systeeminen agonistinen syöpä immunoterapia indusoi CD4-ja CD8 T-lymfosyyttien eritasoista laajenemista lymfoidisissa ja perifeerisissä elimissä

anti-CD40: n ja IL-2: n yhdistelmän on osoitettu aiheuttavan viivästynyttä kasvua ja taantumista useissa hiiren kasvainmalleissa . Samoin kuin julkaistut tiedot, joissa käytettiin solulinjan kasvainmalleja , rintarauhasen intraepiteelisen neoplasia-outgrowth (min-O)-mallin, kudossiirtolinjan hoito anti-CD40-ja IL-2-immunoterapialla (IT) johti merkittäviin tuumorivasteisiin (P = 0, 0057), mukaan lukien regressio >50% hoidetuista hiiristä (Lisätiedosto 1: kuva S1A). Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että nämä tuumorivasteet johtuvat CD8 T-soluista, joten arvioimme T-solujen fenotyyppiä pernassa sekä kasvaimessa ja keuhkoissa (yhteinen metastaattinen sivusto monille eri kasvainmalleille). Vaikka huomasimme hoidon yleensä indusoineen CD8: n laajenemisen kaikissa elimissä, havaitsimme joitakin eroja CD8 T-solujen muistin fenotyypissä eri elinten alueilla (Lisätiedosto 1: kuva S1B-C).

Me ja muut olemme aiemmin osoittaneet, että vahvat immunostimulatoriset hoidot aiheuttavat voimakasta muistin (CD44high) CD4-ja CD8 T-solujen lisääntymistä pernassa ja imusolmukkeissa . Lisäksi havaittiin, että CD4 -, mutta ei CD8 -, T-solut läpikäyvät myös aktivaation indusoiman solukuoleman interferonista(IFN) – γ-riippuvaisella tavalla, mikä johtaa CD4 T-solujen määrän vähäiseen lisääntymiseen näissä samoissa elimissä verrattuna lähtötilanteeseen . Nämä tiedot on tuotettu lymfaattisen elimen lukemien avulla. Immunoterapialla hoidetuilla hiirillä Havaittujen fenotyyppien valossa aktivoitujen T-solujen laajeneminen, aktivoituminen ja apoptoosi voivat kuitenkin vaikuttaa eri tavoin perifeerisissä kudoksissa. Siksi pyrimme edelleen luonnehtimaan ja vertailemaan T-solujen aktivointia perifeerisissä elimissä (joissa primaarikasvain ja/tai metastaattinen leesiot voivat oleskella) ja sekundaarisissa lymfoidisissa elimissä (joita usein kartoitetaan immunoterapeuttisten tutkimusten aikana vaikutusmekanismien arvioimiseksi). Arvioimme CD8 – ja CD4 T-solujen (Foxp3neg) taajuutta, laajenemista ja apoptoosia systeemisesti sekä imukudoksessa että perifeerisissä elimissä. Yhdenmukainen ryhmämme aiempien raporttien kanssa, mutta ei merkittävästi muuta niiden yleistä esiintymistiheyttä (Kuva. 1A), anti-CD40/IL-2-immunoterapia laajensi merkittävästi CD8 T-solujen kokonaismäärää perna-ja imusolmukkeissa (Kuva. 1b). Kun CD8: n kokonaislukumäärä kasvoi, bromodeoksiuridiinia (BrdU) in vivo sisältävien CD8 T-solujen esiintymistiheys laajeni merkittävästi, eikä solunulkoisen liitteen V ilmentymisen perusteella arvioitu apoptoottisten solujen osuus Eronnut merkitsevästi kontrolleista (Kuva C-D). Sen sijaan CD4 T-solujen kokonaisfrekvenssi laski eikä lukumäärä muuttunut merkittävästi verrattuna kontrolleihin samoissa elimissä (Kuva. 1 A-b). Vaikka CD4 T-solut laajenivat brdu: n inkorporaation perusteella, merkittävä osa niistä kävi läpi myös apoptoosin (Fig. 1c-d), jolloin kokonaislukumäärä muuttuu nettomääräisesti merkityksettömäksi. Tiedot olivat linjassa aiemmin havaitun kanssa . Kun arvioimme ei-lymfoidisia elimiä, mukaan lukien keuhkot ja maksa, näimme samanlaisia suuntauksia sekä CD4-että CD8 T-soluissa, nimittäin että CD8 T-solut laajenivat ja säilyivät kaikissa sitä seuraavissa elimissä (Kuva. 2A-b) kun taas CD4 T-solut (Foxp3neg) laajenivat ja samanaikaisesti läpi apoptoosin samassa määrin, mikä johti merkityksettömiin muutoksiin sekä niiden taajuuksissa että lukumäärissä (Fig. 2C-d) reuna-alueilla.

T-solujen muistin fenotyypit vaihtelevat CD8 T-soluissa sekundaaristen imukudosten ja perifeeristen muiden kuin imukudosten välillä, mutta ei CD4 T-soluissa sen jälkeen

hiirillä CD4-ja CD8 T-solut voidaan luokitella CD62L: n (l-selektiini) ja CD44-lausekkeen perusteella edelleen muisteihin ja naiiveihin fenotyyppeihin kun cd44lowcd62l+ – populaatiota pidetään naiivina (tn), cd44highcd62l+ – populaatiota pidetään keskusmuistina (TCM) ja cd44highcd62lneg-populaatiota efektorina ja/tai efektorimuistina (te/em). Tiedetään, että CD4-ja CD8 T-solut eroavat toisistaan näiden osajoukkojen jakautumisessa imukudos-ja perifeerisissä elimissä. Vaikka aiemmin hoitamattomat taajuudet CD4-ja CD8-populaatioissa pysyvät suhteellisen samoina, CD44high-populaatiossa keskusmuisti on enemmän vinossa CD8 T-soluissa ja efektorimuisti vinossa CD4 T-soluissa lepäävässä organismissa . Perifeerisissä elimissä sekä CD4-että CD8-T-solujen T-solut ovat kuitenkin pääasiassa efektorimuistin fenotyyppiä .

aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että muistin fenotyyppisolut (CD44high) ovat tärkein solutyyppi, joka laajenee stimuloivan immunoterapian jälkeen . Jotta ymmärtäisimme paremmin CD4-ja CD8 T-solujen koostumusta eri elimissä, arvioimme niiden muistin fenotyypin tilan jokaisessa sitä seuraavassa elimessä. Levossa lymfaattisten elinten CD8 T-solujen CD44high-populaatio oli pääasiassa TCM (>90%), kun taas perifeerisissä elimissä se oli yhdistelmä ~60% TCM: n kanssa (kuva. 3a, c, e,-f). Yleensä se johtaa yleiseen laajenemiseen CD44high taajuus kaikissa elimissä. TCM: n frekvenssit olivat joko muuttumattomia tai hieman kasvaneita, kun taas TE/EM-populaatiot laajenivat merkittävästi (Fig. 3e-f) ~10%: sta 30%: iin lymfoidisissa elimissä ja vaikuttavasti ~30-85%: sta perifeerisissä elimissä.

cd44-T-solujen populaatiossa lepäävät hiiret olivat voimakkaammin vinoutuneet kohti TE / EM-fenotyyppiä, noin 60-70% lymfoidissa ja 75-95% perifeerisissä kudoksissa (Kuva. 3b, d). Kuten tapahtui CD8 T-soluissa, sen jälkeen CD44high-osuus laajeni, mutta koska se oli niin voimakkaasti vinoutunut te/EM-fenotyyppiin levossa olevien hiirten kaikissa elimissä, CD4 TE/EM-frekvenssit olivat suurelta osin yhdenmukaisia kaikissa IT-käsitellyissä hiirissä (Kuva. 3 e). TCM: n CD4-frekvenssit pysyivät suhteellisen matalina ja yhdenmukaisina kaikissa elimissä, sekä ennen sitä että sen jälkeen (kuva. 3 F).

aktivaatiomarkkerien ilmentyminen CD4-ja CD8 T-soluissa riippuu sijainnista ja muistin fenotyypistä

proliferaation ja apoptoosin erojen lisäksi olemme rutiininomaisesti huomanneet, että CD4-ja CD8 T-solut säätelevät eri tavoin sitä seuraavia aktivaatio-ja inhibitorisia molekyylejä. Huomattavin esimerkki tästä on PD-1, joka sekundaarisiin lymfoidisiin elimiin (pernaan ja LN: ään) keskittyvien tutkimusten perusteella säädeltiin ensisijaisesti CD4-eikä CD8 T-soluissa ja jonka luultiin todennäköisesti osallistuvan etuuskohteluun oikeuttavaan AICD-prosessiin, joka tapahtui CD4-soluissa mutta ei CD8 T-soluissa sen jälkeen . Toinen esimerkki olisi nkg2d: n ensisijainen säätely CD8 T-soluissa, mutta ei CD4, joka antaa sivullisten indusoiman lyyttisen kyvyn voimakkaan sytokiinialtistuksen jälkeen muistin CD8-osajoukolle. Aiemmat tutkimukset meidän lab sekä tiedot esitetty Fig. 3 ovat osoittaneet, että CD4-ja CD8 T-solujen joukossa primaarisolut, jotka aktiivisesti lisääntyvät ja reagoivat siihen, ovat CD44high-muistifenotyyppi soluja . Siksi keskityimme seuraavaksi tähän väestöön.

cd44highin populaatiossa on osoitettu, että leviävät CD8 T-solut eivät pysty ylisääntelemään merkkiaineita, jotka ovat yhdenmukaisia antigeenispesifisen ärsykkeen, kuten CD25: n ja PD-1: n, aktivaation kanssa. Kääntäen CD44high, proliferating (Foxp3neg) CD4 T-solut suhteettoman paljon regulation PD-1 (toisin kuin CD8 T-solut ja foxp3+, regulatory CD4 T-solut), jonka olemme ehdottaneet mahdollistaa niiden ensisijaisesti suunnattu induktio apoptoosi . Yhdenmukaisesti näiden aiempien raporttien, havaitsimme samanlaisia fenotyyppejä pernan ja imusolmukkeissa asuvat, IT-käsitellyt CD44highCD8+ T-solut, jotka merkittävästi suurensi nkg2d mutta ei PD-1 (kuva. 4a, c) ja CD44highCD4+ T-solut, jotka voimakkaasti säätelivät PD-1: tä, mutta eivät NKG2D: tä (Kuva. 4b, d). Kun arvioimme samoja fenotyyppisiä markkereita t-solupopulaatioissa, jotka asuvat perifeerisissä, ei-lymfoidisissa elimissä, CD44highCD8+ T-solujen fenotyyppi oli huomattavasti erilainen kuin niiden, jotka asuvat sekundaarisissa lymfoidisissa elimissä. Vaikka cd44highcd8+ T-soluja asuu keuhkoihin ja maksaan olivat edelleen NKG2D + CD25neg (Kuva. 4a, c), nkg2d+ – solujen esiintymistiheys tässä populaatiossa näytti kasvavan 20-30%: sta lymfaattisissa elimissä 40-50%: iin perifeerisissä elimissä (Kuva. 4 A). Lisäksi, toisin kuin lymfoidisissa elimissä, joissa PD-1: n ilmentymä ei muuttunut, PD-1: n ilmentyminen lisääntyi merkittävästi sekä keuhkoissa että maksassa sen jälkeen CD44highCD8+ – populaatiossa (Kuva. 4c). Kääntäen CD44highCD4 T-solujen fenotyyppi oli huomattavan samanlainen pernan ja imusolmukkeiden CD4 T-solujen kanssa kaikissa elimissä (Kuva. 4B, d), jossa on vastaava PD-1: n ilmentymä ja Vähäinen nkg2d: n säätely. CD25: tä ei lisätty CD4-tai CD8 T-soluissa missään kohdassa (Tietoja ei näy). Tämä oli odottamatonta, koska olemme aiemmin esittäneet, että PD-1: n differentiaalinen ilmentymä oli todennäköisesti CD4-ja CD8 T-solujen välisen apoptoosin differentiaalisen induktion taustalla oleva mekanismi voimakkaiden, immunostimulatoristen IT-hoito-ohjelmien jälkeen. Perifeerisissä elimissä apoptoosi vaikuttaa kuitenkin edelleen suhteettomasti CD4 T-soluihin huolimatta siitä, että PD-1-ilmentymä on verrattavissa CD4-ja CD8 T-solujen välillä. Tämä syntynyt kuvio oli mielenkiintoinen myös siksi, että perifeeristen aktivaatiomarkkerien lisääntynyt ilmentymä näytti korreloivan suoraan TE/EM-hallitsevuuden kanssa, erityisesti PD-1: n tapauksessa.

äskettäin on osoitettu, että kiertävät TE/EM-solut ilmentävät kohonneita PD-1 Lepäävissä ihmisissä . Siksi oletimme, että CD8+ TE/EM-solut saattavat ensisijaisesti ilmaista näitä aktivaatiomerkkejä CD8+ TCM: ään verrattuna, mikä johtaa cd44highcd8+ T-solujen erilaiseen frekvenssiin, joka ilmentää aktivointimerkkejä sekundaarisissa lymfoidisissa ja perifeerisissä elimissä sen jälkeen. Siksi arvioimme NKG2D: n ja PD-1: n ilmentymistä CD8 + CD44highCD25neg TE/EM-ja TCM-soluissa kaikissa elimissä lepo-ja IT-käsitellyillä hiirillä. Kontrollihiirissä molemmat NKG2D (Kuva. 5a)ja PD-1 (kuva. 5c) ilmaistiin useammin CD8+CD44highCD25 – populaation TE/EM-osajoukossa. TE / EM-populaation yleisyys CD8+ T-soluissa lepäävillä hiirillä on kuitenkin suhteellisen alhainen verrattuna TCM: ään (pie charts Fig. 5a), joten kaiken PD-1: n ja NKG2D: n ilmentyminen on pääasiassa alhainen (Kuva. 4) koska TCM muodostaa suurimman osan CD8+ T-soluista levossa. Immunoterapialla hoidetuilla hiirillä sekä nkg2d: n että PD-1: n ilmentyminen lisääntyi kaikissa elimissä (Kuva. 4). Jälleen molemmat NKG2D (Kuva. 5b)ja PD-1 (kuva. 5d) ilmaistiin voimakkaammin TE / EM CD8+ T-soluissa kuin TCM CD8 + T-soluissa. Lymfoidisissa elimissä, joissa TE / EM-populaatio laajeni kontrolliin verrattuna, se oli silti huomattavasti pienempi kuin CD8+ TCM-solut (pie charts, Fig. 5B), mikä johtaa vähemmän merkittäviin laajennuksiin näissä kohteissa. Toisin kuin lymfoidisissa elimissä, CD8 + TE / EM-solut muodostivat suurimman osan määritetyistä perifeerisistä elimistä (pie charts, Fig. 5b), mikä tekee nkg2d: n ja PD-1: n kokonaisilmaisusta huomattavasti korkeamman näillä alueilla. Jälleen on tärkeää huomata, että imukudoksen elinten immunoterapia saaneilla hiirillä, yleinen ilme, sekä aktivointi-markkereita oli huomattavasti pienempi kuin reuna-elinten johtuu TCM vinouttaa vuonna lymphatics yli reuna in CD8 väestöstä. Ekspressiotasot eivät vaihdelleet suuresti eri elinten TE/EM: n välillä (lymfoidisten ja perifeeristen elinten välillä ei ollut merkittäviä eroja) samojen hoitoryhmien sisällä, mutta yleensä ne kasvoivat it-hoidetuissa verrattuna kontrolliin, suuntaus, joka oli merkittävämpi nkg2d: llä kuin PD-1: llä (Kuva. 5). Sen sijaan TCM: n aktivaatiomarkkeriilmaisu pysyi suhteellisen vakiona ei ainoastaan hiirten elimissä hoitoryhmässä, vaan myös kontrolliryhmien ja IT: llä hoidettujen ryhmien välillä (Kuva. 5a-b). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että muisti/aktivoitu pooli (TCM vs TE/EM) vaikuttaa voimakkaasti aktivoidun t-solupopulaation fenotyyppiin, erityisesti CD8 T-soluissa, koska niiden rakenne vaihtelee suuresti lymfaattisen ja ei-lymfaattisen elimen välillä.

T-solujen arviointi potilailla, jotka saavat suuria annoksia systeemistä immunostimulatorista hoitoa

seuraavaksi halusimme arvioida, kääntyvätkö nämä tulokset ihmispotilaille, jotka saavat immunostimulatorisia hoitoja syöpään. Tällä hetkellä ei ole tutkimuksia, joissa arvioitaisiin yhdistelmäagonistista anti-CD40: tä rekombinantin ihmisen IL-2: n kanssa, mutta olemme rutiininomaisesti verranneet yhdistelmähoitoamme muihin systeemisiin immunostimulatorisiin hoitoihin, mukaan lukien suuret TLR-agonistit ja suuret systeemiset sytokiinihoidot, ja olemme osoittaneet samanlaisia fenotyyppisiä ja toiminnallisia muutoksia T-soluissa kuin prekliinisessä mallissamme . Arvioidaksemme, oliko klinikan potilailla samanlaisia muutoksia pintamarkkeriilmaisussa, keräsimme perifeerisen veren mononukleaarisoluja (pbmc) metastasoituneilta melanoomapotilailta, jotka saivat systeemisen suuriannoksisen IL-2-hoidon. Potilaat saivat 6×10^5 IU / Kg joka 8. tunti suunnitellun 14 annoksen verran. PBMC-näytteet otettiin päivää ennen hoidon aloittamista (lähtötilanne) tai ensimmäisen hoitosyklin 8.päivänä (8. päivä) T-solujen fenotyypin määrittämiseksi. Kun verrattiin lähtötilanteen ja päivän 8 näytteitä, PD-1+-muistin fenotyypin (CD45RO+) solujen määrä lisääntyi merkittävästi sekä CD4-että CD8 T-solujen alajoukoissa suuren IL-2-annoksen jälkeen (kuva. 6a-c). Kun tämä populaatio jaettiin edelleen keskusmuistiin (CD62L+) ja efektori/efektorimuistiin (CD62L-) päivän 8 aikapisteessä, efektori/efektorimuistin osajoukko ilmaisi huomattavasti suuremman PD-1-ilmentymän kuin keskusmuistin osajoukko (Kuva. 6d-e). Yhdessä nämä tiedot korreloivat sen kanssa, mitä havaittiin hiirillä tehdyissä tutkimuksissa, mikä viittaa siihen, että näitä tietoja voidaan soveltaa ihmisillä tehtyihin tutkimuksiin ja että ne voivat olla osoituksena siitä, mitä paikallisesti tapahtuu.