yhdisteitä
ALDH1A1-estäjiä, on äskettäin kuvattu 30. LDHA-inhibiittoreita on kuvattu aiemmin tutkimuksessa Rai et al.29. IDH1-inhibiittoreita on kuvattu aiemmin Urban et al. ja Davis ym.24,36. Muita tutkimuksessa käytettyjä yhdisteitä olivat metotreksaatti (MedChem Express, hy-14519), Panobinostaatti (Selleck Chem, S1030), AG-221 (MedChem Express HY-18690), Isofagomiini (Toronto Research Chemicals #I816010), Lumacaftor (BioVision #2857) ja LY2857785 (Medchem Express, HY12293). QHTS:ää varten testattiin mekanismin kuulustelulevyssä (mipe) olevia yhdisteitä 11 pisteessä (intraplate, 1: 3 laimennuskerroin). Kinaasi-inhibiittorikokoelma, joka sisälsi 977 kinaasi-inhibiittoria, testattiin 7-pisteannoksilla (interplate, 1:5 laimennuskerroin). Kaikissa tapauksissa ajoneuvona käytettiin DMSO: ta.
Kloonaus
pcDNA3.1-based vectors were created for N- and C-terminal tagging by linearizing pcDNA3.1(+) with NheI and EcoRI and inserting the peptide tag using an oligonucleotide duplex and In-Fusion reagents (Clontech). For the C-terminal tag, the duplex was: Sense: 5′-ACCCAAGCTGGCTAGCAACTAACGGATCCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGCAGCTAA GGCGCGCCGAATTCTGCAGATAT-3′ and Antisense: 5′- ATATCTGCAGAATTCGGCGCGCCTTAGCTGCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGGATCCgttagttGCTAGCCAGCTTGGGT-3′. Notably, the first amino acids of the peptide tag (Gly-Ser) were encoded using GGATCC, which is a BamHI site and facilitated downstream cloning steps. For the N-terminal fusion tag, the duplex was Sense: 5′-ACCCAAGCTGGCTAGCCACCATGGGCAGCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGATCCAACTAACAATAGCGTTATCGAATTCTGCAGATATC-3′ and Antisense: 5′- GATATCTGCAGAATTCGATAACGCTATTGTTAGTTGGATCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGCTGCCCATGGTGGCTAGCCAGCTTGGGT-3′. In this case, a BamHI site encodes the final two amino acids of the peptide tag. Kiinnostavien geenien avoimet Lukukehykset (ORF) kloonattiin acceptorin selkäruotoihin käyttäen bamhi/EcoRI (N-terminaali)-tai NHEI/BamHI (C-terminaali) – alueita vahvistamalla KOODAUSALUETTA infuusioon soveltuvilla oligonukleotideilla, jotka on määritelty yksityiskohtaisesti Lisätaulukossa S1. IDH1 -, LDHA -, DHFR -, GC-ja ALDH1A1-konstruktiot valmistettiin GeneArt-Geenisynteesillä (Termofisher) pcdna3.1: ssä (+). Gateway-kloonausta varten (vain IDH2-konstruktiot) luotiin 86b-tunnisteen sisältävä kohdevektori korvaamalla v5-tunniste pcDNA3.2-V5/DESTISSÄ. The plasmid was digested with PmeI and SacII and an oligo duplex inserted by InFusion. The oligo was: Sense: 5′- TGATCTAGAGGGCCCGCGGGGCAGCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGCAGCTAAGTTTAAACGGGGGAGGCTA-3′ and Antisense: TAGCCTCCCCCGTTTAAACTTAGCTGCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGCTGCCCCGCGGGCCCTCTAGATCA-3′. The Gateway strategy leaves an additional C-terminal ’scar’ after the final amino acid of the ORF, which encodes ”LPTFLYKVVDLEGPR” prior to the 86b tag.
soluviljelmä
HEK293T, Ln18, OV-90, HeLa, 22rv1, MDA-MB-468 ja HT-29-soluja saatiin ATCC: stä (CRL-1573, CRL-2610, CRL-11732, CCL2, CRL-2505, HTB-132 ja HTB-38). HuCC-T1 ja CC-LP-1 olivat eräänlainen lahja tohtori N. Bardeesylle (Massachusetts General Hospital, Boston). HEK293T-soluja viljeltiin dmem: ssä (4,5 g/L glukoosia), jossa oli 10% sikiön naudan seerumia (FBS), 6 mM L-glutamiinia, 1 mM natriumpyruvaattia, 50 U/mL penisilliiniä ja 50 µg/mL streptomysiiniä. Edellä mainitussa väliaineessa viljeltiin ln18 -, HT-29 -, CC-LP-1-ja HeLa-soluja ilman natriumpyruvaattia. OV-90-soluja viljeltiin 1: 1-seoksessa MCDB 105-väliainetta (Cell Applications Inc.) ja m199-medium (Hykloni, GE), täydennettynä 15% FBS: llä, 1% penisilliini-streptomysiinillä (Life Technologies) ja lopullinen pitoisuus 1,85 g/L natriumbikarbonaatilla (Hykloni, GE). 22rv1 -, HuCC-T1-ja MDA-MB-468-soluja kasvatettiin rpmi 1640: ssä täydennettynä 10% FBS: llä, 6 mM L-glutamiinilla, 100 yksikköä/mL penisilliinillä, 100 µg/mL streptomysiinillä. Kaikki solut kasvatettiin 37 °C: n lämpötilassa kostutetussa inkubaattorissa, jonka CO2-pitoisuus oli 5%, ja mykoplasma testattiin negatiivisena Mycoalert detection kit (Lonza) – testillä.
Rekombinanttiproteiinin ja peptidin tuotanto ja puhdistus
11s-ja 86b-proteiineja tuotettiin GenScript-menetelmällä. Rekombinantti 11S-fragmentin koodaava DNA-sekvenssi fuusioitiin 6x His-tunnisteeseen puhdistuksen helpottamiseksi ja sekvenssi subklonoitiin E. coli-ilmentymävektoriksi. BL21-tähtisolut (DE3) muunnettiin rekombinanteilla plasmideilla ja yksi pesäke inokuloitiin IPTG: tä sisältävään lb-väliaineeseen proteiinin ilmentymisen induktioksi. SDS-PAGE-ja Western blot-analyysiä käytettiin ilmaisun seuraamiseen ja optimaalisen sadonkorjuuajankohdan valintaan. Soluja kerättiin sentrifugoimalla ja pellettejä hajotettiin sonikoimalla. His-tagin puhdistuksen jälkeen fraktiot steriloitiin 0,22 µm: n suodattimen läpi. Proteiinit analysoitiin SDS-PAGE ja Western blot käyttäen standardiprotokollia ja hiiri-anti-His mAb (Genscript, Cat.No.A00186). puhdistetun proteiinin pitoisuus määritettiin Bradfordin proteiinimäärityksellä, jossa BSA on standardi. Proteiini varastoitui 1x PBS: ään, 10% glyseroliin, pH 7,4, ja puhtaus oli noin 90%, kuten Coomassien siniseksi värjätyn SDS-PAGE-geelin tiheysmittaus arvioi pelkistävissä olosuhteissa. 15 aminohappo 86b-peptidi varastoitiin ultrapure dH2O: hon ja se oli 99,9% puhdasta HPLC: llä.
Pienikapasiteettiset (96-kuoppaiset PCR-levyt tai-nauhat) cetsa-komplementaatiomääritys
– solut transfektoitiin 6-kuoppaisiin astioihin käänteissiirtomenetelmällä, jossa 1, 25 ml komplekseja (6, 25 µL Lipofektamiinia 2000 ja 3 µg DNA: ta kuoppaa kohti) yhdistettiin 1, 25 ml: aan HEK293T-solususpensiota (1 × 106 / mL, yhteensä 1, 25 × 106 solua). CDK9: lle käytettiin 2 µg DNA: ta kaivoa kohti. 24 tunnin kuluttua (CDK9: n osalta 48 tuntia) solut kerättiin trypsiinisoimalla ja suspendoitiin uudelleen 1 × 106 solua/mL (ellei toisin mainita) cetsa-puskurissa, joka sisälsi DPBS: ää (CaCl2: lla ja MgCl2: lla) sekä 1 g/L glukoosia, 1X Halt-proteaasinestäjäcocktailia (Lämpökalastaja) ja 0, 5% DMSO: ta (DMSO: ta ei lisätty kokeissa, joissa yhdistettä ja kantaja-ainetta käsiteltiin myöhemmin). Lämpötilan vaihteluvälikokeissa (ilman yhdistettä tai kerta-annosta) näytteet alikiintosoitiin PCR-nauhoihin 30 µL putkea kohti. Yhdistettä lisättiin ja soluja inkuboitiin 37 °C: ssa 1 tunnin ajan. tämän jälkeen näytteitä kuumennettiin 3.5 min käyttäen esilämmitettyä lämpösykliä, jonka annettiin tasapainottua huoneenlämpötilaan, ja kuhunkin kaivoon lisättiin 6 µL 6% NP40: tä. Kylmäsulatuskokeita varten putket asetettiin alumiiniseen PCR-lohkoon kuivajää/etanolikylpyyn 3 minuutin ajaksi, minkä jälkeen niitä inkuboitiin 37 °C: ssa 3 minuutin ajan, pyörrettiin 3 sekunnin ajan ja toistettiin nämä vaiheet vielä kolme kertaa. 11S (GenScript) ja furimatsiinisubstraatti (Nano-Glo-Luciferaasimääritysjärjestelmästä, Promega) lisättiin, lopullisina pitoisuuksina 100 nM ja 0.5x, vastaavasti, ja näytteet analysoitiin luminesenssin voimakkuutta käyttäen ViewLux suuritehoinen CCD imager (Perkin Elmer) varustettu kirkkailla suodattimilla.
384-kuoppa cetsa-määrityksessä
soluja transfektoitiin T75-pulloissa käänteissiirtomenetelmällä, jossa 9 mL komplekseja (45 µL Lipofektamiinia 2000 ja 22, 5 µg DNA: ta) yhdistettiin 10 mL: aan HEK293T-solususpensiota (1 × 106 solua / mL, yhteensä 10 miljoonaa solua). 24 tunnin kuluttua solut kerättiin trypsiinisoimalla, suspendoitiin uudelleen arvoon 1 × 106 solua/ml edellä kuvatulla tavalla ja jaettiin (15 µL solua/kuoppa) 384 kuopan PCR-levyille (Roche) Multidrop-kombin (Lämpökalastaja) avulla. Yhdisteet (63 nL) tai DMSO-ajoneuvonohjaus (63 nl) kiinnitettiin tämän jälkeen nastatyökalulla (GNF) ja inkuboitiin 1 tunnin ajan 37 °C: ssa.levyt sinetöitiin ja kuumennettiin ilmoitetussa lämpötilassa 3,5 minuutin ajan ja jäähdytettiin 25 °C: seen AB qPCR-koneella (Roche) käyttäen lämmitysvaiheen ramppinopeutta 1,5 °c/s ja jäähdytysvaiheen ramppinopeutta maksimissaan. Kuoppaan lisättiin kolme µL, 6% NP40: tä, ja sitä inkuboitiin 30 minuutin ajan, jotta solujen hajoaminen olisi mahdollista, minkä jälkeen lisättiin 11S ja furimatsiinisubstraatti (lopullisina pitoisuuksina 100 nM ja 0, 5 X). Näytteet analysoitiin luminesenssin voimakkuudeksi ViewLux-lukulaitteella.
1 536-kuopan CETSA-määritys
solut transfektoitiin ja korjattiin edellä kuvatulla tavalla (384-kuoppaprotokolla). Solut annosteltiin (5 µL solua/kuoppa) 1 536 kuopan valkoisiin levyihin (Aurora, syklinen olefiinipolymeeri, cat# EWB041000A) Multidrop-yhdistelmällä. Yhdisteet (23 nL) puristettiin tämän jälkeen tappityökalulla (Wako-automaatio) ja inkuboitiin 1 tunnin ajan 37 °C: ssa.levyt kuumennettiin ilmoitetussa lämpötilassa ja ajassa kuumennuselementtiä käyttäen (KS. alla) ja jäähdytettiin 25 °C: seen. kaivoon lisättiin yksi µL, 6% NP40, ja levyjä inkuboitiin 30 minuutin ajan, jotta solujen hajoaminen olisi mahdollista, minkä jälkeen lisättiin 3 µL 11s (lopullinen pitoisuus 100 nM) ja furimatsiinisubstraatti. Levyt sentrifugoitiin ja analysoitiin luminesenssin voimakkuudeksi ViewLux-lukulaitteella. LDHA-ja CDK9-näytöille lopullinen pitoisuus on 0,5 X ja 0.Furimatsiinia käytettiin vastaavasti 25 kertaa. Normalisointiohjaimet sisältävät DMSO-ja GSK2837808A-käsiteltyjä näytteitä tai lämmittämättömiä näytteitä LDHA: lle ja CDK9: lle. CDK9-vastanäyttö suoritettiin edellä esitetyllä tavalla seuraavin eroin: 5 µL siirtämättömiä HEK293T-soluja (1 × 106/mL cetsa-puskurissa) annosteltiin 1 536-kuoppalevyille, joita seurasi yhdisteen lisäys, 37 °C: n inkubaatio -, kuumentamis-ja lyysivaiheet kuten edellä. Tämän jälkeen kaivoihin lisättiin 500 pM (lopullinen) 86b: tä, minkä jälkeen lisättiin 100 nM 11s ja 0,25 X furimatsiinisubstraatti (lopullinen).
1 536-kuoppalevyn lämmitykseen tarkoitettu alumiinilohko suunniteltiin mittaamalla levy, jonka avulla määritettiin X-ja Y-kirjaimen muotoisten vahvistuskylkien reunustaman alueen mitat, sekä pohjakaivon ja alalaipan pinta-ala Z. sitten muovattiin 6061 T6-alumiinilevystä työstettävä lohko, joka olisi vapaasti sovitettavissa noin 0,5 mm: n maavaralla levylle kaikissa akseleissa. Lohkoa työstettiin käsin tehdyllä pystyjyrsimellä, päätymyllyillä ja pintamyllyllä. Uunilämmityskokeita varten levyt sijoitettiin konvektiolaboratorion uunin keskimmäiseen telineeseen (Lämpökalastaja) ja peitettiin metallikansilla haihtumisen minimoimiseksi.
cetsa solulysaateissa
solut kerättiin cetsa-puskuriin 1, 0 × 106 solua / mL (edellä kuvatulla tavalla) ja np40 lisättiin lopulliseen pitoisuuteen 0, 4%. Kun näytteitä oli pyöritetty päätypäin 30 minuutin ajan (huoneenlämpötilassa), lysaatit kirkastettiin sentrifugoimalla lämpötilassa 20 000 × g 10 minuutin (4 oC) ajan. Selkeytettyyn lysaattiin lisättiin kofaktori (esim. NAD+). Lämpötila-vastekokeita varten 25 µL lysaattia siirrettiin PCR-putkiin ja kuumennettiin 3,5 minuutin ajan eri lämpötiloihin. Isotermisissä annos-vastekokeissa 5 µL kirkastettua lysaattia annosteltiin 1536-kaivolevyille BioRAPTR FRD-työasemalla ja näytteitä kuumennettiin alumiinilohkolla. Näytteiden annettiin tasapainottua huoneenlämpötilaan ja substraattia lisättiin (lopullinen pitoisuus: 100 nM 11s, 0, 5 X furimatsiini). Luminesenssi kuvattiin ViewLux-kuvaajalla edellä kuvatulla tavalla.
Western blots
näytteet käsiteltiin alhaisen läpimenokyvyn komplementaatiokoejaksossa kuvatulla tavalla käyttäen liukenemissyklejä. Lysaatteja sentrifugoitiin 15 200 × g: n lämpötilassa 20 minuutin ajan 4 °C: n lämpötilassa.näytteet käytettiin 4-12-prosenttisella bis-Tris NuPAGE-geelillä (Lämpökalastaja) käyttäen MOPS-puskuria ja siirrettiin PVDF-kalvoon iblot 2-siirtojärjestelmällä 25 V: n nopeudella 7 minuutin ajan. Kalvot tukittiin 5-prosenttisella maitoliuoksella (50 mM Tris HCl, pH6; 150 mM NaCl; 0, 1% Tween-20) ja primaarisia vasta-aineita inkuboitiin yön yli 4 °C: ssa estoliuoksessa. Vasta-aineet olivat: anti-IDH1 (, solun signalointi #8137, 1:500), anti-IDH1 (R132H) (Millipore #MABC171, 1:500), anti-LDHA (, solun signalointi #3582, 1:1000). Anti-kani / hiiri-HRP (kani = Cell Signaling 7074; hiiri = Cell Signaling # 7076) lisättiin 1:2500 ja inkuboitiin 1 tunti huoneenlämmössä. Kemiluminesenssisignaali syntyi Supersignal west dura solutionilla (Lämpökalastaja) ja kaapattiin Biorad Chemidoc-järjestelmällä. Densitometrinen analyysi tehtiin Photoshop-ohjelmiston (Adobe) avulla.
2-HG-määritys
HEK293T-solut käänteissiirtyivät 24 kuoppavuokaan lisäämällä 2.5 × 105 solua transfektiokomplekseihin (0, 75 µg plasmidin DNA: ta, 1, 5 µL Lipofektamiinia 2000 per kuoppa). Soluviljelyaine kerättiin 72 tunnin kuluttua ja 15 µL siirrettiin 384-kuoppaiseen läpinäkymättömään levyyn. Kuhunkin kuoppaan lisättiin 1, 5 µL 660 mM HCl: ää, ja näytteitä inkuboitiin huoneenlämmössä 10 minuutin ajan. Kuhunkin kuoppaan lisättiin 1, 5 µL 720 mM Tris-HCl-emästä. Sitten 52 µL 2-HG-detektioliuosta (100 mm HEPES (pH 8, 0), 100 µM NAD+, 1 µg/mL aktiivista rekombinantti D-2-Hydroksiglutaraattidehydrogenaasia (D2HGDH; Biovision, Cat: P1001), 5 µM resatsuriinia, 0, 03 mg/mL diaforaasia (Sigma, Cat: D5540) lisättiin ja levy inkuboitiin huoneenlämmössä. 2 HG: n standardikäyrä laadittiin 100 mM: n HEPESISSÄ (pH 8,0). Fluoresenssi mitattiin ViewLux-lukulaitteella käyttäen Ex: 525, Em: 598/25-suodattimia.
biokemialliset määritykset
LDHA-biokemiallinen määritys suoritettiin edellä kuvatulla tavalla 29. Lyhyesti 3 µL ihmisen laktaattidehydrogenaasi 5: tä (2 nM lopullinen) (no. A38558H, Meridian Life Science, Inc.) LDH-määrityspuskurissa (200 mM Tris HCl, pH 7, 4, 100 µM EDTA ja 0, 01% Tween-20) lisättiin mustalle kiinteäpohjaiselle 1536-kaivon määrityslevylle (Greiner Bio-One). Yhdisteen tappinsiirron (23 nL) jälkeen annosteltiin 1 µL substraattiliuosta, joka sisälsi NADH: ta (0,06 mM lopullinen) ja natriumpyruvaattia (0,2 mM lopullinen) (Sigma-Aldrich) LDH-määrityspuskurissa reaktion käynnistämiseksi. 5 minuutin huoneenlämmössä tapahtuneen inkubaation jälkeen kuhunkin kaivoon lisättiin 1 µL ilmaisureagenssia. Levyt siirrettiin välittömästi Näkymälukijaan ja resorufiinifluoresenssi mitattiin (ex 540 nm, em 590 nm) 0 ja 10 minuutin kohdalla. Fluoresenssi normalisoitiin käyttämällä entsyymittömiä ja DMSO-käsiteltyjä kontrollikaivoja kullakin levyllä.
aldh1a1-biokemiallinen määritys,jossa käytettiin puhdistamatonta proteiinia, tehtiin edellä kuvatulla tavalla 31, 37. Lyhyesti 3 µL 20 nM: n puhdistettua ihmisen ALDH1A1: tä testipuskurissa (100 mM HEPES pH 7,5 ja 0,01% Tween 20) annosteltiin 1,536-kuoppaan kiinteäpohjaiselle mustalle levylle (Greiner Bio One). Kaksikymmentäkolme nl yhdisteitä tai control Bay 11-7085 siirrettiin pin työkalu (Wako Automation). Näytteitä inkuboitiin (huoneenlämmössä valolta suojattuna) 15 minuutin ajan, minkä jälkeen substraattiin lisättiin 1 µL NAD + – ja Propionaldehydiä (lopulliset pitoisuudet 1 mM ja 80 µM). Levyt sentrifugoitiin ja luettiin kineettisessä tilassa ViewLux-kuvaajalla, joka oli varustettu 340 nm: n magnetoinnilla, 450 nm: n emissiosuodattimilla 5 minuutin ajan. Fluoresenssin intensiteetin muutos 5 minuutin aikana normalisoitiin käyttämällä entsyymittömiä ja DMSO-käsiteltyjä kontrollikuoppia kullakin levyllä.
CDK9 / sykliini K: n TR-FRET Lanthascreen Eu-Kinaasisitomismääritys ostettiin Lämpökalastajalta ja suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, 4 µL Kantaliuosta, joka sisältää 4 nM CDK9/sykliini K (Invitrogen #PV4335), 2 nM biotiini Anti-His Ab, 2 nM Eu-streptavidiini ja 10 nM kinaasi Tracer 236-liuosta 1x Kinaasipuskurissa, annosteltiin Greiner 1,536-hyvin valkoisiin väliaineen sidoslevyihin BioRAPTR FRD-työasemalla. 23 nL yhdistettä ja kontrolleja (DMSO ja LY2857785 lopullisena pitoisuutena 6 µM) toimitettiin välittömästi määrityslevyille tapin välityksen avulla. Levyjen annettiin inkuboitua 1 tunnin ajan huoneenlämmössä, ja TR-FRET fluoresenssi mitattiin PerkinElmer EnVision Multilabel-levylukijalla (esim.317/20; Em 1: 620/12; Em 2: 665/12; Lag-aika 100 µs; Integrointiaika 200 µs).
Laktaattituotantomääritys
hek293t-soluja viljeltiin edellä kuvatulla tavalla. Solut huuhdeltiin PBS: llä, trypsinoitiin ja suspendoitiin uudelleen fenolipunaisella vapaalla Dmem: llä (Life Technologies) ilman lisäravinteita. Solut pinnoitettiin välittömästi 1536-kuoppaan mustiksi kirkkaiksi pohjalevyiksi (Corning) 250 solua kuoppaa kohti 4 µL: n tilavuudessa. Kuoppiin lisättiin yhdistettä tai kantaja-ainetta nuppineulan siirron avulla ja soluja inkuboitiin 37 °C: ssa 1 tunnin ajan. kuhunkin kuoppaan lisättiin kaksi µL laktaattireaktioseosta (Biovision K607-100) ja levyt peitettiin ja inkuboitiin huoneenlämmössä 30 minuutin ajan. Fluoresenssi mitattiin ViewLux-mikrotiitterillä, joka oli varustettu Ex/Em 528/598 nm suodattimilla.
Aldefluorimääritys
86b-merkityn ALDH1A1-aktiivisuuden alustavaa määritystä varten solut transfektoitiin käänteisellä transfektiomenetelmällä, jossa 1 mL komplekseja (6 µL Lipofektamiinia 2000 ja 3 µg DNA: ta) yhdistettiin 1 mL: aan ln18-solususpensiota (5 × 105/mL) ja 100 µL / kuoppa annosteltiin mustille, kirkkaanpohjaisille 96-kuoppalevyille (Corning). 24 tunnin kuluttua väliaine poistettiin ja korvattiin Aldefluoripuskurilla 100 µL/kaivo (STEMCELL Technologies), joka sisältää BAAA-substraattia ja Hoechst 33342: ta (Lämpökalastaja, lopulliset pitoisuudet 500 nM ja 0,5 nM). Tämän jälkeen lisättiin ajoneuvo DMSO tai DEAB (1 µM lopullinen), ja levyjä inkuboitiin 30 minuutin ajan 37 °C: n lämpötilassa, jotta BAATA voidaan muuttaa BAA: ksi. Solut pestiin ja Aldefluoripuskuria annosteltiin 100 µL/kuoppa ennen kuvantamista in-solussa 2200 (GE Healthcare). Suuritehoisissa määrityksissä ln18-soluja transfektoitiin T75-pulloissa käyttäen edellä kuvattua käänteissiirtomenetelmää suuritehoisissa HEK293T cetsa-määrityksissä. 16 tunnin kuluttua solut kerättiin talteen ja pinnoitettiin (1 000 solua/kuoppa/5 µL) mustaksi optisesti laadukkaaksi kirkkaaksi pohjaksi, TC käsiteltiin 1 536 kuoppalevyllä (Aurora-mikromuovit) Monidro-Yhdistelmäannostelijalla ja inkuboitiin yön yli 37 °C: ssa.korkeapitoinen Aldefluorimääritys tehtiin tämän jälkeen transfektoiduille ln18-soluille tai transfektoimattomille OV-90-soluille, kuten edellä kuvattiin 31. Kuvat analysoitiin IN Cell Investigator v1. 6.2-analysointiohjelmiston canned Multi-Target Analysis algorithm (GE Healthcare) – algoritmilla kuvatulla tavalla.
kalvojen terminen eheysmääritys
30 000 HEK293T-solua valmistettiin 30 µL: ssa CETSA-puskuria, joka sisälsi 1x proteaasinestäjäcocktailia (Lämpökalastaja) täydennettynä 0, 5% DMSO: lla (yhteensä 1, 5% DMSO). DMSO-toleranssikoetta varten DMSO lisättiin DPBS: ään 0, 1, 2 tai 3%. Kennosuspensioita kuumennettiin 3,5 minuutin ajan 42-74 °C: n lämpötilassa 4 asteen välein, minkä jälkeen ne poistettiin alumiinilohkoksi märällä jäällä. Solususpensiot sekoitettiin yhtä suureen osaan Trypansinistä (LONZA) (=0,2% trypansinistä) ja laskettiin välittömästi c-siruisen hemosytometrin avulla (iNCyto, Korea). Trypaani positiivinen (permeabiloitu) ja negatiivinen (ehjä) laskettiin siten, että N = 2 kussakin lämpötilassa. Muita solulinjoja varten valmistettiin miljoona solua 100 µL: ssa fenolipunaista vapaata dmem: tä, joka sisälsi 1% DMSO: ta. Kennoja lämmitettiin 3 min 42-90 °C: n lämpötilassa 4 asteen välein, minkä jälkeen ne poistettiin alumiinilohkoksi märällä jäällä. Kalvojen eheys arvioitiin edellä kuvatulla tavalla.
PAMPA
Pion Inc: n patentoima sekoituskaksoisallas PAMPA-menetelmä. (Billerica, MA) käytettiin mittaamaan yhdisteen läpäisevyyttä edellä kuvatulla tavalla 38. Yhdisteet laimennettiin donor-ja acceptor-liuoksilla, jotka puskuroitiin PH7, 4: ään ja DMSO-pitoisuus oli 0, 5%. Läpäisevyyslaskelmat tehtiin käyttäen Pion Inc. ohjelmisto.
qHTS-analyysi
kustakin määrityksestä saadut tiedot normalisoitiin levypohjaisesti vastaaviin kontrolleihin edellisen kuvauksen mukaan39. Samoja kontrolleja käytettiin myös Z-kertoimen laskemiseen kullekin määritykselle. Prosenttiaktiivisuus johdettiin omien ohjelmistojen avulla (http://tripod.nih.gov/curvefit/). Kaikki pitoisuus-vastekäyrät asennettiin ja AC50 laskettiin GraphPad Prism-ohjelmistolla; käyrät luokiteltiin edellä kuvatulla tavalla 27. Käyrän alle jäävä pinta-ala (AUC) laskettiin puolisuunnikkaan säännön avulla vastekäyrän ja X-akselin välisen pinta-alan likiarvoksi pitoisuusalueella. Kaikille yhdisteille käytettiin kokeessa vastaavia pitoisuusalueita. Aktiivisten yhdisteiden luokittelussa käytettiin tehon raja-arvoa 3 σ (kantaja-ainekontrollin keskiarvosta).
