Eläimet

seeprakala säilyi 28, 5 °C: ssa 14 tunnin VALOSYKLIN aikana Danieau-liuoksessa . Kombinatorinen kidemutantti (albb4/b4;nacrew2/w2;roya9/a9) syntyi risteyttämällä peräkkäin kolme erilaista yksittäistä mutanttikantaa, nimittäin nacrew2 / w2 (viite. 9), roya9 / a9 (viite. 4)ja albb4 / b4 (viite 18) mutantit. Tärkeää on, että sekä toukat että aikuiset kideseprakalat ovat elinkelpoisia, eikä niissä ole muita näkyviä morfologisia, toiminnallisia tai käyttäytymismuutoksia kuin pigmenttifenotyyppi. Casper-mutantti saatiin risteyttämällä nacrew2/w2 ja roya9 / a9 mutantit, kuten aiemmin kuvattiin 4. AB-linjalla hankittiin villityyppisiä seeprakaloja. Tässä tutkimuksessa käytettyjä siirtogeenisiä linjoja ovat Tg (elavl3:GCaMP5G)21 ja Tg(elavl3: GCaMP6f)28. Konfokaalisia funktionaalisia kuvantamiskokeita tehtiin helmiäismutanteilla. Valolevykuvauskokeita tehtiin nacre -, casper-ja kidemutanteilla. Kahden fotonin funktionaalista kuvantamista kokeiltiin Kiteen toukilla. Seeprakalan toukkien hoidossa PTU: lla noudatimme standardimenetelmiä8, erityisesti toukkia kasvatettiin 200 µM PTU: ssa (Sigma) Danieau-liuoksessa 24 tuntia hedelmöityksen jälkeen (hpf). TG (elavl3:GCaMP5G) – toukkia, joita käytettiin optisen tektumin visuaalisesti herättämän hermotoiminnan konfokaaliseen funktionaaliseen kuvantamiseen, käsiteltiin 200 µM: n PTU: lla 24 hpf: stä 3 hiukkassuodattimeen ja kuvattiin 4 hiukkassuodattimella. Tämä työ on hyväksynyt paikallinen Eläinten hyvinvointi ja eettinen arviointielin (King ’ s College London), ja se toteutettiin mukaisesti Animals (Scientific Procedures) Act 1986, lisenssillä Yhdistyneen kuningaskunnan sisäministeriön (ppl70/8057).

kuvantaminen

Kokoeläimen in vivo-mikroskopia

täysikasvuisen seeprakalan Kokoeläinkuvat on otettu NIKON D7000-digitaalisella järjestelmäkameralla, joka on varustettu Sigma 150 mm makro-objektiivilla. Aikuiset seeprakalat nukutettiin 0: lla.2% trikaiinia (MS222, Sigma) kalanvedessä ja 90 mm: n petrimaljaan, joka sisältää kalanvettä. Toukkien kuvantaminen tehtiin EXi Blue CCD-kameroihin (Retiga) ja Volocity acquisition software (PerkinElmer) kytketyllä Zeiss Axioskop-mikroskoopilla. Toukkaseprakalat nukutettiin 0,02% trikaiinilla Danieau-liuoksessa ja immobilisoitiin 1%: n matalassa sulamispisteessä olevassa agaroosissa (Sigma) lasilevyihin.

Konfokaalikalsiumkuvaus

kuvantaminen suoritettiin Zeiss lsm 710-konfokaalimikroskoopilla, joka oli varustettu spektrihavaintopäällä ja 20x / 1-laitteella.0 NA veteen upottaminen tavoite (Carl Zeiss). Verkkokalvon ganglionisoluissa (rgcs) visuaalisesti Havaittujen kalsiumvasteiden funktionaalinen aikasarja saatiin 4,1 Hz: n nopeudella ja 0,415 × 0,415 µm: n resoluutiolla (256 × 256 pikseliä) ja 1 AU: n neulanreiän aukolla. Herätevaloa tarjosi 488 nm: n monirivilaser. Ei-nukutetut Tg (elavl3:GCaMP5G)-toukat immobilisoitiin 2%: n matalan sulamispisteen agaroosissa (Sigma), joka valmistettiin Danieau-liuoksessa ja asennettiin selkäpuoli ylös korotetulle lasitasolle, joka asetettiin mittatilaustyönä valmistettuun Danieau-täytettyyn kammioon. Agaroosi riitti pitämään toukat aisoissa niin, ettei puudutusta tarvittu. Kuvaukset tehtiin iltapäivällä (kello 1-8).

Light-sheet imaging

Whole-brain light-sheet-kuvantaminen tehtiin käyttäen ZEISS Lightsheet Z. 1-mikroskooppia, joka oli varustettu kahdella 10x/0.2 NA-valaistustavoitteella ja yhdellä 20x / 1.0 NA-vesi-upotustunnistustavoitteella (Carl Zeiss). Gcamp6f-fluoresenssin herättämiseen käytettiin 488 nm: n laserviritysvaloa ja emittoituvan valon havaitsemiseen käytettiin 505-545 BP-suodatinta. Pivot-skanneria (Carl Zeiss) käytettiin homogeenisen valaistuksen tuottamiseen ja siten varjojen välttämiseen valaistusakselin suuntaisesti. Valolevyn paksuus oli keskeltä 5,39 µm ja näkökentän reunoilta 10,8 µm. Valotusaika oli 29,97 ms. tilavuuskuvien koko oli 623 × 798 × 283 µm3 (1500 × 1920 × 490 pikseliä) resoluutiolla 0,415 × 0,415 × 0,631 µm. 4 dpf nacre, casper ja crystal Tg(elavl3:GCaMP6f)-toukat halvaantuivat ensin 10-15 minuutiksi danieau-liuoksessa valmistetussa α-bungarotoksiinissa (1 mg/ml; Biotium). Tämän jälkeen toukat immobilisoitiin 2%: n matalassa sulamispisteessä agaroosissa (Sigma) ja laitettiin lasikapillaariin (tilavuus 20 µl, 701904; merkki). Tämän jälkeen pursotimme toukan pään sisältävän agaroosisylinterin osan kapillaarista ja suuntasimme toukat siten, että pään selkäpuoli oli kohti havaitsemistavoitetta ja silmät olivat kaksi valaistustavoitetta. Casper-mutanttien toukkien kokoaivokuvaus tehtiin mittatilaustyönä valmistetulla valolevymikroskoopilla, jonka rakensi tohtori Martin Meyer (King ’ s College London) ja joka oli varustettu 20x/1.0 NA vesikylpy XLUMPlanFLN detection objective (Olympus)-laitteella.

kahden fotonin kalsiumkuvaus

kahden fotonin funktionaalinen kuvantaminen verkkokalvolla suoritettiin Nikon A1R MP-mikroskoopilla, joka oli varustettu 4-kanavaisella GaAsP NDD: llä ja apochromat 25x / 1.1 NA-vesi-upotustavoitteella (Nikon). Heräte tarjosi kameleontti Ultra II Mode-lukittu titaani-safiiri laser (koherentti)viritetty 930 nm. Visuaalisesti Havaittujen kalsiumvasteiden aikasarjat saatiin 4 Hz: n nopeudella ja 0,248 × 0,248 µm: n resoluutiolla (512 × 256 pikseliä). Laserkeilauksen aktivoinnin jälkeen odotimme 60 sekuntia ennen visuaalisen stimulaation aloittamista varmistaaksemme, että verkkokalvo sopeutui monifotonilaserin aiheuttamaan taustavalotasoon. 4 dpf crystal Tg (elavl3:GCaMP6f)-toukkaa halvaantui ensin 10-15 minuutiksi danieau-liuoksessa valmistetussa α-bungarotoksiinissa (1 mg/ml; Biotium). Tämän jälkeen toukat immobilisoitiin 2%: n matalassa sulamispisteessä agaroosissa (Sigma) ja asennettiin korotetulle mittatilaustyönä valmistetulle lasialustalle, jonka selkäpuoli oli ylöspäin (45°: n kulma kallistuu) ja toinen silmä kohti LCD-näyttöä (katso visuaalinen stimulaatio), joka sijoitettiin mittatilaustyönä valmistetun Danieau-täytetyn kammion alle. Kuvaukset tehtiin iltapäivällä (kello 1-8).

visuaalinen stimulaatio

liikkuvat tangot konfokaalivalmisteessa

liikkuvat tangot stimuloituivat edellä kuvatulla tavalla 22,33. Diffuusiosuodatin (3026, Rosco) liitettiin kammion toiselle puolelle toimimaan valkokankaana. Valkokankaan edessä olevan silmän edessä oleva agaroosi poistettiin, mikä mahdollisti esteetön näkymä heijastettuun kuvaan kammion sivulla. Toukat sijoitettiin 3 cm: n päähän kuvaruudusta ja projisoitu kuva täytti näkökentän, joka oli ~97° × 63°. Visuaalisia ärsykkeitä olivat valo (56 cd/m2) tai tummat palkit (8 cd/m2) (175% ja 25% keskimääräisestä luminanssista) keskimääräisellä harmaalla pohjalla (32 cd / m2). Koska vaaleiden ja tummien tankojen välillä ei havaittu laadullisia eroja, näiden kahden ärsykkeen avulla saadut tiedot yhdistettiin. Jokainen tanko oli leveydeltään 10° liikkuen nopeudella 20°/s ja erotettuna edellisestä tangosta 30°, mikä mahdollisti useamman kuin yhden tangon näytölle kerrallaan. Tankojen pitkät akselit olivat ortogonaalisia liikesuuntaan nähden. Jokainen 12 liikesuunnasta esitettiin kerran (3 sekuntia) pseudo-satunnaisessa järjestyksessä, joka on ainutlaatuinen jokaisen kuvatun eläimen jokaiselle viipaleelle. Jokainen epookkien välinen intervalli oli 10 sekuntia, jotta GCaMP5G-signaalit palaisivat lähtötasolle. Myös kahden sekunnin nollatilanne hylättiin. Visuaaliset kokeet luotiin ja ohjattiin mittatilaustyönä kirjoitetulla Labview-ja MATLAB-koodilla (MathWorks), toteutettiin ViSaGe stimulus presenter-ohjelmalla (Cambridge Research Systems) ja toimitettiin DLP Pico-projektorilla (Optoma).

kahden fotonin valmistelussa olevat liikkuvat ritilät

kahden fotonin valmistelussa olevat Siirtoritilät luotiin ja ohjattiin Psykopy39: llä ja toimitettiin LCD-näytön (SKD5VA-3, GoodWell-tekniikka) kautta, joka oli sijoitettu mittatilaustyönä valmistetun Perspex-kammion alle. Nestekidenäytön ja kammion väliin oli sijoitettu pitkäpäästöinen punainen lasisuodatin (FGL610, Thorlabs), joka mahdollisti samanaikaisen kuvantamisen ja visuaalisen stimulaation. Toukat oli sijoitettu 2 cm: n päähän näytöstä ja LCD-näytöllä oleva kuva täytti näkökentän, joka oli ~140° × 100° (taustaluminanssi keskimäärin 30,4 cd/m2). Visuaaliset ärsykkeet koostuivat neliöaaltoristikoista (100% kontrasti, tilataajuus 1,66 sykliä/cm, ajallinen taajuus 1 sykliä/s). Jokainen ritilätanko oli leveydeltään 8,5° ja tankojen pitkät akselit olivat ortogonaaliset liikesuuntaan nähden. Jokainen 12 liikesuunnasta esitettiin kerran (6 sekuntia) ja epookkiväli 10 sekuntia, jotta gcamp6f-signaalit voisivat palata lähtötilanteeseen. Myös 6 sekunnin nollatilanne hylättiin. TTL laukaisee (0-5-0 volttia) tallentamaan epoch-aikaisia tapahtumia, jotka syntyvät LabJack USB DAQ-laitteen (U3-LV, LabJack Corporation) kautta. Laserkeilauksen aktivoinnin jälkeen odotimme 60 sekuntia ennen visuaalisen stimulaation aloittamista varmistaaksemme, että verkkokalvo sopeutui monifotonilaserin aiheuttamaan taustavalotasoon.

Optomotorinen vaste

yksittäiset 5 hiukkassuodattimen toukat sijoitettiin 35 mm: n petrimaljaan, joka sisälsi Danieau-liuosta. MacBook Pron (Apple) Duettonäytön (Kairos Technologies) kautta ohjatun iPhone 5: n (Apple) LCD-näytöllä näytettiin mustavalkoisia neliöaaltoritiliä (85% kontrasti, tilataajuus 0,33 sykliä/mm, ajallinen taajuus 3,5 sykliä/s), jotka liikkuivat 4 suuntaan (90° kulmaetäisyys) petrimaljan pohjassa. Visuaaliset ärsykkeet syntyivät Keynotessa (Apple). Jokainen toukka testattiin yhteensä 5 kertaa (jokainen koe kesti 6 sekuntia ja sen jälkeen 10 Sekuntia staattisia ritilöitä) ja pisteytettiin niiden kokeiden mukaan, joihin se vastasi (eli kalat kääntyivät ja uivat liikkuvien ritilöiden suuntaan). Toukkien käyttäytymistä seurattiin silmämääräisesti M165 FC-stereomikroskoopilla (Leica).

analyysi

funktionaaliset analyysit

in vivo kalsiumkuvaustiedot analysoitiin aiemmin kuvatulla tavalla 22,33. Yhteenvetona voidaan todeta, että funktionaalisia aikasarjoja käsiteltiin ennen analyysiä seuraavasti: aikasarjakuvat jokaisesta kokeesta korjattiin liikeradaksi jäykällä runkoalgoritmilla (SPM12; http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/), mediaani suodatettiin ytimen Kokolla 1 voxel tumman ja ammutun kohinan poistamiseksi ja spatiaalisesti tasoitettiin 2D Gaussin ytimellä = 2 voxelia signaalin kohinan parantamiseksi. Perustaso (B), joka korjaa matalataajuiset driftit, määritettiin käyttämällä kuutio-spline-algoritmia, joka ekstrapoloi solmujen välillä keskiarvona, joka saatiin 5 sekunnin aikakausien välisistä tiedoista. Molemmat suhteellisen signaalin voimakkuuden muutokset (ΔF = F-B; missä F = raaka fluoresenssi) ja normalisoidut signaalin intensiteetin muutokset laskettiin kullakin vokselilla. ΔF: ää käytettiin populaatiofunktionaalisissa tiedoissa (voxel-wise analysis), kun taas %ΔF/F0: tä käytettiin manuaalisesti määritellyillä kiinnostavilla alueilla (ROIs). Kullekin vokselille tai ROI: lle integraalivaste epookkivälillä laskettiin siten, että saadaan yksi vastemittari jokaisesta esitetystä ärsykeliikkeen suunnasta. Integraali kunkin aikakauden ikkuna on yhteenveto metrinen kestää kylläisyyttä vaikutuksia kalsium anturi kuin suurin signaalin muutos. Kunkin vokselin kynnysarvo hankintakuvajärjestyksessä määritettiin aikakausien välisten intervallien ja nollatilanteen aikana tapahtuneiden ΔF-muutosten varianssista, kynnys = 5 × SDs. Kaikki vokselit, jotka olivat vähintään kahden visuaalisen esitysajan ylittäviä, katsottiin visuaalisesti reagoiviksi ja alistettiin pidemmälle karakterisoinnille.

silmämääräisesti reagoivien vokselien suunta – ja orientaatioselektiivisten indeksien (DSI ja OSI)40 suunta-ja suuntausselektiivisyyden analysoimiseksi sovitettujen von-Misien tai Gaussin profileiden 41 perusteella laskettiin yhdessä niiden sopivuusarvion (R2) kanssa. DSI määriteltiin (Rpref-Rnull)/(Rpref + Rnull), jossa rpref, vaste suositeltuun suuntaan, oli integraalivaste suositellun suunnan epoch-intervalliin. Rnull laskettiin samalla tavalla integraalivasteena, joka on saatu suositellun suunnan vastakkaisesta suunnasta. OSI määriteltiin seuraavasti (Rpref-Rorth) / (Rpref + Rorth), jossa rpref, vaste suositeltuun orientaatioon, oli integraalinen vaste suositellun orientaatiovaiheen aikana. Rorth laskettiin vastaavasti ortogonaalisen orientaation herättämänä integraalivasteena. DSI-ja OSI-mittareihin liittyvien ristipuheiden ja ylisovitusten minimoimiseksi ryhdyttiin tiukkaan lähestymistapaan. Jotta vokselia voitaisiin pitää suuntaselektiivisenä (DS) tai suuntaselektiivisenä (OS), käytettiin toisensa poissulkevia kriteerejä: DS if DSi > 0.5 ja OSI < 0.5; ja OS IF OSI > 0, 5 ja DSi < 0, 5. Molemmissa tapauksissa sovituksen (R2) hyvyyden DSI: lle ja OSI: lle oli oltava >0, 8; näin sovitettujen käyrien avulla selitettiin vähintään 80% integraalivasteista. Yhden von-Mises-jakauman avulla sovitettiin DS-vokselien vasteet ja arvioitiin niiden ensisijainen liikekulman suunta sovitettavan käyrän keskipisteestä. Kahden von-misen summaa (180° kulmaetäisyyden päässä toisistaan) käytettiin OS-vokselien vasteiden sovittamiseen ja niiden suosittujen liikekulmien suunnan arvioimiseen asennettujen käyrien keskipisteistä. Ympyränmuotoinen varianssi laskettiin vertailua varten myös vaihtoehtoisena suuntauksen selektiivisyyden mittarina (ympyränmuotoinen varianssi < 0,4)41.

morfologiset analyysit

4 dpf-helmiäisessä, Kasperissa ja kide Tg: ssä kuvatun aivotilavuuden määrittämiseksi(elavl3:GCaMP6f) toukkia, laskimme gcamp6f+ vokselien määrän jokaisessa volumetrisessa kuvassa soveltamalla adjust>kynnysfunktiota, jota seurasi analyysi>histogrammi>list-komento ImageJ42: ssa. Tämän jälkeen saadut arvot kerrottiin yhden vokselin tilavuudella (0,415 × 0,415 × 0,631 µm3 = 1,086 × 10-1 µm3).

tilastolliset analyysit

tilastolliset testitulokset ilmoitetaan Figures and Figure legends-lehdessä. Tilastolliset analyysit ja testit tehtiin käyttäen Prism 6: ta (GraphPad) tai MATLAB R2014b: tä (MathWorks). Ennen tilastollisten testien suorittamista käytettiin kuvailevia tilastoja (esim.normaalitestejä, joilla selvitetään, ovatko arvot peräisin Gaussin jakaumasta, tai F-testiä varianssien vertailemiseksi) sopivan tilastollisen testin valitsemiseksi (ilmoitetaan Kuviolegendoissa yhdessä testitulosten kanssa). Tilastollisen merkitsevyyden kriteeriksi asetettiin p < 0, 05.