sieni-isäntä

Filamenttisienet voivat toimia isäntinä mikrobi-karmiinihapposolutehtaalle, koska niillä on kyky toimittaa runsaasti asetyyli-CoA: ta ja malonyyli-CoA: ta rakennuspalikoita polyketidin synteesiä varten rakennustelineet. Ne tarjoavat myös tarvittavan solurakenteen er kalvoon sitoutuneen C-glukosyylitransferaasin UGT28 mukautumiseksi. Koska A. nidulansilla on hyvin kehittynyt geenitekniikan työkalupakki, valitsimme tämän lajin lähtökohdaksi sienikarmiinihapposolutehtaan kehittämiselle. Kuten useimmat rihmasienet, A. nidulans pystyy tuottamaan lukuisia biosynteettisesti erilaisia sekundaarisia aineenvaihduntatuotteita, mukaan lukien merkittävän määrän aromaattisia polyketidejä. Chiang ym. ovat aiemmin osoittaneet, että A. nidulans11: n tärkeimpien endogeenisten PKS-tuotteiden muodostuksesta vastuussa olevien geeniklusterien poistaminen paransi A. nidulansin mahdollisuuksia solutehtaana polyketidien heterologisessa tuotannossa. Tällä tavoin asetyyli-CoA: n ja malonyyli-CoA: n rakenneosien altaat lisääntyvät ja myöhemmät kemialliset analyysit uusien tuotteiden muodostamiseksi yksinkertaistuvat. Ensimmäisenä askeleena kohti karmiinihapon tuotantoon tarkoitettua sienisolutehdasta eliminoimme näin ollen hallitsevien aromaattisten polyketidien biosynteettiset reitit, jotka voisivat mahdollisesti häiritä karmiinihapon tuotantoa ja vaikeuttaa analyysiä ja jatkojalostuspuhdistusta. Erityisesti asperthesiinin, monodiktyfenonin ja sterigmatokystiinin tuotantoon tarkoitetut geeniklusterit eliminoitiin sekä vihreän conidia-pigmentin muodostuksesta vastaavat geenit wA ja yA eliminoitiin ei-homologisessa endjoining defficient A. nidulans-taustassa. Kartiopigmenttien odotetun puuttumisen lisäksi tuloksena syntyneellä kannalla, NID2252: lla, ei ollut näkyviä vaikutuksia morfologiaan ja sopivuuteen (täydentävä tiedosto, Fig. 1). Siksi käytimme nid2252: ta vertailukantana ja karmiinihapon tuotantoon tarkoitetun sienisolutehtaan rakentamisen perustana.

puoliluonnollisen reitin suunnittelu flavokermesiinihapon antronin muodostumiselle

mikrobisen karmiinihapposolutehtaan rakentamisen suurin este oli luonnollisen PKS: n puuttuminen, joka syntetisoi flavokermesiinihapon antronin, reitin ensimmäisen oletetun välituotteen. Tämän rajoituksen ohittamiseksi jatkoimme vaihtoehtoista biosynteettistä reittiä tämän polyketidin tuottamiseksi. Oktaketidin flavokermesiinihappoantroni, jossa on C7-C12, C5-C14 ja C2-C15-syklisaatiokuvio, voitaisiin teoriassa muodostaa yhdessä vaiheessa sieni-pelkistämättömällä tyypin I iteratiivisella PKS: llä, jolla on sopiva tuotepohjakoodi (Fig. 1 Vasen). Tällaisia entsyymejä ei kuitenkaan ole vielä kuvattu kirjallisuudessa. Vaihtoehtoinen mekanismi flavokermesiinihapon antronin muodostamiseksi on kaksivaiheinen reaktio, jossa PKS syntetisoi pelkistämättömän lineaarisen oktaketidiketjun, joka tämän jälkeen syklisoituu haluttuun rakenteeseen transvaikutteisten syklaasien/aromataasien avulla (Fig. 1 oikein). Tämäntyyppisiä reaktioita esiintyy luonnossa esimerkiksi Streptomyces coelicolor12-bakteerin aktinorhodin (Act) – reitillä. Tällöin oktaketidin selkärankaa syntetisoidaan monialayksiköllä tyypin II PKS-järjestelmällä, KSa, KSß ja ACP (act minimal PKS), joka pelkistetään actKR: llä asemassa C9 ja sen jälkeen taitetaan aromataasi/syklaasi, actARO/SYC ja syklaasi actCYC2, jolloin saadaan trisyklinen yhdiste 3,8-dihydroksi-1-metyyliantrakinoni-2-karboksyylihappo (dmac)7. DMAC näyttää saman kertaisen kuin flavokermesiinihappo-antroni, mutta pelkistyy C9-asennossa.

tässä tutkimuksessa erityisen kiinnostavia ovat Streptomyces sp: n ZhuI-syklaasi ja ZhuJ-aromataasi. R1128, joka katalysoi kahta peräkkäistä pelkistämättömien lineaaristen polyketidien syklisointireaktiota laskoksiksi, jotka ovat samanlaisia kuin flavokermesiinihapolla an throne13. Erityisesti ZhuI-syklaasi vastaa ensimmäisen renkaan, C7-C12: n, sulkemisesta ja ZhuJ-aromataasi toisen renkaan, C5-C14: n sulkemisesta. Kolmas rengas, C2-C15, muodostuu spontaanisti. ZhuI ja ZhuJ on aiemmin yhteisilmoitettu S. coelicolor, jossa tyypin II oktaketidi muodostaa minimaalisen PKS: n, mikä johtaa 3,6,8-trihydroksi-1-metyyliantrakinoni-2-karboksyylihapon (tmac) muodostumiseen bakteerien literature14: ssä. Valitettavasti samanlaista strategiaa voi olla vaikea toteuttaa A. nidulansilla, koska tyypin II minimaalista PKSs: ää ei ole onnistuttu toteuttamaan Heterologisissa isännissä Streptomyces-suvun ulkopuolella useista yrityksistä huolimatta.15 Yrityksemme valmistaa act miniPKS A. nidulansissa ja Saccharomyces cerevisiaessa osoittautuivat samoin epäonnistuneiksi (tietoja ei näy). Vaihtoehtoinen tapa muodostaa tarvittava pelkistämätön oktaketidi on tukeutua tyypin III PKS-entsyymeihin, jotka on onnistuneesti ilmaistu hiivassa esimerkiksi flavonoidibiosynteesin16 yhteydessä. Erityisen kiinnostava on Aloe arborescens oktaketidisyntaasi (OKS), jonka on kuvattu tuottavan pelkistämättömiä oktaketideja, jotka spontaanisti taittuvat VITRO17: ssä SEK4: ksi ja SEK4b: ksi (kuva. 2 a). Aspergilluksessa ei kuitenkaan ole tutkittu, voidaanko tyypin III PKSs tuotteet, jotka ovat aktista riippumattomia entsyymejä, jotka vapauttavat karboksyylihappoja, taittaa ZhuI-tyyppisellä syklaasilla, jonka on kuvattu vaikuttavan AKT: n sitoutuneisiin substraatteihin. Tässä tutkimuksessa ryhdyimme siis testaamaan tyypin III OKS-kasvin yhteensopivuutta tyypin II PKS bakteerijärjestelmistä peräisin olevien syklaasien/aromataasien kanssa tarkoituksenamme kehittää keinotekoinen de novo-biosynteettinen reitti flavokermesiinihapon antronin esiasteen muodostamiseksi karmiinihapon muodostamiseksi.

polyketidin esiasteiden tuotanto karmiinihapon tuotantoa varten A. nidulansissa

testataksemme OKS: n in vivo-suorituskykyä sieniisännässä lisäsimme OKS: n, jota A. Nidulans GPDA-promoottori valvoo, yhtenä kappaleena määriteltyyn lokukseen (integrointipaikka 5, IS5) A: ssa.nidulalaiset genome18. Kaksi kantaa oli rakennettu, yksi ilmaisten natiivi OKS koodausjärjestys ja yksi ilmaisten kodoni optimoitu versio ilmaisua A. nidulans. Seitsemän päivän inkuboinnin jälkeen kiinteällä kasvualustalla, KS. menetelmät-osio, jossa molemmat kannat näyttivät voimakkaan punaruskean värityksen sienirihmastoa (Kuva. 2b). HPLC-HRMS-kantojen metabolisessa profiloinnissa ei havaittu merkkejä pelkistymättömästä oktaketidistä, vaan odotetusta SEK4: stä ja SEK4b: stä sekä flavokermesiinihaposta ja kolmesta muusta runsaasta yhdisteestä, joiden henkilöllisyyttä ei tiedetä (Fig. 2c), joita ei esiintynyt nid2252-viitekannassa. SEK4 ja SEK4b määritettiin perusteellisen HPLC-HRMS/MS-analyysin perusteella (Supplementary File, Fig. 2) ja oli aiemmin ilmoitettujen arvojen19 mukainen, kun taas flavokermesiinihappoa verrattiin D. coccus9: stä eristettyyn aitoon referenssiin (täydentävä tiedosto, Fig. 3). Metaboliitti eluoituu 13, 0 minuutissa. sen pseudomolekulaarinen ioni + oli M / z 303.0867, joka vastaa c16h14o6: n molekyylikaavaa ja on yhdenmukainen tunnetun oktaketidi-sunttituotteen, mutaktiinin, kanssa, joka on aiemmin kuvattu Streptomyces-bakteeriin perustuvissa kokeissa Act-geenillä cluster7. Tämä tunnistaminen vahvistettiin UV-spektrin yksityiskohtaisella analyysillä, ja sitä tuki retentioaika suhteessa SEK4: ään ja SEK4b: hen (Supplementary File, Fig. 4). Kaksi muuta metaboliittia, joiden molekyylikaavat olivat c16h12o6 (- m/z 299.0566), viittasivat oktaketidivalmisteisiin, mutta eivät kuitenkaan vastanneet yhteistä sunttituotetta (täydentävä tiedosto, Fig. 5). Näin ollen metaboliitit eristettiin ja rakenteen selvittäminen 1D-ja 2D-NMR-kokeiden perusteella tunnisti ne dehydro-SEK4: ksi (tunnetaan myös nimellä B26 bakteerikirjallisuudessa) ja dehydro-SEK4b20: ksi (Supplementary File, Figs 6-11). OKS-kannassa Havaittujen kuuden uuden polyketidin muodostuminen voidaan selittää kolmella erilaisella spontaanilla ensirenkaan sulkeutumisreaktiolla: C7-C12 (SEK4, DEHYDRO-SEK4 ja flavokermesiinihappo), C10-C15 (SEK4b ja dehydro-SEK4b) ja C7-C12 C9-ketonin pelkistymisen (mutaktiini) jälkeen (Fig. 2a ja täydentävä tiedosto, kuva. 12). Näistä vain ensimmäinen rengassulkutyyppi (C7-C12) mahdollistaa halutun flavokermesiinihapon antronin muodostumisen toisen C5-C14-ja kolmannen C2-C15-rengassulkimen kautta. SEK4 ja SEK4b on aiemmin raportoitu spontaanisti dehydro-SEK4 ja vastaavasti dehydro-SEK4b, kun taas mutaktiinin muodostuminen riippuu polyketidiketjun C9-aseman entsymaattisesta pelkistymisestä ennen taittumista21. Karmiinihapporeitistä tunnetun välituotteen flavokermesiinihapon muodostuminen (Kuva. 1), oli odottamatonta, koska tämän metaboliitin ei ole raportoitu muodostuvan itsestään pelkistymättömistä oktaketidiketjuista. Tämä viittaa siihen, että A. nidulans tuottaa luonnollisesti useita syklaaseja/aromataaseja, jotka edistävät haluttua taittumiskuviota. Kahden OKS-kantaa ilmentävän kannan metaboliittiprofiloinnissa ei havaittu merkittäviä eroja tuotantotasoissa, ja päätimme keskittyä OKS: n alkuperäistä versiota ilmentävään kantaan karmiinihapon tuotantoon tarkoitetun sienisolutehtaan jatkokehityksen pohjaksi.

Pelkistämättömien oktaketidien taittoreitin suunnittelu

pelkistämättömän oktaketidin irrallinen taittuminen vähentää suotavan flavokermesiinihapon saantoa. Siksi visioimme, että flavokermesiinihapon tuotantoa voitaisiin lisätä virtaviivaistamalla taitteluprosessia haluttuun suuntaan ilmaisemalla kodonioptimoituja versioita Zhuista ja Zhujista. Tutkiaksemme, häiritsevätkö ZhuI ja ZhuJ A. nidulansin alkuperäistä aineenvaihduntaa, rakensimme ensin kantoja, jotka ilmentävät Zhuita ja Zhujia yksittäin ja yhdessä määritellyistä genomisista lokuksista (IS6 ja IS7) A: ssa. nidulans NID2252-viitekanta. Näiden kolmen kannan HPLC-HRMS: n metaboliaprofiloinnissa ei havaittu havaittavia metabolisia eroja (kuva. 3b). Rakensimme sitten zhuin kanssa OK: ta ilmentävän kannan, joka koodaa syklaaseja, jotka katalysoivat C7-C12: n ensimmäisen rengassulkimen muodostumista (Kuva. 3 A). Verrattuna vain oksia ilmentävään kantaan, tämä kanta osoitti 2, 5 -, 2, 2-ja 2, 1-kertaista kasvua flavokermesiinihapon, SEK4-ja dehydro-SEK4-pitoisuuksissa. Yhteisymmärryksessä Zhuin kanssa, joka ohjasi taittumista haluttuun suuntaan, näihin metabolisiin muutoksiin liittyi vähemmän metaboliitteja, jotka sisälsivät ei-toivotut ensimmäiset rengaspoimut (Fig. 3b ja taulukko 1). OK: ta ja ZhuJ: ia ilmentävä kanta, joka koodaa aromataaseja, jotka katalysoivat C5-C14: n toisen renkaan sulkeutumista (Kuva. 3a), sai aikaan 2, 7-kertaisen nousun flavokermesiinihappopitoisuuksissa. Tähän nousuun liittyi C7-C12: n ensimmäisen rengaskerran metaboliittien (SEK4 ja dehydro-SEK4) väheneminen, kun taas odotetusti ei-toivotun C10-C15: n ensimmäisen rengaskerran (SEK4b ja dehydro-SEK4b) metaboliittien määrä ei vaikuttanut (Fig. 3b ja taulukko 1). ZhuI -, ZhuJ-ja OKS-yhdisteitä ilmentävän kannan analysoinnissa flavokermesiinihapon tuotanto kasvoi 4,1-kertaiseksi verrattuna siihen, kun OKS ilmaistiin yksinään. Lisäksi tämä lisäys on 60% suurempi kuin oksia ilmentävillä kannoilla yhdessä joko Zhuin tai Zhujin kanssa (Taulukko 1). Tämä tulos osoittaa, että syklaasi ja aromataasi pystyvät additiivisesti lisäämään valovirtaa keinotekoisessa de novo-reitissä kohti haluttua tuotetta, flavokermesiinihappoa (Fig. 3b).

yllättäen ja hyvin rohkaisevasti LISÄAINEENVAIHDUNTA-analyysi oksia, Zhuita ja Zhujia ilmentävästä kannasta paljasti, että flavokermesiinihapon lisääntyneeseen muodostumiseen liittyi kermesiinihapon tuotanto (Kuva. 4). Niinpä A. nidulaaneista saadaan tarvittava mono-oksigenaasi flavokermesiinihapon muuntamiseksi kermesiinihapoksi, joka voi toimia karmiinihapporeitin viimeisenä välituotteena (Fig. 1).

Karmiinihapon tuotanto A. nidulansissa

viimeinen vaihe karmiinihapon muodostumisessa tapahtuu kermesiinihapon C-glukosylaatio (Kuva. 5 a). Karmiinihapon biosynteettisen reitin tämän vaiheen vastuullinen entsyymi on aiemmin tunnistettu D. coccus-bakteerissa ja sille on ominaista heterologinen ilmentymä S. cerevisiae8-bakteerissa. Siksi lisäsimme UGT2-koodausgeenin, joka on optimoitu ilmentymään A. Nidulansissa, nid2252-viitekannan IS4-lokukseen ja täydentääksemme osittain luonnollisen karmiinihapon biosynteettisen reitin A. Nidulansissa samaan lokukseen kannassa, jossa esiintyy yhdessä ZhuI, ZhuJ ja OKS. Pelkän UGT2: n ilmentyminen viitekannassa ei vaikuttanut A. nidulansin kasvualustan ulkonäköön eikä metaboliaprofiiliin verrattuna nid2252-viitekantaan (Kuva. 5b, c). Sen sijaan OKSIN, Zhuin, Zhujin ja UGT2: n yhteisilmaisu synnytti väliaineen punaisen värityksen, mikä viittaa siihen, että muodostui vesiliukoisempi väriaine(t) (Fig. 5b). Tämän kannan kohdennettu LC-HRMS-analyysi vahvisti karmiinihapon muodostumisen22 (Supplementary File, Fig. 13), yhdessä dcII9: n, 23: n ja dcii-isomeerin kanssa (täydentävä tiedosto, kuva. 14), joka osoittaa, että UGT2 oli toimiva A. nidulans ja voisi onnistuneesti suorittaa biosynteettisen reitin (Kuva. 5c). Karmiinihapon ja dcII: n positiivinen tunnistaminen perustui samankaltaisiin retentioaikoihin, UV-spektreihin, MS-ja MS/MS-fragmentaatiomalleihin näiden kahden yhdisteen puhtaissa standardeissa. Kirjallisuudessa on kuvattu kolme karmiinihapon isomeeriä (karmiinihappo, DCIV ja DCVII) stathopoulou et al.23, kaikki kolme osoittavat eri retentioajat LC-MS / MS-pohjainen analyysi. Analyysissamme havaitsimme vain karmiinihappoa eikä dciv: tä ja DCVII: tä, joka perustuu D. coccuksesta eristetyn aidon karmiinihappostandardin retentioaikaan ja pirstoutumiskuvioon (Supplementary file, Fig. 13). Yhdessä tietomme osoittavat vahvasti, että A. nidulansissa on mahdollista tuottaa karmiinihappoa puoliluonnollisen reitin avulla.