. Useiden peptidien on aiemmin osoitettu muokkaavan natriumkanavien gataatiota, mutta harvojen pienten molekyylien, erityisesti inhibiittorien, on kuvattu toimivan tällä tavalla. Yksi tällainen aine on ProTx-II, 30-aminohappopeptidi, joka on puhdistettu Tarantulan myrkystä; tämä peptidi estää natriumkanavia ja osoittaa selektiivisyyttä Nav1. 7: lle (Smith et al., 2007). ProTx-II sitoutuu natriumkanavien lepotilaan ja siirtää kanavan aktivoinnin jänniteriippuvuuden depolarisoituneempiin potentiaaleihin. Voimakkaat depolarisaatiot voittavat kanavan eston, joka on tämän tyyppisen gating-modifier-peptidin tunnusmerkki. Yksi mahdollinen strategia gating modifier peptidin pienimolekyylimimetiikan tunnistamiseksi on radioaktiivisen ProTx-II: n määrittäminen biologisesti aktiivisessa muodossa ja sitoutumiskoe Nav1, 7-kanavilla heterologisesti ilmaistuna solulinjassa. Protx-II-sitoutumista moduloivien pienten molekyylien seulonta voi paljastaa uusia kanavaluokkia, jotka jakautuvat kalvoon ja häiritsevät porttikielen liikettä estäen siten kanavan avautumisen. Tämän tyyppisen UHTS: n etuna on se, että siinä voidaan käyttää suuria pitoisuuksia testiyhdisteitä, mikä on mahdotonta väriainepohjaisessa seulonnassa fluoresenssihäiriön vuoksi, jota esiintyy tyypillisesti monien pienten orgaanisten molekyylien suurina pitoisuuksina. Koska jotkut gating modifier peptidit sitoutuvat alueille, jotka ovat ainutlaatuisia tiettyjä kanavia superperheeseen, alatyyppiselektiivisiä inhibiittoreita voidaan tunnistaa käyttämällä tällaista strategiaa.