teksti

Metisilliiniresistentin Staphylococcus aureuksen (MRSA) hoito on vaikeutunut antibioottiresistenssin lisääntymisen vuoksi. MRSA-kannat ilmentävät penisilliiniä sitovaa proteiinia 2a (PBP2a), jota koodaa mecA, joka tuottaa resistenssin β-laktaameille suojaamalla reaktiivisen seriinin kapeassa, luoksepääsemättömässä halkeamassa, jolloin soluseinän synteesi voi jatkua antibiootin läsnä ollessa (1, 2). Keftobiproli ja keftaroliini ovat anti-MRSA-kefalosporiineja, jotka estävät pbp2a: ta terapeuttisesti hyödyllisinä pitoisuuksina. Keftobiprolin R2-ryhmä ulottuu pbp2a: n kapeaan halkeamaan päästäkseen aktiiviseen kohtaan, kun taas keftaroliinin sitoutuminen aiheuttaa allosteerisen muutoksen PBP2a: ssa paljastaen aktiivisen kohdan, johon toinen molekyyli sitoutuu (3, 4). Keftaroliinia on arvioitu kliinisissä tutkimuksissa, ja keftaroliini on FDA: n hyväksymä iho-ja ihonrakenneinfektioiden hoitoon, mukaan lukien MRSA: n (5-10) aiheuttamat infektiot.

ryhmämme aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että COL-kannan kulkeutuminen keftobiproliin valitsee resistenttejä mutantteja, joilla on pbp2a: n (11) mutaatioita. Tässä tutkimuksessa selvitetään, valitseeko keftaroliinin kulku myös samankaltaisia mutaatioita. Passage kokeet tehtiin kahdella eri MRSA taustat: Col, arkaainen homogeenisesti resistentti isolaatti vuodelta 1961, ja SF8300, heterogeenisesti resistentti contemporary USA300 MRSA kanta. COLnex ja SF8300ex, Coln: n ja SF8300: n mecA-negatiiviset johdannaiset, saatiin (12) erottamalla kromosomipoikkeava stafylokokkikasettikromosomi mec (SCCmec) (13). Villin tyypin mecA otettiin uudelleen käyttöön plasmidilla pyk20 (johdettu plasmidista pAW8 ja sisältää villin tyypin mecA kloonattu COL ) colnex ja SF8300ex passage tutkimuksia varten. Jos mecA välitti resistenssiä, plasmidin resistentin mutantin kovettumisen tai sen syöttämisen alttiiseen taustaan pitäisi johtaa fenotyypin häviämiseen tai vahvistumiseen, jolloin voidaan määrittää Mecan osuus resistenssiin. Tässä tutkimuksessa käytetyt kannat ja plasmidit on lueteltu taulukoissa 1 ja 2. Colnexia(pYK20) ja Sf8300exia (Pyk20) annosteltiin sarjatuotantona tryptisessä soijaliemessä, joka sisälsi kohonneita keftaroliinipitoisuuksia (Metsälaboratoriot) edellä kuvatulla tavalla (11).

28 päivän kuluttua Keftaroliinista kulkeutuneista Colnexista(pYK20) ja Sf8300exista(Pyk20) saatiin kaksi mutanttia, COLnexpT(pYK20COLT*) ja sf8300expt(pyk208300t*) (asteriski osoittaa keftobiprolin tai keftaroliinin valinnan aikana syntyneen plasmidin col-tai Sf8300-taustassa) (taulukko 1). MICs keftaroliinille, keftobiprolille ja muille β-laktaameille (Sigma-Aldrich) määritettiin liemilaimennusmenetelmällä CLSI-standardien mukaisesti (Taulukko 3) (15). COLnexpT (pYK20COLT*) osoitti voimakasta resistenssiä sekä keftaroliinille että keftobiprolille, ja MIC-arvot olivat 64 µg/ml ja 32 µg/ml. SF8300expT (Pyk208300t*) ilmaisi matalan tason resistenssiä läpikäyntipäivään 4 mennessä MIC-arvolla 4 µg/ml, joka pysyi muuttumattomana huolimatta 24 muusta kohdasta (Taulukko 3 ja kuva). 1). Aiemmin kuvattu colnexin(pYK20) (11) keftobiproli-passagoitu mutantti, COLnexpB(pYK20COLB*), osoitti voimakasta resistenssiä sekä keftaroliinille että keftaroliinille, ja kummankin MIC oli 64 µg/ml.

Plasmidissa mecA sekvensoitiin mutaatioiden varalta läpäisevissä kannoissa. Koska PBP: t ovat β-laktaamien kohde, myös pbp1, -2, -3 ja -4 sekvensoitiin. Lopuksi gdpp ja acrB sekvensoitiin, koska näiden geenien mutaatiot oli tunnistettu mecA-negatiivisessa Col: n keftobiproli-resistentissä mutantissa (16). Plasmidilla pyk208300t* (Pyk20 SF8300ex: stä siirrettynä keftaroliiniin) oli mecA: ssa yhden pisteen mutaatio (G: stä A: han koodaussekvenssiasennossa 1339), mikä johti nononyymiseen aminohappomuutokseen E447K. muissa PBP-geeneissä, acrB: ssä tai gdpP: ssä ei ollut mutaatioita (Taulukko 4).

yksi aminohappomuutos mecA: ssa e447: ssä näyttää avainrooli vastarinnassa. Sitä esiintyy keftaroliinipassidoidussa kol-solussa (muiden mutaatioiden joukossa) (11), se on ainoa mecA-mutaatio KEFTAROLIINIPASSIDOIDUSSA SF8300: ssa, ja sitä on raportoitu kliinisissä isolaateissa (17, 18). Rakenteellisesti E447 sijaitsee pbp2a: n penisilliiniä sitovassa domeenissa ja vuorovaikuttaa keftobiprolin R2-ryhmän ja muiden β-laktaamien (3, 19) kanssa. E447K aiheutti korkean keftobiproliiniresistenssin ja matalan keftaroliiniresistenssin COLnex-taustassa, mikä johtui todennäköisesti näiden kahden yhdisteen rakenteellisista eroista. Useat Meca-mutaatiot tuottavat korkean tason resistenssin molemmille antibiooteille (20). Myös geenitaustalla on merkitystä. Keftaroliiniin soluttautunut heterogeeninen SF8300 kehitti heikkotasoisen resistenssin keftobiprolille ja keftaroliinille e447k: lla (MIC 4 µg/ml). Tämä mutaatio on liittynyt kliinisten isolaattien heikkoon keftaroliiniresistenssiin (17).

johtopäätöksenä voidaan todeta, että joko keftaroliinin tai keftobiprolin kulkeutuminen aiheuttaa E447K-mutaation PBP2a: ssa, mutaation, joka löytyy keftaroliiniresistenteistä kliinisistä isolaateista, mikä korostaa sen merkitystä resistenssin fenotyypin välittäjänä (17, 18). Vaikka koko genomin sekvensointia ei tehty, mikä rajoittaa tätä tutkimusta, muilla geeneillä kuin mecA on merkitystä, koska resistenssin taso vaihteli Col-ja SF8300-taustojen välillä, kun e447k-mutaatio otettiin käyttöön ja erittäin resistentillä passaged COL-mutantilla ei ollut mecA-mutaatioita. Vaikka todennäköisesti muitakin mutaatioita on, pbp4: ää ja GdpP: tä koodaavien geenien mutaatiot näyttävät olevan erityisen tärkeitä, sillä niitä on toistuvasti tunnistettu keftobiproli – ja keftaroliinimutanteissa. Näiden ja muiden geenien roolia tutkitaan aktiivisesti.