Coxsackievirus B3 (CVB3) on Picornaviridae-heimoon kuuluva enterovirus. Sitouduttuaan coxsackievirukseen ja adenoviruksen reseptoriin (6, 64) viruksen RNA siirtyy sytoplasmaan, jossa se muuntuu isännän translaatiokoneiston avulla yhdeksi polyproteiiniksi. Polyproteiini käsitellään sitten proteolyyttisesti viruksen proteaaseilla, jolloin saadaan kaikki viruksen rakenteelliset ja rakenteettomat proteiinit. Viruksen koodaama RNA-riippuvainen RNA-polymeraasi transkriptioi negatiivisjuosteisia viruksen RNA: ita, jotka toimivat malleina useiden jälkeläisten genomien synteesissä. Viruspakkauksen jälkeen virus vapautuu, mahdollisesti viruksen koodaaman 2B-proteiinin (67) vaikutuksesta. Replikaatioprosessin ja viruksen jälkeläisten vapautumisen aikana tapahtuu sytopaattinen vaikutus (CPE) ja isäntäsolu loukkaantuu, mikä johtaa lopulta elinkelpoisuuden menetykseen.

useiden isäntäsolujen prosessit muuttuvat picornaviruksen loisimisen aikana. Viruksen proteiini 2apro pilkkoo suoraan eukaryoottisen aloitustekijän 4 gamma (eIF4G). Tämän translaation alkutekijän pilkkoutuminen ei ainoastaan poista cap-riippuvaista mRNA-käännöstä (19), vaan pilkkoutumistuotteiden uskotaan stimuloivan rajaamattoman mRNA: n kääntämistä, kuten soluton picornaviruksen genomi (43), joka käyttää uudenlaista sisäistä ribosomien sisääntulomekanismia proteiinikäännöksen aloittamiseen (31, 76). Poliovirusproteiinien 2Apro ja 3cpro on osoitettu pilkkovan TATA-sitovan proteiinin, ja 3Cpro sulkee myös RNA-polymeraasien I, II ja III (11, 72, 74) transkription. 3cpro pilkkoo picornavirusinfektion aikana myös transkriptiotekijät TFIIIC (10), CREB (73) ja Oct-1 (75). CVB3-proteiinin 2B on osoitettu muuttavan endoplasmaista retikulumia ja plasman kalvojen läpäisevyyttä (14) aiheuttaen sytosolivapaan kalsiumpitoisuuden (28, 67) ja kalvoleesioiden lisääntymistä, mikä voi helpottaa viruksen jälkeläisten vapautumista. Ionigradientit romahtavat (40, 52) ja fosfolipaasiaktiivisuus muuttuu (24, 29). HeLa-solujen cvb3-infektio johtaa kahden soluproteiinin tyrosiinifosforylaatioon 4 tunnin kuluttua tartunnasta, ja näiden fosforylaatioiden estäminen vähentää merkittävästi viruksen jälkeläistuotantoa (27). On selvää, että infektio on dynaaminen soluprosessi, jossa viruksen ja isäntäproteiinien oikea-aikainen vuorovaikutus määrittää sekä viruksen että isäntäsolujen lopputuloksen.

nyt on selvää, että kaspaasi-entsyymien kysteiiniproteaasit ovat apoptoottisen solukuoleman keskeisiä efektorimolekyylejä. Aktivoiduttuaan kaspaasit hajottavat spesifisiä substraatteja, kuten poly (ADP-riboosi) polymeraasin (PARP) (35), DNA: n pirstoutumistekijän (DFF) (37), gelsoliinin (34), lamiinin a (58), steroleja säätelevää elementtiä sitovat proteiinit (68), α-fodriinin (12, 66), fokaalisen adheesiokinaasin (71) ja mdm2 (18). Tällaiset pilkkoutumistapahtumat johtavat tärkeisiin muutoksiin normaaleissa homeostaattisissa soluprosesseissa ja vastaaviin solun morfologisiin-rakenteellisiin muutoksiin.

monilla viruksilla on biokemiallisia mekanismeja, jotka kiertävät ja / tai indusoivat apoptoosia soluissa, joissa ne asuvat (katsaukset, KS.viitteet 49 ja 60). Eri virukset vuorovaikuttavat apoptoottisen kuolintien eri vaiheissa. Virukset ovat kehittäneet strategioita, jotka kohdistuvat FAS-ligandifas-tai tuumorinekroositekijän alfa (TNF-α)-TNF-reseptorisignaalikompleksiin, BCL-2-sääntelyviranomaisten perheeseen tai teloittajien caspase-perheeseen (49, 60). CVB3-infektoituneiden solujen kuolinmekanismit ovat vielä selvittämättä; apoptoosin induktiosta picornaviruksen infektoimissa soluissa on kuitenkin vain vähän morfologista näyttöä. Theilerin hiiri-enkefaliittiviruksella (32, 65) ja polioviruksella (63) saatu näyttö on osoittanut, että picornaviruksen infektoimat solut läpikäyvät apoptoosin morfologisten kriteerien perusteella, mukaan lukien ydinkodensaatio ja DNA: n pirstoutuminen.

sen määrittämiseksi, aktivoituvatko kaspaasit ja vastaavatko ne CPE: tä, joka on havaittu CVB3-infektion jälkeen, HeLa-solut (American Type Culture Collection, Rockville, Md.) olivat joko infektoituneita, moninaisella infektiolla (MOI) 5, cvb3: lla (anteliaasti toimittanut Charles Gauntt, University of Texas Health Sciences Center, San Antonio) tai sham, jota hoidettiin minimum essential mediumilla (mem), josta puuttui sikiön naudan seerumi (FBS) 45 minuutin ajan. Solut pestiin fosfaattipuskuroidulla keittosuolaliuoksella (PBS), ja sen jälkeen korvattiin täydellinen MEM, jossa oli 10% FBS: ää. Positiivinen apoptoosikontrolli koostui HeLa-soluista, joita käsiteltiin valoherkistäjäbentsoporfyriinijohdannaisella MONOASIDIRENGAS A: lla (BPD-MA) 1 tunnin ajan ja altistettiin sen jälkeen näkyvälle valolle edellä kuvatulla tavalla (22, 23). Viljelmät tutkittiin ja korjattiin 0, 1, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ja 12 h tartunnan jälkeen. Solut pestiin kaksi kertaa kylmässä PBS: ssä ja lysoitiin 1 ml: aan lyysipuskuria (20 mM Tris , 137 mM NaCl, 10% glyserolia, 1% Nonidet P-40, 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 0, 15 U aprotiniinia / ml) 75 cm2: n viljelyaluetta kohti. 20 min jään inkuboinnin jälkeen supernatantit kerättiin sentrifugoinnin jälkeen 10 000 ×g: n lämpötilaan ja varastoitiin -20°C: n lämpötilaan muita biokemiallisia analyysejä varten.

CVB3-virusproteiinien, jälkeläisvirusten tuotannon ajallista rakennetta ja HeLa-solujen degeneratiivisten morfologisten muutosten kehittymistä tarkasteltiin isäntäsolukuoleman proteiinien tutkimuksen yhteydessä. Solulysaattinäytteet erotettiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Proteiinit siirrettiin nitroselluloosaan (Hybond ECL nitroselluloosakalvo; Amersham). Kalvoja inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämmössä estopuskurissa (PBS, jossa 0, 1% Tween 20: tä ja 5% rasvatonta maitojauhetta). Kahden pesun jälkeen pesupuskurissa (PBS, jossa 0.1% Tween 20), kalvot inkuboitiin vasta-aineella CVB3:a vastaan (kanin polyklonaalinen anti-CVB3, 1: 1 000; tarkat Kemikaalit). Kalvot pestiin kolme kertaa pesupuskurissa ja inkuboitiin aasiantiini-immunoglobuliini-toissijaisella vasta-aineella (Amersham). Kalvot pestiin kolme kertaa, ja piparjuuriperoksidaasi-konjugoidut sekundaariset immunoglobuliinit havaittiin tehostetulla kemiluminesenssimenetelmällä (ECL, Amersham) ja altistettiin Hyperfilmille (Amersham) autoradiografia-kalvolle. Viruksen proteiinisynteesin merkittävää lisääntymistä voidaan havaita 3-5 tunnin kuluttua infektiosta (Kuva.1b). Viruksen proteaasit cleave virus sekä isäntäproteiineja varhain infektion jälkeen. Hiiren monoklonaalisella anti-eif4g:llä tehdyissä immunoblotianalyyseissä (1: 1 000; Transduktiolaboratoriot) todettiin, että eif4g: n pilkkoo virusproteaasi 2A 1 tunnin kuluessa tartunnasta, jolloin 220 kDa: n proteiini häviää 5 tunnin kuluttua tartunnasta (Kuva. 1C). CVB3: n määrä solun supernatantissa (vapautunut virus) määritettiin HeLa-solujen yksikerroksista agar overlay plakin määritysmenetelmällä edellä kuvatulla tavalla (3). Supernatanttinäyte laimennettiin sarjalaimennettuna 10-kertaiseksi, laimennokset päällystettiin HeLa-solujen 90-95-prosenttisilla konfluenttikerroksilla kuusikuoppalevyillä (Costar) ja päällekkäisiä soluja inkuboitiin 1 tunnin ajan (5% CO2, 37°C). Ei-sitovaa virusta sisältävä väliaine poistettiin, ja lämmin täydellinen MEM, joka sisältää 0,75% agaria, päällystettiin jokaiseen kaivoon. Levyt inkuboitiin 36-48 tuntia (5% CO2, 37°C), kiinnitettiin Carnoyn kiinnikkeellä (95% etanoli–etikkahappo) ja värjättiin 1% kidevioletilla. Jälkeläisvirusta esiintyi supernatantissa 1-5 tunnin peruspitoisuuksina. 6 tunnin kuluttua tartunnasta supernatanttiviruksen pitoisuus oli havaittavissa, ja eksponentiaalinen viruksen tuotanto alkoi 9 tunnin kuluttua tartunnasta plakkimääritysten perusteella (Kuva. 1 A). HeLa-soluissa ilmeni selviä morfologisia muutoksia, kuten solujen tiivistymistä, pyöristymistä ja vapautumista viljelmästä yksikerroksisena 6-7 tunnin kuluttua tartunnasta, kuten kontrastimikroskopiassa todetaan(Kuva. 1D).

sen määrittämiseksi, aktivoituuko isäntäsolukuolemakoneisto CVB3-infektion jälkeen, tehtiin immunoblottianalyysi tiettyinä ajankohtina kerätystä lysaatista. Kaspaasi 3, joka esiintyy soluissa prekursoriproteiinina, jonka molekyylimassa on 32 kDa, on ensisijainen molekyyli, joka osallistuu solukuoleman toteuttamiseen. Hiiren monoklonaalisen anti-kaspaasi 3:n (1: 1 000; Transduktiolaboratorio) avulla määritettiin, että infektoimattomat solut sisälsivät 32-kDa: n esiasteproteiinia. Cvb3-infektion jälkeen 32 kDa: n esiasteproteiinin taso alkoi pienentyä 7-8 tunnin kuluttua tartunnasta, ja se oli lähes täysin havaitsematta 12 tunnin kuluttua tartunnasta (Kuva.2). Sen määrittämiseksi, oliko köyhdytetty pro-caspase 3 käsitelty proteolyyttisesti yksiketjuisesta tsymogeenistä sen aktiiviseksi kaksiketjuentsyymiksi, HeLa-solulysaatteja inkuboitiin caspase 3: n fluoresoivilla substraateilla edellä kuvatulla tavalla (23). Solulysaatteja inkuboitiin lyhyesti reaktiopuskurilla (20 mM Tris , 137 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 10% glyserolia), joka sisälsi 100 µM kaspaasi 3-substraattia asetyyli-Asp-Glu-Val–Asp-7-amino-4-metyylikumariinia (Ac-DEVD-AMC) (Calbiokhem, Cambridge, massa.) tai Z-Asp-Glu-Val–Asp-7-amino-4-trifluorimetyylikumariini (Z-DEVD-AFC) (Enzyme Systems Products, Livermore, Calif.). Reaktioseosta inkuboitiin 37°C: ssa 2 tunnin ajan, ja AMC: n tai AFC: n fluoresenssiärsytys 380 nm: ssä tai 400 nm: ssä mitattiin 460 nm: ssä tai 505 nm: ssä Sytofluori2350 sytofluorometrillä (Perseptive Biosystems, Burlington, Ontario, Kanada). Tällä menetelmällä kaspaasi 3: n aktiivisuus havaittiin 5 tunnin kuluttua infektiosta. Kaspaasi 3: n aktiivisuuden lisääntyminen 7 tunnista 10 tuntiin infektion jälkeen, jolloin aktivaation enimmäismäärä saavutettiin, säilyi 12 tuntiin infektion jälkeen (kuva. 2). Tämä proteaasimääritys osoitti, että kaspaasi 3 oli aktiivisessa muodossa infektoiduissa soluissa ja että se kykeni käsittelemään proteolyyttisesti muita kaspaaseja ja substraatteja.

Kaspaasi 3 pilkkoo spesifisiä substraatteja asparagiinihappojäännöksissä (42). PARP, DNA: n korjaukseen osallistuva ydinproteiini (13, 69), on osoitettu aktivoituneen kaspaasi 3: n sekä muiden kaspaasien (35) substraatiksi. Apoptoottisissa soluissa PARP pilkkoutuu 116 kDa: n proteiinista, jolloin saadaan 85 kDa: n ja 25 kDa: n fragmentteja, jotka määritetään proteiinin amino-ja karboksyylitermiini-vasta-aineilla. CVB3-infektoituneissa HeLa-soluissa PARP:n hajoaminen, jossa esiintyi 85 kDa: n fragmentti, oli havaittavissa 9 tunnin kuluttua infektiosta, ja 116 kDa: n peptidipitoisuus väheni edelleen 10 ja 12 tunnin kuluttua infektiosta, mikä määritettiin immunoblottianalyysillä hiiren monoklonaalisella anti-PARP: llä (1: 2 000; Biomoli) (Kuva. 3).

dff on sytosoliproteiini, jonka kaspaasi 3 (37) voi pilkkoa. Kun proteiini on halkaistu, se vapauttaa endonukleaasin, joka siirtyy tumaan, jossa se voi halkaista DNA: n internukleosomaalisissa kohdissa, mikä johtaa DNA: n pirstoutumiseen (16). Aiemmin on osoitettu, että internukleosomaalinen DNA: n hajoaminen on picornavirusinfektion soluominaisuus (32). Määritettynä käyttämällä kani polyklonaalista anti-DFF: tä (runsaasti Xiaodong Wang, University of Texas Southwestern Medical School, Dallas), DFF pilkkoutuu 45-kDa-proteiinista, joka tuottaa 30-kDa-fragmentin, joka alkaa 9 tunnin kuluttua tartunnasta, jatkuvalla prosessoinnilla ja 45-kDa-proteiinin menetyksellä 10-12 tunnin kuluttua infektiosta (Kuva. 3).

sen määrittämiseksi, tuottavatko kaspaasit suoraan picornavirusinfektion jälkeisen tyypillisen CPE: n vai aktivoituvatko ne morfologisten muutosten jälkeen, soluja käsiteltiin yleisellä kaspaasi-inhibiittorilla bentsyylioksikarbonyyli-Val-Ala-Asp-fluorometyyliketonilla (ZVAD.fmk). Zvadin kantaliuos (100 mM dimetyylisulfoksidissa).fmk (Bachem) laimennettiin täydellisessä MEM-pitoisuudessa 0-200 µM, ja laimennoksia inkuboitiin soluilla 30 minuuttia ennen infektiota tai valohoitoa. Cvb3-infektion jälkeen solut pestiin PBS: llä ja täydellinen MEM, joka sisältää 10% FBS: ää ja tuoretta ZVAD: tä.tämän jälkeen korvattiin fmk (0-200 µM). Tämän peptidin on osoitettu estävän morfologisten muutosten induktiota useiden apoptoottisten ärsykkeiden avulla (46, 54). ZVAD.fmk, jonka pitoisuudet olivat 50, 100 ja 200 µM, esti sekä kaspaasiaktiivisuuden että PARP: n ja DFF: N pilkkoutumisen BPD-MA – soluissa ja kevyesti käsitellyissä HeLa-soluissa (positiivinen kontrolli apoptoosille) (Kuva. 4). Cvb3-infektoituneissa HeLa-soluissa estäjä esti osittain PARP: n ja DFF: N pilkkoutumisen 50 ja 100 µM pitoisuuksina (Kuva. 4). Suurimmalla inhibiittoripitoisuudella (200 µM) CVB3-käsitellyissä soluissa ei havaittu PARP-tai DFF-pilkkoutumisfragmentteja 10 tunnin kuluttua infektiosta. Kaspaasi-pilkkoutuminen rakenneproteiineista, kuten aktiinista, gelsoliinista, lamiini B: stä ja fokaalisesta adheesiokinaasista on vastuussa apoptoosin induktion jälkeen havaituista morfologisista muutoksista (42, 45). 2 tunnin kuluttua BPD-MA: n valoaktivoinnista hela-solut kondensoituivat, niillä oli laaja kalvon blebbaus ja ne vapautuivat yksikerroksisesta (Kuva.5). Zvad-pitoisuuksien kasvaessa.fmk, tämä apoptoottinen fenotyyppi ei ollut ilmeinen, ja solut säilyttivät morfologian samanlaisena kuin kontrollisolut (Kuva. 5). CVB3-infektoituneet HeLa-solut tiivistyivät ja vapautuivat yksikerroksisesta, mutta niissä ei esiintynyt kalvon blebbingiä 10 tunnin kuluttua infektion jälkeen (kuva. 5). Zvad estää caspasen toiminnan.fmk Ei 200 µM: n pitoisuuksina muuttanut sytopaattista fenotyyppiä, vaikka substraattien (DFF ja PARP) pilkkoutuminen estyikin.

Picornaviridae-heimon virusten klassinen piirre on infektion jälkeinen solujen CPE. Polioviruksen (17) monistamiseen tarkoitetun ekstraneuraalisen soluviljelmän keksimisen jälkeen on havaittu degeneratiivisia muutoksia solujen morfologiassa. Ensimmäinen kuvattu Robbins et al. (48) vuonna 1950 näitä sytopaattisia muutoksia ovat ydinkutistuminen, kromatiinin tiivistyminen, solujen pyöristäminen ja vapautuminen yksikerroksesta, ja lopulta eteneminen asidofiiliseksi sytoplasmaksi, ydinpyknoosi ja ydinkromatiinin pirstoutuminen (karyorrhexis) (47).

viimeaikainen solukuolemamekanismien ymmärtäminen asettaa vaiheen isäntäsolukuolemaproteiinien ja niiden mahdollisen roolin tutkimiselle CVB3-infektion CPE: ssä. Monet virukset estävät tai aktivoivat solukuolemaa, strategioita, jotka välittävät erottuvia näkökohtia soluvaurioita, tulehdusreaktioita tai viruksen pysyvyyttä. Kuten edellä on todettu, aiemmissa picornavirustutkimuksissa on paljastettu apoptoottisen solukuoleman morfologisia piirteitä, kuten solujen kutistumista, DNA: n pirstoutumista ja ydinkodensaatiota (21, 32, 47).

Caspase 3, kysteiiniproteaasi, jonka homologia on theCaenorhabditis elegans protein CED-3 (77), on yksi solukuoleman toteutusvaiheeseen osallistuvista keskeisistä proteiineista. Useiden ärsykkeiden, kuten Fas: n, TNF: n, etoposidin, staurosporiinin, fotodynaamisen hoidon, ionisoivan säteilyn ja kasvutekijän vieroituksen aiheuttama apoptoosi liittyy pro-caspase 3: n käsittelyyn ja sen jälkeiseen aktivaatioon.(15, 23, 30, 33, 51). Kun cvb3-infektion jälkeen on kulunut 7-8 tuntia, pro caspase 3-proteiini on tyhjentynyt, ja kaspaasiaktivaatiomääritykset ovat osoittaneet, että tämä proteiini pilkkoutuu aktiiviseen muotoonsa. Useat proteiinit voivat aktivoida kaspaasi 3: A, mukaan lukien kaspaasi 8 (TNF-tai Fas-reseptorien välityksellä) (55), sytotoksisten lymfosyyttien granzyme B (62) ja kaspaasi 9 (mitokondrioiden sytokromi c: n vapautumisen ja apoptoottisten proteaasiaktivaatiotekijöiden yhdistymisen kautta) (36). Aktivoiduttuaan kaspaasi 3 voi hajottaa tiettyjä substraatteja, mikä puolestaan johtaa rakenteellisiin muutoksiin ja soluprosessien homeostaattisen säätelyn menetykseen. Aktivoituneiden kaspaasien on osoitettu pilkkovan lukuisia proteiineja. Kaspaasi 3: n aktivaation mukaisesti sekä PARP että DFF halkeavat CVB3-infektion jälkeen. Kaspaasiaktivaatio ja DNA: n pirstoutuminen liittyvät suoraan DFF: N pilkkoutumisen kautta (37). Dff on ihmisen sytosolitekijä, joka koostuu kahdesta 45 ja 40 kDa: n alayksiköstä, joista suurempi hajoaa pienemmiksi polypeptideiksi kaspaasi 3: n vaikutuksesta. Viimeaikaisissa tutkimuksissa Enari et al. (16) hiiren lymfoomasoluista eristettiin endonukleaasi, kaspaasiaktivoitu DNaasi (CAD). Dff-proteiinin hiiriekvivalentti oli eristetty ja sitä kutsuttiin CAD: n estäjäksi (50). CAD: n inhibiittorin (dff) caspase 3-pilkkominen mahdollistaa CAD: n translokaation ja DNA: n hajoamisen. DFF halkaistaan 9 tunnin kuluttua tartunnasta, jolloin syntyy 30 kDa: n fragmentti (Kuva. 3), joka voidaan edelleen käsitellä 11-kDa-fragmentiksi (37). PARP sijaitsee tumassa ja osallistuu DNA: n korjaukseen. PARP: n pilkkoutuminen alkaa 9 tunnin kuluttua infektion jälkeen, mikä viittaa siihen, että kun kaspaasit aktivoituvat sytosolissa, ne pääsevät käsiksi tuman paikallisiin substraatteihin.

Huom.kaspaasi-inhibitio yleisen kaspaasi-inhibiittorin zvad: n kanssa.fmk ei estänyt cvb3: n aiheuttamaa CPE: tä infektion jälkeen. 6-7 tunnin kuluttua tartunnasta CPE tuli ilmi kontrastimikroskopialla cvb3-infektiomallissamme. Varjoainemikroskopialla havaittu aika infektion ja CPE: n ilmaantumisen välillä oli zvad: ssä Yhdenmukainen.fmk-pitoisuudet 50-200 µM. Sen lisäksi, että se ei vaikuta CPE: n saavuttamiseen kuluvaan aikaan, ZVAD.fmk-hoidon tuloksena syntyi soluja, joiden morfologinen ulkonäkö muistuttaa hoitamattomien, infektoituneiden solujen (Fig. 5). Vaihtoehtoisena menetelmänä apoptoosin indusoimiseksi HeLa-soluissa (22, 23) käytimme BPD-MA-hoitoa ja valoa. Kaspaasiaktivaation estäminen zvad-estäjällä.fmk esti apoptoottisen fenotyypin (Kuva. 5). Näistä tuloksista päätellään, että kaspaasiaktiivisuus ja substraattien pilkkoutuminen eivät selitä picornavirusinfektion tyypillistä CPE: tä, vaan aktivoituvat morfologisten muutosten jälkeen.

viruksen replikaatiosyklin ja isäntäsolun kuolintien aktivaation leikkauspiste on vielä määrittelemättä. Pikornavirusinfektio johtaa pian solujen RNA: n ja proteiinisynteesin estymiseen (19, 74). Pikornaviruksen aiheuttamien metabolisten muutosten ja viruksen aiheuttaman CPE: n välisiä suhteita koskevat varhaiset tutkimukset osoittivat, että proteiini-ja RNA-synteesin esto ei liittynyt suoraan solujen morfologisiin muutoksiin (4). Proteiini-ja RNA-synteesin estäjät viivästyttivät solukuolemaa, mutta soluissa esiintyi vähemmän morfologisia muutoksia kuin picornaviruksen infektoimissa soluissa (5). Proteiini-ja RNA-synteesin estäminen millä tahansa monista aineista, kuten aktinomysiini D: llä, puromysiinillä ja kurkkumätätoksiinilla, johtaa apoptoosiin (39). Poliovirusinfektiojärjestelmissä tehdyt varhaiset tutkimukset osoittivat, että puromysiini, viruksen sekä isäntäproteiinien translaation estäjä, viivästyttää sytopaattisten muutosten alkamista, mikä viittaa siihen, että tietyt virusproteiinit voivat olla suoraan sytotoksisia (4). MOI: n lisääminen johtaa CPE: n nopeampaan alkamiseen (julkaisemattomat havainnot), vaikka lähes kaikki isäntäproteiinin translaatio sammutetaan 3 tunnin kuluessa suhteellisen alhaisella MOI: lla (25), kuten tässä tutkimuksessa (MOI = 5). Äskettäin on osoitettu, että coxsackieviruksen ja polioviruksen koodaama 2B-proteiini liittyy solukalvon jakeisiin, mukaan lukien plasmalemma ja endoplasminen retikulumi, ja häiritsee ionien liikettä, mukaan lukien Ca2+: n liike sytosoliin (1, 67). Ca2+ – tulva tapahtuu apoptoosissa (7, 44), mutta ei ole selvää, tapahtuuko tulva ennen kaspaasiaktivaatiota vai sen jälkeen. Kaspaasien ionivaatimuksia tutkimalla on todettu, että kalsiumionipitoisuudella on vain vähän vaikutusta kaspaasin aktiivisuuteen (56). Varhainen kalsiumtulva coxsackievirusinfektion jälkeen voi johtua 2B-proteiinin vaikutuksesta kalvojen läpäisevyyteen, ja havaittu suuri myöhäinen kalsiumtulva (>6 h infektion jälkeen) (67) voi olla kaspaasiaktivaation loppupään vaikutus.

infektion alkuvaiheissa viruksen olisi edullista estää isäntäsolukuolemia, jolloin viruksen jälkeläisten tuotanto olisi maksimaalista. Viruksen elinkaaren loppuvaiheissa viruksen olisi myös hyödyllistä aiheuttaa apoptoosia nekroosin sijaan. Tällainen kuolinmekanismi on mahdollinen keino, jolla virus kiertää isäntäimmuniteettijärjestelmää sen vapautuessa ympäröivään kudokseen. Apoptoosille on ominaista sairastuneiden solujen nopea fagosytoosi ilman proinflammatoristen sytokiinien (53) vapautumista.

viruksilla on osoitettu olevan yhteisvaikutuksia apoptoottisen reitin eri tasoilla. Useat gammaherpesvirukset (mukaan lukien Kaposin sarkoomaan liittyvä ihmisen herpesvirus 8) sekä tuumorigeeninen molluscum contagiosum-virus sisältävät FLICE-inhibitorisia proteiineja, jotka ovat vuorovaikutuksessa FAS-adapteriproteiinin FADD kanssa ja kilpailevat kaspaasi 8: n aktivoitumisen ja myöhemmän aktivaation estämisestä (61). Lehmärokkoviruksen Serpin CrmA: n ilmentyminen estää kaspaasi 8-välitteisen aktivaation alavirtaan tulevissa kaspaaseissa, kuten caspase 1: ssä ja caspase 3: ssa (55). IAP (apoptoosin estäjillä) – proteiinit muodostavat baculovirusten ilmaiseman proteiiniperheen, joka estää virusinfektiosta tai kaspaasi 1: stä aiheutuvan apoptoosin (78). Lisäksi on löydetty useita BCL-2-proteiiniperheen virushomologeja (2, 8, 20, 70). Adenovirus (9, 20, 57), Afrikkalainen sikaruttovirus (41) ja Epstein-Barr-virus (26, 41, 59) koodaavat proteiineja (E1B-19k, LMWS-HL ja BHRF1), joilla on sekvenssi homologiassa BCL-2-perheen eloonjäämistä edistävien geenien kanssa.

apoptoosia suoraan indusoivien virusproteiinien tunnistamista ei ole dokumentoitu yhtä laajasti kuin solukuolemaa estävien virusproteiinien tunnistamista. Lentivirukset ihmisen immuunikatovirus ja ihmisen T-solujen leukemiavirus tyyppi 1 koodaavat transkription säätelijät Tat ja Tax, joiden on osoitettu lisäävän FAS ligandin ilmentymistä ja vähentävän BCL-2-perheenjäsenten ilmentymistä (79, 80). Ihmisen adenoviruksen koodaamat E1A -, E3-ja E4-geenituotteet aiheuttavat solukuoleman ilmentymisen jälkeen soluviljelmässä. Adenoviruksen kuolemaa aiheuttavat geenit ilmenevät infektiokierron loppupuolella ja lopulta hukuttavat viruksen koodaamat kuolemaa estävät geenit (38).

aineistomme osoittaa, että kaspaasi 3: n aktivaatio seuraa eikä edeltää cvb3: n aiheuttamia degeneratiivisia morfologisia muutoksia infektoituneissa HeLa-soluissa. Aktivoidut kaspaasit käsittelevät tiettyjä substraatteja, mukaan lukien PARP ja DFF. Kaspaasiaktiivisuuden esto ei kuitenkaan poista viruksen infektoimien solujen morfologista ulkonäköä (CPE), joka määritetään kontrastimikroskopialla. Kaspaasin käsittely ja substraattien pilkkominen voi olla tärkeää infektoituneiden solujen normaalien homeostaattisten prosessien lopullisessa muutoksessa ja se voi helpottaa viruksen infektoimien solujen lopullista puhdistumaa. Viruksen proteaasit 2A, 3C ja 3CD voivat pilkkoa spesifisiä rakenneproteiineja, mikä johtaa CPE: n mukaisiin morfologisiin muutoksiin kaspaasien toimintaa vastaavalla tavalla.kaspaasit pilkkovat erilliset substraatit saadakseen aikaan erillisen apoptoottisen fenotyypin.

alaviitteet

i xmlns:HWP=”http://schema.highwire.org/Journalsai 9. i xmlns:hwp=”http://schema.highwire.org/Journal hyväksytty 21.

• Copyright © 1998 American Society for Microbiology