Abstrakti

Kysteiinikatepsiinit ovat ryhmä entsyymejä, joita esiintyy tavallisesti endolysosomeissa, joissa ne osallistuvat pääasiassa solunsisäiseen proteiinin kiertoon, mutta niillä on myös tärkeä rooli MHC II-välitteisen antigeenin käsittelyssä ja esillepanossa. Useissa patologioissa kysteiinikatepsiinien havaittiin kuitenkin olevan voimakkaasti ylisääntelyssä ja erittyvän solunulkoisiin tiloihin, joissa niiden havaittiin hajottavan useita solunulkoisia proteiineja. Merkittävä rooli moduloimalla katepsiinin toimintaa pelata glykosaminoglykaanit, joiden havaittiin paitsi helpottaa niiden autokatalyyttinen aktivointi mukaan lukien neutraalissa pH: ssa, mutta myös kriittisesti moduloida niiden toimintaa, kuten tapauksessa kollagenolyyttinen aktiivisuus katepsiini K. vuorovaikutus katepsiinien ja glykosaminoglykaanien käsitellään tarkemmin.

1. Johdanto

Kysteiinikatepsiinit kuuluvat papaiinin kaltaiseen kysteiinipeptidaasiperheeseen . Huolimatta siitä, että ihmisellä löydetyt yksitoista kysteiinikatepsiiniä edustavat vain pientä osaa ihmisen proteolyyttisestä ohjelmistosta, nämä entsyymit ovat herättäneet paljon huomiota erilaisiin rooleihinsa fysiologisissa ja patologisissa prosesseissa, jotka vaihtelevat epäspesifisistä proteiinin liikevaihdoista endolysosomaalisen reitin sisällä pitkälle erikoistuneisiin toimintoihin kudoksen homeostaasissa. Viime aikoina on julkaistu useita erinomaisia arvioita, joissa on yhteenveto kysteiinikatepsiinien rakenteellisista ja toiminnallisista ominaisuuksista terveydessä ja sairauksissa .

kaikilla katepsineilla on sama rakenteellinen tukiranka, jota kutsutaan myös papaijamaiseksi taitokseksi. Rakenne koostuu kahdesta alidomaanista, joita on kutsuttu L-ja R-domeeneiksi viitaten niiden sijaintiin, kun molekyyli esitetään standardisuuntauksessa (Kuva 1). Aktiivinen kohdan halkeama on molekyylin yläosassa L – ja R-domeenien välissä ja sisältää säilyneen katalyyttisen Dyad Cys-His (merkittynä keltaisilla ja sinisillä palloilla kuvassa 1, resp.). Yleensä papaiinin kaltaiset peptidaasit voivat toimia endo-tai eksopeptidaaseina. Tyypillisessä endopeptidaasissa ensisijainen spesifisyyttä määrittävä tekijä on S2-paikka, ja hyvin määritetyt entsyymin paikat vuorovaikuttavat substraatin jäämien P3: n kautta P2′: n kanssa . Viisi perheen yhdestätoista ihmisjäsenestä (katepsiinit F, K, L, S ja V) ovat yksinomaan endopeptidaaseja, katepsiini B on myös peptidyylidipeptidaasi, katepsiini X on karboksipeptidaasi, katepsiini H on aminopeptidaasi ja katepsiini C on dipeptidyylipeptidaasi. Jäljellä olevien kahden jäsenen, katepsiinien O ja W, proteolyyttinen aktiivisuus on vielä selvittämättä . Useimmat kysteiinikatepsiinit ilmentyvät kaikkialla ihmiskehossa, kun taas jotkut (katepsiinit K, S, V ja W) ilmaistaan rajoitetumpina kuvioina . Katepsiini K: ta esiintyy runsaasti osteoklasteissa ja synoviaalisissa fibroblasteissa, mutta sitä esiintyy myös muissa hematopoieettisten, epiteelisten ja fibroblastisten linjojen soluissa . Katepsiini S: n korkeimmat ilmentymistasot löytyvät antigeenia esittelevistä soluista , katepsiini V ilmaistaan pääasiassa kateenkorvassa ja kiveksissä ja katepsiini W: n ilmentyminen rajoittuu CD8+-lymfosyytteihin ja luonnollisiin tappajasoluihin .

2. Kysteiinikatepsiiniaktiivisuuden säätely

Tsymogeeniaktivaatio on yksi tärkeimmistä katepsiiniaktiivisuuden säätelykeinoista. Kaikki katepsiinit nimittäin syntetisoidaan inaktiivisina tsymogeeneina ja aktivoidaan endolysosomaalisten vesikkelien happamassa miljöössä. Niiden aktivoitumisen molekyylimekanismi askarrutti pitkään. Kriittinen tieto tuli procathepsiini B: n, K: n ja L: n rakennetutkimusten yhdistelmästä, joka osoitti, että propeptidi kulkee katepsiinien aktiivisen kohdan läpi substraatin vastakkaiseen suuntaan, jolloin propeptidin pilkkoutuminen molekyylissä ilman valtavia ja energeettisesti epäedullisia propeptidin rakenneliikkeitä , jolloin poistetaan alun perin ehdotettu unimolekulaarinen mekanismi, sekä yksityiskohtaisista kineettisistä tutkimuksista, jotka osoittivat selvästi, että katepsiini B: n aktivaatio on bimolekulaarinen prosessi . Nykyinen malli, joka perustuu pääosin katepsiini B-tutkimuksiin, viittaa siihen, että katepsiinisymogeenin propeptidi vaihtaa kahden konformaation, ns.”Suljetussa” konformaatiossa, jota suositaan neutraalissa tai hieman happamassa pH: ssa, propeptidi estää aktiivisen kohdan ja estää substraatin hydrolyysin, kun taas ”avoimessa” muodossa, jota suositaan happamassa pH: ssa alle pH 5,0, propeptidi poistetaan aktiivisesta sivuhaarakkeesta, jolloin tsymogeenin katalyyttinen aktiivisuus on alhainen. Tämä aktiivisuus riittää aktivoimaan toisen katepsiinisymogeenin yhdessä tai useammassa vaiheessa ja siten käynnistämään ketjureaktion, jossa tällainen täysin aktiivinen kypsä katepsiini B käsittelee valtaosan tsymogeenimolekyyleistä .

kysteiinikatepsiinien muut keskeiset säätelijät ovat makromolekyylinestäjiä, jotka sitoutuvat aktiiviseen kohtaan ja estävät siten peptidaasin liittymisen substraattiinsa. Ne kuuluvat useisiin erillisiin sukuihin, kuten kystatiineihin, thyropiineihin ja serpiineihin, jotka voivat seriiniproteaasien lisäksi estää myös useita katepsiineja .

3. Glykosaminoglykaanit Kysteiinikatepsiiniaktiivisuuden pääasiallisina säätelijöinä

glykosaminoglykaanit (Gag) ovat heteropolysakkarideja, jotka koostuvat toistuvista disakkaridiyksiköistä, joilla on suuri negatiivinen varaus. Tämä johtuu useiden karboksyyliryhmien ja sulfaattisubstituutioiden esiintymisestä. Useimmat Gag: t sulfatoidaan, mukaan lukien kondroitiinisulfaatit (CS), kerataanisulfaatti (KS), dermataanisulfaatti (DS), heparaanisulfaatti (HS) ja hepariini, kun taas hyaluronaani (HA) on ainoa sulfatoimaton GAG. Viime vuosina Gag: t ovat olleet syntymässä tärkeinä kysteiinikatepsiinien säätelijöinä, joilla on erilaisia vaikutuksia kohteisiinsa. Perinteisesti kysteiinikatepsiineja oli pidetty lysosomaalisina proteaaseina, ja muiden lysosomaalisten entsyymien tavoin niiden tiedettiin estävän lepäävässä lysosomissa olevia intralysosomaalisia Gageja . Nykyään kysteiinikatepsiinit ovat kuitenkin merkittäviä toimijoita solunulkoisessa proteolyysissä . Niiden vaikutus glykosaminoglykaanipitoisessa solunulkoisessa ympäristössä herätti kysymyksiä kysteiinikatepsiinien ja Gagien välisestä vuorovaikutuksesta lysosomin ulkopuolella. Ihmisen endogeenisten kysteiinikatepsiinien kaksi ryhmää, jotka yleisimmin liittyvät solunulkoiseen proteolyysiin, ovat katepsiini L: n kaltaiset proteaasit (ihmisillä katepsiinit K, L, S ja V) ja katepsiini B . Kahden viime vuosikymmenen aikana kerätyt tiedot osoittavat, että näiden peptidaasien ja gag: iden välinen vuorovaikutus on molemminpuolista; kysteiinikatepsiinit kykenevät pilkkomaan proteoglykaaniydinproteiineja ja siten vapauttamaan Gageja tuestaan, kun taas Gag: t puolestaan vaikuttavat sekä kysteiinikatepsiinien aktiivisuuteen että stabiiliuteen solunulkoisessa tilassa.

papaiinin kaltaisten kysteiinipeptidaasien säätely Gag: n avulla kuvattiin ensimmäisen kerran katepsiini L: lle . Näissä varhaisissa teoksissa havaittiin, että gagit ja erilaiset negatiivisesti varautuneet pinnat kiihdyttävät merkittävästi katepsiini l-tsymogeenin aktivoitumista kypsään muotoon, myös pH: ssa lähellä neutraalia, kuten myös solunulkoisessa ympäristössä erilaisissa tautitiloissa. Tämä on vahvistettu useille muille katepsiineille, joista tärkeimmät ovat katepsiinit B ja S, ja jopa T: lle. congolense loinen homologue congopain, mikä viittaa siihen, että GAGs ja muut negatiivisesti varautuneet pinnat voivat olla merkittävä rooli solunulkoinen katepsiini aktivaatio taudissa. Viimeaikaiset havainnot, joissa katepsiini s on korkea GAG-pitoisuus, viittaavat kuitenkin siihen, että tämä entsyymi voi käyttäytyä hieman eri tavalla tällaisissa olosuhteissa kondroitiini-4-sulfaatin (C4S) kanssa, vaikka sillä olisi hidastava vaikutus . Tästä huolimatta katepsiinien autokatalyyttisen aktivoinnin helpottamisesta negatiivisesti varautuneella polysakkaridi-dekstraanisulfaatilla tuli myös rutiinimenetelmä rekombinanttien katepsiinien valmistuksessa .

suurin osa GAG-avusteisen katepsiinin aktivaation molekyylimekanismista tuli caglič et al: n tekemästä tutkimuksesta. käytetään ihmisen katepsiini B: tä mallina . Kuten on osoitettu, gagit näyttävät edistävän käsittelyä kahdella tavalla. Ensinnäkin, kun ne sitoutuvat, ne näyttävät muuttavan katepsiinin tsymogeenin paremmaksi substraatiksi. Toiseksi Gagien sitoutuminen ilmeisesti suosii tsymogeenin avointa konformaatiota, mikä edistää aktivoitumista paitsi happamassa pH: ssa myös lähempänä neutraalia olevilla pH-arvoilla. Näin näyttää olevan useimpien Gagien kohdalla, eikä se riipu kriittisesti Gagien varaustiheydestä, sillä myös HA pystyi nopeuttamaan aktivaatiota, joskin pienemmässä määrin, mikä on epätavallista proteiinin ja gagin yhteisvaikutukselle. Lisäksi jo tetrasakkaridi riitti katepsiini B-autoaktivaation huomattavaan kiihtymiseen, joka on huomattavasti pienempi kuin useissa muissa GAG-välitteisissä reaktioissa. Vuorovaikutus välittyy ionisten vuorovaikutusten kautta; tsymogeeneissä ei kuitenkaan näytä olevan säilynyttä GAG-sidontapintaa, koska procathepsiinien L ja B, jotka sijaitsivat suurelta osin prodomaineissa, täysin toisistaan riippumattomien jäämien havaittiin säätelevän vuorovaikutusta .

Gagien toinen tärkeä rooli katepsiinin toiminnan säätelyssä tuli perheen arkkityyppistä edustajaa papaiinia koskevista tutkimuksista . Tämä säätelytapa sai nopeasti lisää huomiota, kun huomattiin, että rustosta peräisin oleva kondroitiinisulfaatti lisäsi näkyvästi katepsiini K: n kollagenolyyttistä aktiivisuutta . Tämä peptidaasi oli löydetty muutama vuosi aiemmin ainoana proteaasina, joka on vastuussa kollageenin hajoamisesta luun remodelingissa, ja heti tunnustettu potentiaaliseksi lääkeainekandidaatiksi metabolisten luusairauksien, kuten osteoporoosin, hoidossa . Katepsiini K: n interaktiota kondroitiinisulfaatin ja muiden glykosaminoglykaanien kanssa tutkittiin myöhemmin yksityiskohtaisesti sekä rakenteellisesta että toiminnallisesta näkökulmasta ja glykosaminoglykaanit on tunnustettu kysteiinikatepsiinipeptidaasin ensimmäisiksi tunnetuiksi allosteerisiksi säätelijöiksi , kuten on kuvattu yksityiskohtaisesti seuraavissa kohdissa. Samanaikaisesti on todettu toiminnallisesti merkittäviä yhteisvaikutuksia glykosaminoglykaanien kanssa myös muilla kysteiinikatepsiiniperheen jäsenillä. Yhdessä glykosaminoglykaanien on todettu vaikuttavan sekä kysteiinikatepsiinien aktiivisuuteen että stabiiliuteen. Kineettiset profiilit ovat yleensä yhdenmukaisia hyperbolisten mekanismien kanssa, mikä viittaa yhteisvaikutuksiin aktiivisen kohdan ulkopuolisten entsyymien kanssa, mahdollisesti allosteeristen mekanismien kautta. Stabiloiva vaikutus on tärkeä erityisesti siksi, että kysteiinikatepsiinien suhteellinen epävakaus neutraalissa pH: ssa löytyy solunulkoisesta matriisista.

4. Katepsiini K: n aktiivisuuden säätely ja Stabiilisuus

kaikista papaiinin kaltaisista peptidaaseista katepsiini K on todettu katepsiiniksi, joka on tiiviimmin sidoksissa glykosaminoglykaaneihin. Se tunnistettiin alun perin pääasiassa osteoklasteilla ilmaistuksi proteaasiksi, ja sen heikentyneen aktiivisuuden osoitettiin johtavan vakaviin luustohäiriöihin . Katepsiini K on kollagenaasi , jolla on ainutlaatuinen aktiivisuus nisäkkäiden peptidaaseissa ja jota glykosaminoglykaanit erityisesti moduloivat allosteeristen mekanismien kautta . Katepsiini K: ta pidetään tällä hetkellä yhtenä lupaavimmista kohteista osteoporoosin hoidossa . Lukuun ottamatta luun remodeling, katepsiini K on mukana erilaisia fysiologisia ja patologisia prosesseja (varten viime katsaus katso ). Se voi pilkkoa useita solunulkoisia substraatteja, kuten proteoglykaaneja, vapauttaakseen aktiivisia glykosaminoglykaaneja, jotka puolestaan moduloivat sen toimintaa. Rustossa katepsiini K hajottaa sekä tyypin I että tyypin II kollageeneja ja edistää siten erilaisten tulehduksellisten nivelsairauksien kehittymistä . Lisäksi katepsiini K on yhdistetty sydän-ja verisuonitauteihin, lihavuuteen, skitsofreniaan ja syöpään .

katepsiini K: n yhteisvaikutuksia eri glykosaminoglykaanien kanssa on tutkittu perusteellisesti. Vaikka useat näiden yhteisvaikutusten näkökohdat ovat edelleen vaikeasti havaittavissa, kerätyt tiedot viittaavat siihen, että yhteisvaikutukset ovat heterogeenisiä ja moninaisia ja todennäköisesti sisältävät useita sitoutumiskohtia entsyymiin. Kondroitiini-4-sulfaatti (C4S) tunnistettiin aluksi SUUKAPULAKSI, jolla oli dramaattisin vaikutus katepsiini K: hon, kun taas kondroitiini-6-sulfaatin (C6S), dermataanisulfaatin (DS) ja hyaluronaanin (HA) vaikutukset olivat heikompia. Kaikki testatut gagit lisäsivät katepsiini K: n vakautta laajalla pH-alueella. C4S: llä oli näkyvin vaikutus katepsiini K: n aiheuttamaan tyypin I ja II kollageenien hajoamiseen , kun taas sen vaikutus synteettisen substraatin hydrolyysiin oli lähes identtinen C6S: n ja DS: n kanssa ja johti spesifisyysvakion arvojen kaksinkertaiseen kasvuun . Myöhemmässä tutkimuksessa kerataanisulfaatilla (KS) ja C6S: llä havaittiin olevan samanlainen stimuloiva vaikutus katepsiini K: hon kuin C4S: llä, kun taas hepariinilla ja HS: llä oli vähäinen vaikutus katepsiini K: n kollagenolyyttiseen aktiivisuuteen . Varhaiset kokeet ovat myös ehdottaneet, että monimutkainen muodostuminen CS on tarpeen kollagenolyyttistä toimintaa katepsiini K ; kuitenkin viimeaikaiset havainnot ovat osoittaneet, että tyyppi I kollageeni voi myös tehokkaasti hajota ilman glykosaminoglykaanien . Luussa asuvien Gag: iden on kuitenkin osoitettu voimistavan katepsiini K: n kollagenolyyttistä aktiivisuutta, ja endogeeniset GAG-pitoisuudet luussa olivat riittävät katepsiini K: n aktiivisuuteen kohdistuvan maksimivaikutuksen aikaansaamiseksi .

CS: n, DS: n ja hepariinin (HP) katepsiini K: hon kohdistuvan vaikutuksen kineettistä mekanismia tutkittiin myös yksityiskohtaisesti, kun plasman fysiologinen pH oli 7, 4. Näissä olosuhteissa CS: ää ja DS: ää luonnehdittiin epäolennaisiksi aktivaattoreiksi, joilla oli hallitseva vaikutus affiniteettiin substraattiin . DS oli tehokkaampi kuin CS, minkä katsottiin johtuvan sen suuremmasta joustavuudesta johtuen pienemmistä intramolekulaarisista vetysidoksista . Luontainen fluoresenssi osoitti, että gag: iden sitoutuminen vaikuttaa katepsiini K: n konformaatioon. toisin kuin pH 5.5: ssä suoritetuissa kokeissa CS ja DS toimivat kollageenin hajoamisen estäjinä fysiologisessa plasman pH: ssa.hepariinin kineettinen mekanismi oli sen sijaan kaksivaiheinen, mikä viittaa vuorovaikutukseen entsyymin kahden erillisen kohdan kanssa. Kaiken kaikkiaan hepariini oli voimakas katepsiini K: n aktivaattori fysiologisessa plasman pH: ssa, mikä lisäsi sekä sen kollagenolyyttistä että elastinolyyttistä aktiivisuutta. Lisäksi hepariinilla oli näissä olosuhteissa voimakas stabiloiva vaikutus katepsiini K: hon, mikä johti yli 5-kertaiseen entsyymin puoliintumisajan pitenemiseen .

5. Rakenteellinen perusta katepsiini K: n ja Gagien väliselle vuorovaikutukselle

katepsiini K: n ja C4S: n kiderakenne paljasti vuorovaikutuksen rakenteellisen perustan . Sidospaikka sijaitsee katepsiini K: n takaosassa ja vuorovaikuttaa kiderakenteeltaan kolmen CS: n disakkaridiyksikön kanssa (kuva 2(a)). Kuten tavallista, glykosaminoglykaanin ja proteiinin välinen vuorovaikutus välittyy pääasiassa negatiivisesti varautuneen GAG-ketjun ja positiivisesti varautuneiden jäämien välisistä sähköstaattisista vuorovaikutuksista entsyymissä. Kondroitiinisulfaatin sitoutuminen ei aiheuta merkittäviä konformaatiomuutoksia katepsiini K: ssa verrattuna CS-vapaaseen katepsiiniin K. vastaavasti CS-ketju taipuu sitoutuessaan katepsiiniin K (kuva 2 b)). Suurin osa konformaatiomuutoksesta johtuu vuorovaikutuksesta lyhyen kierteisen alueen Arg8-Lys9-Lys10 kanssa, joka vuorovaikuttaa neljän negatiivisesti varautuneen ryhmän kanssa CS: ssä (kuva 2(c)). Muita läheisiä kontakteja ovat Asp6, Ile171, Gln172, Asn190, Lys191 ja Leu195 sekä muutama ylimääräinen veden välittämä kontakti .

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figure 2

Interactions between human cathepsin K and GAGs. (a) Crystal structure of the cathepsin K/chondroitin-4-sulfate (C4S) complex. Proteiini näkyy sarjakuvaesityksessä ja C4S tikkuina. (b) Conformational change in c4s upon binding to cathepsin K. (c) Detailed representation of the interaction in panel (a). C4S näkyy tikkuina. Katepsiini K: n selkäranka näkyy nauhoina ja C4S: n kanssa vuorovaikutuksessa olevat jäämät tikkuina. (d) ennustetun toisen hepariinin sitoutumiskohdan sijainti katepsiini K: ssa.positiivisesti varautuneet jäämät, joiden ehdotetaan olevan vuorovaikutuksessa hepariinin kanssa, esitetään sinisinä tikkuina. Orientaatiossa C4S sidotaan ensimmäiseen sidontapaikkaan tikkuina. Aktiivisen kohdan halkeama on merkitty nuolella. Katepsiini K/C4S-kompleksin koordinaatit haettiin Proteiinitietopankista liittymiskoodilla 3C9E. C4S: n ratkaisurakenne mallinnettiin käyttäen dataa, josta . Kaikki kuvat on luotu Pymolilla.

DS: n kineettinen käyttäytyminen oli analogista CS: n kanssa: siksi ehdotettiin, että se vuorovaikuttaa katepsiini K: n kanssa samalla tavalla kuin CS . Hepariinin taas ehdotettiin sitoutuvan kahteen kohtaan katepsiini K: ssa kineettisen profiilinsa mukaisesti. Ensimmäisen sitoutumiskohdan ehdotettiin olevan identtinen CS/DS: n kanssa, mutta toinen sitoutumiskohta ennustettiin molekyylin pohjalle kemiallisilla ristisilloituskokeilla ja laskennallisella mallinnuksella . Rakenteelliselta kannalta ennustettu sitoutumiskohta on CD/DS-sitoutumiskohdan jatkumo ja koostuu useista perusjäännöksistä (Lys10, Lys40, Lys41, Arg108, Arg111, Arg127 ja Lys214), jotka on järjestetty rengasmaiseen rakenteeseen (kuva 2(d)). Kineettiset kokeet ovat vahvistaneet, että hepariini voi sitoutua molempiin kohtiin yhtä aikaa . On kuitenkin vielä selvitettävä, edellyttääkö tämä yhtä HP-ketjua, joka on vuorovaikutuksessa molempien sivustojen kanssa samaan aikaan, vai kahta erillistä HP-ketjua. Tämä ei ole selvää muiden Gagien yhteisvaikutuksesta toisen HP: tä sitovan kohdan kanssa.

6. Gag: iden yhteisvaikutusten katepsiini S: n ja B: n

kanssa katepsiini K: ta lukuun ottamatta kahden muun ihmisen papaiinin kaltaisen peptidaasin, katepsiini S: n ja B: n, on osoitettu säätelevän glykosaminoglykaaneja kypsässä muodossaan . Katepsiini S, lähin sukulainen katepsiini K, on epätavallinen keskuudessa kysteiinikatepsiinit ovat stabiileja neutraalissa pH: ssa . Katepsiini S: llä on merkittävä fysiologinen rooli antigeenejä esittelevissä soluissa tärkeimpänä proteaasina antigeeniprosessoinnissa, ja äskettäin havaittiin C4S: n säätelevän sitä . Toisin kuin katepsiini K: lla havaittu aktivaatiovaikutus, C4S toimi tyypin IV kollageenin hajoamisen estäjänä katepsiini s: n avulla.inhibitiota havaittiin myös HS: llä, kun taas HP, DS, C6S ja HA lisäsivät hieman katepsiini s: n proteolyyttistä aktiivisuutta käyttämällä substraattina tyypin IV kollageenia. C4S, C6S ja HS estivät myös Z-Phe-Arg-AMC: n hydrolyysin osittaisella, sekamekanismilla. Katepsiini K: n tapaan katepsiini S: ssä havaittiin hienovaraisia konformaatiomuutoksia, kun C4S sitoutui luontaiseen fluoresenssispektroskopiaan. C4S: lle ennustettiin kolme sitoutumiskohtaa molekyylitelakoinnin avulla (kuva 3(a)). Yksi ehdotetuista alueista on aktiivinen alue, joka ei kuitenkaan ole sopusoinnussa C4S: n havaitun sekamuotoisen estoprofiilin kanssa.; toinen sijaitsee molekyylin oikealla alapinnalla ja vastaa äskettäin tunnistettua allosteerista kohtaa katepsiini K: ssa, kun taas kolmas sijaitsee molekyylin alaosassa ja vastaa karkeasti katepsiini K: ssa tunnistettua sekundaarista hepariinin sitoutumiskohtaa .

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figure 3

Predicted GAG-binding sites in papain-like peptidases. (a) Three predicted CS-binding sites in cathepsin S. (b) Two predicted HS/HP-binding sites in cathepsin B. (c) The conserved GAG-binding motif in papain. Ennustetut paikat esitetään ympyröinä ja positiivisesti varautuneet jäämät kussakin kohteessa esitetään sinisinä tikkuina ja merkittyinä. Aktiivisen kohdan halkeama on merkitty nuolella. Kaikki koordinaatit saatiin Proteiinitietopankista (liittymiskoodit: 1nqc katepsiini S, 3ai8 katepsiini B, ja 1ppn papaiini, resp.). Kaikki kuvat on luotu Pymolilla.

katepsiini B on kysteiinikatepsiineista ainutlaatuinen siten, että se on sekä endopeptidaasi että peptidyylidipeptidaasi, sulkusilmukan konformaatiosta riippuen katepsiini B-spesifinen rakenne, joka tarjoaa pH-spesifisen vaihtelun molempien toimintojen välillä . Lysosomissa alhainen pH rajoittaa proteaasin suljettuun eksopeptidaasikonformaatioon, kun taas solunulkoisen ympäristön lähes neutraali pH edistää katepsiini B: n endopeptidaasiaktiivisuutta . Solunulkoinen katepsiini B liittyy yleisimmin syöpään ja erilaisiin niveltulehduksiin . Proteaasi lokalisoitui useissa tutkimuksissa solun pinnalle ja sen havaittiin osallistuvan solujen siirtymiseen sekä fysiologisissa että patologisissa olosuhteissa . Molekyylitasolla sen osoitettiin pilkkovan useita solunulkoisia substraatteja, kuten laminiinia, tyypin IV kollageenia ja fibronektiinia . Viime aikoina katepsiini B: n on myös ehdotettu olevan β-sekretaasi, joka tuottaa amyloidisia β-peptidejä hermosolujen kromaffiinisolujen eritysrakkuloissa . Sen on kuitenkin osoitettu myös hajottavan amyloidiesiintymiä eläinmallissa, ja kokonaistuloksen on ehdotettu määräytyvän katepsiini B: n ja sen endogeenisen inhibiittorin kystatiini C: n välisen tasapainon perusteella .

HP: n tai HS: n sitoutumisen on osoitettu lisäävän muuten epästabiilin entsyymin stabiilisuutta emäksisessä pH: ssa (8.0), mutta vähentävän hieman entsyymin aktiivisuutta koko entsyymin pH-profiilissa . Laskennalliset simulaatiot ovat ennustaneet, että hepariini stabiloi molekyylin konformaatiota näissä olosuhteissa, ja ennustaneet kaksi oletettua GAG-sitoutumiskohtaa (kuva 3(b)), yhden kummallakin puolella entsyymiä . L-domeenin putatiivinen sitoutumiskohta koostuu viidestä emäsjäännöksestä (Arg85, Lys86, Lys130, Lys141 ja Lys144), kun taas R-domeenin yksi sisältää vain kaksi (Lys158 ja Arg235). Kirjoittajat ovat ehdottaneet, että R-domeenin sitoutumispaikalla on suurempi affiniteetti lyhyempiin GAG-fragmentteihin, kuten heidän telakointisimulaatioissaan käytettyyn hepariinidisakkaridiin, kun taas L-domeenin sidos on todennäköisesti merkityksellisempi pidempien GAG-fragmenttien sitomisessa .

7. Gag: iden Yhteisvaikutukset muiden papaiinin kaltaisten Peptidaasien

kanssa on mielenkiintoista, että papaiinin on myös osoitettu olevan vuorovaikutuksessa Gag: iden kanssa. Vaikka näillä vuorovaikutuksilla ei ole fysiologista merkitystä, ne viittaavat evolutionaarisesti säilyneisiin säätelymekanismeihin perheen sisällä. HP esti papaiinia hyperbolisella sekamekanismilla ja vaikutti sen konformaatioon . Klassinen hepariinia sitova konsensussekvenssi tunnistettiin papaiinista sekvenssin 187-Ile-Arg-Ile-Lys-Arg-Gly-192 muodossa. Rakenteellisesti tämä sekvenssi sijaitsee molekyylin oikealla puolella (kuva 3 (c)) alueella, joka sijaitsee katepsiini K: ssa tunnettujen allosteeristen paikkojen välissä.

lisäksi on kuvattu muutamia esimerkkejä Alkueläinparasiittien proteaaseista, jotka vuorovaikuttavat Gagien kanssa, mikä viittaa niiden vaikutusmahdollisuuteen isäntä-loinen vuorovaikutuksissa. Kathepsiini l homolog brucipain, ratkaiseva virulenssitekijä alkueläin Trypanosoma brucei, on todettu olevan allosteerisesti moduloitu HS. HS: n vaikutus tässä tutkimuksessa oli hienovarainen ja sillä oli kyky kumota substraatin inhibitio pienellä dipeptidisubstraatilla (Z-Phe-Arg-AMC) . HS: n voimakkaampi vaikutus havaittiin cruzipaiinin sukulaisloisesta Trypanosoma Cruzista. Tässä tapauksessa HS oli peptidaasin aktivaattori, joka aiheutti synteettisellä substraatilla mitatun peptidaasin aktiivisuuden merkittävän (jopa 6-kertaisen) kasvun. Lisäksi HS lisäsi kiniinin vapautumista suurimolekyylisestä kininogeenistä cruzipaiinin avulla in vitro sekä elävillä trypomastigooteilla ja vähensi kininogeenin inhibitorisia ominaisuuksia kruzipaiinia kohtaan . Samoin HP: n osoitettiin äskettäin moduloivan Katepsiinin L-kaltaisen peptidaasin rCPB2.8 aktiivisuutta Leishmania mexicanasta . Tällöin HP ja HS, mutta ei CS tai DS, estivät Z-Phe-Arg-AMC: n hydrolyysin hyperbolisella sekamekanismilla ja vaikuttivat proteiinin konformaatioon . Kaiken kaikkiaan nämä esimerkit osoittavat, että vuorovaikutukset Gag: iden kanssa eivät rajoitu endogeenisiin kysteiinikatepsiineihin, vaan niillä voi olla myös erilaisia rooleja isäntä-taudinaiheuttaja-vuorovaikutuksissa ja ne voivat toimia joko osana elimistön puolustusta hyökkääviä taudinaiheuttajia vastaan tai taudinaiheuttajan invasiivisia mekanismeja edistävinä tekijöinä.

8. Farmakologinen kohdistus

katepsiini K on tällä hetkellä houkuttelevin lääkekohde katepsiineista, vaikka katepsiini S on merkityksellinen kohde myös sairauksissa, jotka liittyvät kohonneeseen immuunivasteeseen, kuten keuhkoastmassa ja psoriaasissa . Kehitteillä on useita katepsiini K-inhibiittoreita, jotka kohdistuvat entsyymin aktiiviseen kohtaan (kerätty ). Tällä hetkellä lupaavin estäjä on odanakatibi (Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, NJ, Yhdysvallat), nitriilikärkeä sisältävä inhibiittori, joka on erittäin selektiivinen katepsiini K: lle . Vaiheen III kliiniset tutkimukset odanakatibilla on saatu onnistuneesti päätökseen, ja hyväksymishakemukset odotetaan jätettävän pian. Jos lääke hyväksytään, se asemoituu markkinoilla muihin uuden sukupolven lääkkeisiin, kuten anti-RANK-ligandivasta-aineeseen denosumabiin (Amgen, Inc., Thousand Oaks, CA, USA) ja teriparatidi, lisäkilpirauhashormonin rekombinantti muoto (Eli Lilly and Company, Indianapolis, USA) sekä vakiintuneet bisfosfonaatit . Katepsiinin K/kondroitiini-sulfaatti-vuorovaikutuksen kohdentaminen olisi vaihtoehto näille hoidoille. Endogeeninen kondroitiinisulfaatti riittää osoittamaan katepsiini K: n maksimaalisen aktivaatiovaikutuksen ja sen digestio vähentää katepsiini K: n aktiivisuutta 40% . Näin suuri luun vaihtuvuuden väheneminen riittäisi todennäköisesti sellaisten potilaiden hoitoon, joilla luun tiheyden pieneneminen on vähäisempää. Lisähyötynä katepsiini K: n aktiivisuus sinänsä sekä osteoklastien ja osteoblastien elinkyky ja solumäärä säilyisivät häiriöttöminä.

eturistiriidat

kirjoittajat julistavat, ettei tämän paperin julkaisemiseen liity eturistiriitoja.

tunnustus

työtä on tuettu Slovenian tutkimuslaitoksen (P1-0140 ja J1-3602) Boris Turkille myöntämillä apurahoilla.