tutkimussuunnitelma

VX-765-tutkimus: viisi kuukautta vanhat vehicle-injected WT (WT + vehicle; n = 18) ja J20-hiiret (J20 + vehicle: n = 14) ja VX-765-injected J20-hiiret (J20 + VX-765: n = 13) hiiriä arvioitiin pituussuunnassa viidessä eri aikapisteessä: lähtötilanne ennen hoitoa (lähtötilanteessa hoitamaton J20 ryhmiteltiin yhteen; n = 19), kolmen IP-injektion jälkeen viikossa VX-765: llä tai kantaja-aineella (hoito 1), kuuden lisäinjektion jälkeen 2 viikon aikana (hoito 2), 4 viikon elimistöstä poistamisjakson jälkeen (wo) ja kolmen lisäinjektion jälkeen 1 viikon aikana (hoito 3) (kuva. 1 A). Kaikki testatut eläimet otettiin mukaan analyyseihin, paitsi jos A) eläin kuoli kokeen aikana tai b) eläin ei reagoinut käyttäytymiseen. Tutkimuksessa käytettiin yhteensä 25 pentuetta, jotka jakautuivat neljään eri kohorttiin ja joita testattiin eri aikoina. Kolme näistä kohorteista testattiin NOR-ja open field-testeillä, kun taas kohorttia 4 käytettiin Barnes mazeen. Kun eläimille tehtiin lähtötason testit sen varmistamiseksi, että J20-eläimillä oli käytöshäiriöitä, J20-eläimet jaettiin satunnaisesti joko kantaja-aineeseen tai VX-765-hoitoon käyttäytymistehosta riippumatta. Kaikista käytetyistä eläimistä neljällä J20-hiirellä ei havaittu käytöshäiriöitä kokeen alussa, eikä niitä käytetty. Kaksi J20 + vehicle-hiirtä ei liikkunut lainkaan kokeen aikana ja niiden käyttäytymistiedot suljettiin pois; näitä eläimiä kuitenkin pidettiin, ja niitä käytettiin edelleen ruumiinavauksessa.

Casp1-validointitutkimus: VX-765: n Casp1− spesifisten vaikutusten validoimiseksi J20− hiiret luotiin Casp1 – / – – taustalle. Tutkimuksessa käytettiin 73 hiirtä (n = 12-13 per genotyyppi, kuusi eri genotyyppiä), jotka kaikki kasvatettiin koeputkihedelmöityksellä (IVF) 35 luovuttajanaaraasta. Jalostusta koskevat tiedot on kuvattu alla olevassa eläinkokeet-osiossa. Kaikkien hiirten käyttäytymistä arvioitiin 7-8 kuukauden iässä, eikä yhtäkään eläintä suljettu pois tästä tutkimuksesta.

kaikki hiiret lopetettiin ja käsiteltiin 8 kuukauden ikäisinä. Käyttäytymisen pisteytys sokaistiin hiiren genotyypiltä ja hoidolta, ja kaikki eläimet satunnaistettiin joko biokemiallista tai histologista analyysiä varten ja analysoitiin sokkona.

VX-765, VRT-043198 IC50 assays on rekombinant caspases

eläinkokeet

kaikki eläinkokeet noudattivat Canadian Council on Animal Care-ohjeita, ja McGillin yliopiston Eläintenhoitokomitea hyväksyi ne. J20-siirtogeenisen hiiren linja (JAX-Kantanumero. 006293, Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, USA) ilmaisee Ruotsin (670/671KM→NL) ja Indianan (717V→F) ihmisen APP-mutaatiot pdgf-ßpromoterin alla. Koiras J20-hiiriä käytettiin kasvattajina ja niiden siittiöitä IVF-pesäkkeiden laajentamiseen.

genotyypit määritettiin häntäbiopsialla ja RT-PCR: llä. Hiiriä pidettiin ryhmässä (2-4 eläintä häkissä) tavallisissa makrolonihäkeissä 12 tunnin käänteisvalon ja pimeyden syklissä ja valvotuissa ympäristöolosuhteissa. Ruokaa ja vettä oli saatavilla ad libitum.

VX-765 (Adooq Bioscience, Irvine, CA) liuotettiin 20-prosenttisesti cremoforiin dH2O: ssa (Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Kanada) ja annettiin intraperitoneaalisesti. Ajoneuvoilla käsitellyt J20-ja WT-hiiret saivat ainoastaan cremoforia.

veri–aivoesteen läpäisevyysanalyysi

viiden kuukauden ikäiset J20-ja WT-hiiret nukutettiin isofluraanilla ja oikea kaulavaltimo erotettiin toisistaan. Kaulavaltimon seinämää pitkin tehtiin pieni viilto ja sisäisen kaulavaltimon suuaukkoon työnnettiin mikrokatetri. Katetri oli kiinnitetty paikalleen ompelulangalla. VX−765 (50 mg kg−1) infusoitiin 50 µl min-1 (kokonaistilavuus 90-120 µl). Mikrokatetriin jätettiin vielä 5 min diffuusion mahdollistamiseksi, minkä jälkeen veri kerättiin sydämen sisäisellä pistolla. Hiirtä täydennettiin jääkylmällä suolaliuoksella ja hippokampus ja aivokuori leikattiin pois. Näytteet lähetettiin Biofarmacy Platformiin (Université de Montreal) nestekromatografiaa ja tandem-massaspektrometriaa varten.

käyttäytymisanalyysi

avoin kenttä: tuki-ja liikuntaelimistön aktiivisuutta mitattiin automaattisella hvs2100-seurantajärjestelmällä (HVS Image, Hamptom, UK). Hiiret sijoitettiin avoimeen kenttäkammioon (40 × 40 cm Pleksilaatikko, ei kattoa ja valkoinen lattia) ja niiden annettiin tutkia 5 minuutin ajan.

Novel object recognition (NOR): hiiret altistettiin ennalta kahdelle samanlaiselle esineelle avoimessa kenttäkammiossa 5 minuutin ajan. Kaksi tuntia esialtistuksen jälkeen hiiret laitettiin takaisin kammioon ja altistettiin yhdelle tutulle esineelle ja yhdelle uudelle esineelle 5 minuutin ajaksi. Hiiret altistettiin tietylle kohteelle vain kerran eri testisessioiden aikana, ja uudenlainen kohteen sijoittaminen sai vastapainoa kunkin hoitoryhmän sisällä. Uuden kohteen prosentuaalinen kosketus testivaiheen aikana ja syrjintäindeksi ((# koskettaa uutta − # koskettaa tuttua)/kokonaiskosketus) arvioitiin.

Barnesin sokkelo: Barnesin sokkelitasanne (halkaisija 91 cm, Korkeus 90 cm lattiasta) koostui 20 reiästä (kunkin halkaisija 5 cm). Kaikki reiät tukittiin lukuun ottamatta yhtä kohdeaukkoa, joka johti upotettuun pakotelaatikkoon. Tilavihjeitä, kirkasta valoa ja valkoista kohinaa käytettiin motivoimaan hiiriä löytämään pako jokaisen istunnon aikana. Sopeutumisvaihetta varten jokainen hiiri tutki alustaa 60 sekunnin ajan. jokainen hiiri, joka ei löytänyt pakotelaatikkoa, ohjattiin sille ja pysyi siellä 90 sekunnin ajan. hankintavaihetta varten jokainen koe noudatti samaa protokollaa. tavoitteena oli kouluttaa jokainen hiiri löytämään kohde ja siirtymään pakotelaatikkoon 180 sekunnin kuluessa. Hiiret pysyivät laatikossa vielä 60 sekunnin ajan.neljä koetta päivässä, noin 15 minuutin välein, suoritettiin 4 peräkkäisen päivän ajan. Koettimen testissä (5. päivä) jokainen hiiri suoritti yhden 90 s kokeen. Kohde oli edelleen samassa paikassa, mutta pakoaitio oli tukossa. Kohteen saavuttamiseen johtaneet viiveet ja virheet sekä kuhunkin aukkoon kohdistuneiden hiiren tökkien määrä (kohdevalinta) mitattiin. Y-sokkelo koostui symmetrisestä Y: n muotoisesta sokkelosta, jossa oli kolme haaraa 120°: n päässä toisistaan, joille annettiin nimet A, B ja C. Eläimet sijoitettiin varren a distaaliseen päähän ja niiden annettiin tutkia sokkeloa 5 minuutin ajan. Tutkimushaaraan kirjattiin yhteensä kirjauksia ja spontaani vuorottelu, joka määriteltiin peräkkäisiksi kirjauksiksi kolmessa eri haarassa. Vaihtoprosentti määritettiin.

kudosten käsittely

immunohistokemian osalta hiiret (N = 4-6 ryhmää kohti) nukutettiin isofluoraanilla ja perfuusioitiin transcardiaalisesti jääkylmällä suolaliuoksella, jonka jälkeen annettiin jääkylmää 4-prosenttista paraformaldehydiä (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) 0, 1 M fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa. Aivoille annettiin 10% neutraalipuskuroitua formaliinia (Thermo Fisher Scientific, Mississauga, ON, Kanada) 16 tunnin ajan ja ne siirrettiin 70-prosenttiseen etanoliin. Aivoissa oli parafiinia 4 µm: n syvyydessä.

western blot-ja ELISA-hiirillä (N = 4-8 ryhmää kohti) nukutetut hiiret sijoiltaan, hippokampus ja aivokuori leikattiin pois ja jäädytettiin välittömästi kuivajäälle. Proteiinit uutettiin 5× tilavuus/paino radioimmunoprecipitation assay (RIPA)-puskurilla (50 mM Tris-HCl, pH 7, 4, 1% NP-40, 150 mM NaCl, 0, 25% Na−deoksikolaatti, 1 mM EDTA, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 1 mM PMSF, 10 µl ml-1 proteaasinestäjien Cocktail (Sigma-Aldrich)) jään päällä kudoshomogenisaattorilla (OMNI International, Kennesaw, GA, Yhdysvallat). Näytteitä sentrifugoitiin (20 000 × g, 4 °c) 20 minuutin ajan, supernatantti otettiin talteen ja proteiini määritettiin BCA-menetelmällä. RIPA-liukenematon pelletti uutettiin edelleen 70-prosenttisessa muurahaishapossa dH2O: ssa, haihdutettiin ja resolubiloitiin 200 mM Tris-HCl: ssä, pH 7,5.

Immunohistologinen värjäytyminen

epitoopit demasked joko sitraatissa (10 mM Tris-Na-sitraatti, pH 6, 0) tai EDTA: ssa (10 mM Tris-emäs, 1 mM EDTA, 0, 05% Tween-20, pH 9.0) antigeenihaku puskuri, ja immunosäädetään käyttämällä Dako Autostainer sekä automaattinen slide-prosessori ja EnVision Flex-järjestelmä (Dako, Burlington, on, Kanada). Depaffinisaation ja nesteytyksen jälkeen osa hoidettiin peroksidaasilla, estettiin seerumittomassa proteiinilohkossa ja immunostettiin seuraavilla vasta-aineilla, jotka on laimennettu EnVision Flex-vasta-Ainelaimennimella: 1:2000 rabbit anti-Iba1 (Wako 019-19741, Richmond, VA, USA), 1:8000 rabbit anti-GFAP (Dako Z-0334), 1:2000 rabbit anti-Aß1-40 (f25276, laboratory developed) ja 1:1000 hiiren antisynaptofysiiniä (Sigma-Aldrich s5768). Osiot hoidettiin testisarjan mukana toimitetulla sopivalla hiiren tai kanin HRP-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineella ja visualisoitiin DAB: llä. Osat olivat hematoksyliini vastapainoksi, kuivattu, ja coversliped kanssa Permount (Fisher Scientific). Osat skannattiin digitaalisesti MIRAX Scanilla analysoitavaksi (Zeiss, Don Mills, on, Kanada). Depaffinisaation ja nesteytyksen jälkeen diat värjättiin suodatetulla 1% vesiliuoksella Tioflaviini-S: llä (Sigma-Aldrich).

kvantitatiivinen immunohistologinen analyysi

iba1-positiiviset solut hippokampuksen aivokuoressa ja CA1-alueen etuosassa määritettiin käyttäen areaalilaskennan kehystä muokattua versiota 48. Lyhyesti, joka viides Dia oli kvantifioitu (tuloksena neljä osiota per aivot). MIRAX-kuvauksella otettiin useita ×80 kuvaa kyseiseltä alueelta ja iba1-positiivisten solujen määrä laskettiin manuaalisesti. Anteriorisen CA1-alueen ja aivokuoren numeerinen tiheys (solujen lukumäärä mm−3)arvioitiin. Luotettavan arvion tekemiseen tarvittiin vähintään 150 osumaa aluetta kohden. Lisäosioita laskettiin, jos emme pystyneet saavuttamaan minimimääräämme. Kvantifiointi tehtiin sokkona hoidon ja genotyypin osalta. ImageJ-ohjelmistoa (nih, Bethesda, MD, USA) käytettiin Aß-kertymän, GFAP: n ja synaptofysiinin immunopositiivisen värjäyksen mittaamiseen CA1-alueella ja aivokuoressa. Jokaisesta aivojaksosta analysoitiin neljä osaa, ja jokaisesta osiosta otettiin useita kuvia CA1-alueen ja aivokuoren kattamiseksi. Kynnystä säädettiin yhtä lailla kaikissa aivoissa värjäytyneen alueen korostamiseksi, ja partikkelit analysoitiin värjäytymisen kokonaispinta-alan määrittämiseksi. Tulokset ilmoitetaan värjättynä kokonaispinta−Alana analysoitua kokonaispinta-alaa kohti (µm2 mm-2). Edustavia kuvia on rajattu vain kokorajoitusten mukaisiksi, eikä niitä ole jälkikäsitelty.

Western blotting

Hiiriproteiininäytteet (25-100 µg) valmistettiin laemmlissa (5% 2-β-merkaptoetanolia, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 1 mM Pmsf, 10 µl ml−1 proteaasien estäjien cocktailia (Sigma-Aldrich)), keitettiin 5 min ja erotettiin polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (PAGE). Näytteet testattiin seuraavilla primaarisilla vasta-aineilla, jotka laimennettiin joko 5-prosenttiseen rasittamattomaan kuivamaitoon Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa ja 0, 1-prosenttiseen Tween-20-tai PBS-estopuskuriin (Thermoscientific): 1:1000 hiiren anti-human aß1-16 (6E10) (Biolegend 803001, San Diego, CA, USA), 1:2000 rabbit anti-APP C-terminus (Sigma-Aldrich A8717), 1:1000 rabbit anti-neprilysin (Abcam ab79423), 1:500 rabbit anti-IDE (Abcam ab32216), 1:1000 rabbit anti-Caspase-3 (Cell Signaling 9665), 1:1000 mouse antiactive Caspase-8 (Cell Signaling 8592), 1:1000 rabbit anti-kaspaasi-9 (solun signalointi 9504) ja 1:5000 hiiren Anti β-aktiini (Sigma-Aldrich a5441). Blotteja havaittiin 1:5000 HRP-linkitteisellä hiirellä (GE Amersham NA9310, Montreal, QC, CA) tai 1: 5000 anti-kani (Dako P0217) sekundaarisella vasta-aineella, jota seurasi ECL (GE Amersham). Immunoreaktiiviset nauhat visualisoitiin ImageQuant LAS 4000-kuvantamisjärjestelmällä (Fujifilm USA, Valhalla, NY, USA) ja densitometriset analyysit tehtiin Image Gauge analysis Softwarella (Fujifilm USA). RAW-blottien kirkkautta/kontrastia säädettiin yhtä lailla koko kuvan osalta Adobe Photoshop CS5-ohjelmistolla (Adobe Systems, Ottawa, ON, CA) edustavien kuvien tuottamiseksi. Lisämuutoksia ei tehty. CanvasTM X-ohjelmistoa (Acd system, Plantation, FL, USA) käytettiin lopullisten lukujen luomiseen. Raw blots Länsi blots ovat saatavilla täydentävässä kuvassa 11.

ELISA

Pro – ja anti-inflammatoriset sytokiinit ja aß-tasot hiiren aivoissa määritettiin Meso Scale Discoveryn (Rockville, MD, USA) elektrochemiluminesenssi-immuunimäärityspaketeilla. Standardit ja näytteet laadittiin valmistajan protokollien mukaisesti ja ne toimivat kahtena kappaleena. Kymmenen pleksin hiiren proinflammatory-paneelia käytettiin hiiren hippokampaleen ja aivokuoren sekä näytteiden tutkimiseen. Hiiren plasmamittaukseen käytettiin yhtä Il-1β-pakkausta. HPN-näytteissä käytettiin neljän pleksin proinflammatory-paneelia (KS.alla). Nelipaneelista ihmisen aß 6E10-pakkausta käytettiin hiiren hippokampukseen ja cortexiin sekä HPN-näytteisiin.

RNA-uutto ja cDNA-synteesi

kokonais-RNA uutettiin hiiren hippokampuksesta ja aivokuoresta (N = 3 ryhmää kohti) qiazolilla (Qiagen, Valencia, CA, USA), minkä jälkeen se homogenoitiin 20 gaugen neulalla. MiRNeasy mini kit, mukaan lukien on-column dnase hoito vaihe, käytettiin puhdistaa yhteensä RNA (Qiagen). RNA: n laatu ja määrä määritettiin spektrofotometrillä (DS-11 FX+, DeNovix, Wilmington, DE, USA). Five hundred nanograms of total RNA was reverse transcribed for each sample (with avian myeloblastosis reverse transcriptase (AMV-RT)) (Roche, Mannheim, Germany).

PCR and real-time PCR

HAPP transgene PCR amplification was performed using Taq DNA polymerase (New England Biolabs, Whitby, ON, Canada) using the following primers: (hAPP) 5′-AACACAGAAAACGAAGTT-3′ and 5′-CCGATGGGTAGTGAAGCA-3′ (480-bp amplicon)31, (Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase, HPRT) 5′-GTAATGATCAGTCAACGGGGGAC-3′ and 5′-CCAGCAAGCTTGCAACCTTAACCA-3′ (177-pb amplicon) (Carcinogenesis). Tuotteet visualisoitiin RedSafe (FroggaBio, North York, ON, Kanada) värjätty 2% agarose geelit. Reaaliaikaiset PCR-kokeet suoritettiin SYBR Green Taq Mastermixillä (Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD, USA) sovelletulla Biosystems 7500-nopealla reaaliaikaisella PCR-järjestelmäkoneella (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Geeninvahvistusta tehtiin seuraavilla alukkeilla: (18S) 5 ’- GTAACCCGTTGAACCCCAT-3 ’ja 5′ -CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3′; (IDE) 5′- ACTAACCGGTGGTGAAG-3’ ja 5 ’- GGTCTGGTATGGAAG-3′; (Neprilysin) 5′- TCTTGTAAGCAGCAGCC-3′ ja 5’- CTCCCACAGCATTCTCCAT-3″. Tulokset ilmaistaan kertaisina induktioarvoina, jotka on normalisoitu keskimääräisiksi HPRT-ja 18S-referenssigeeneiksi Pfaffl-menetelmällä.

hiiren synaptinen plastisuus RT2-Profiler PCR array

hiiren synaptinen plastisuus RT2 Profiler PCR Array (PAMM-126Z, Qiagen) profiloi 84 geenin ilmentymisen, jotka osallistuvat synaptisiin muutoksiin oppimisen ja muistin aikana, sekä viisi taloudenhoidon geeniä (β-aktiini; β-2-mikroglobuliini; glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi, GAPDH; β-glukuronidaasi, Gusb; Heat shock protein 90 alpha (sytosolic), Hsp90ab1) reaaliaikaisella PCR: llä. Kokonais-RNA (465 ng kutakin näytettä kohti) litteroitiin käänteisesti (sisältäen genomisen DNA: n eliminaatiovaiheen) valmistajan protokollan mukaisesti (ensimmäinen juoste cDNA Synthesis Kit, Qiagen). Reaaliaikainen PCR-reaktio suoritettiin reaaliaikaisessa abi 7500-syklissä (Fast Block) (Applied Biosystems) käyttäen RT2 SYBR Green/ROX PCR master mixiä (Qiagen). Vuorotteluolosuhteet olivat seuraavat: 2 min 50 °C: ssa, 10 min 95 °C: ssa, 40 sykliä, 15 s kukin 95 °C: ssa ja 1 min 60 °C: ssa. Kynnys ja lähtötaso asetettiin manuaalisesti valmistajan ohjeiden mukaan. Tiedot normalisoitiin viiden kodinhoitogeenin geometriseen keskiarvoon ja analysoitiin vertailevalla Ct−menetelmällä (2-ΔCT).

Hermosoluviljelmä ja aksonaalinen degeneraatiomääritys

kahdestatoista – kuusitoista viikkoa vanha sikiön aivokudos saatiin Syntymävaurioiden tutkimuslaboratoriosta (University of Washington, Seattle, USA) McGill institutional review Boardin hyväksymän protokollan mukaisesti. HPN: ää viljeltiin aivoista, jotka dissosioitiin trypsiinillä, käsiteltiin deoksiribonukleaasi I: llä ja suodatettiin 130, 70 ja 30 µm nailonmesh21: n läpi. Dissosioituneet solut sentrifugoitiin 10 minuutin ajan 300 × g: n tarkkuudella, suspendoitiin Earlen suoloilla minimaaliseen välttämättömään väliaineeseen (MEM) ja täydennettiin 5-prosenttisella decomplementoidulla BCS: llä, 1× penisilliini-streptomysiinillä, 1 mM natriumpyruvaatilla ja 2 mM L-glutamiinilla (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Solut kylvettiin 3×106 solun ml−1 tiheydellä 5 µg mL−1 poly-l-lysiinipäällysteisille kuusikaivokudosviljelylevyille (Sigma-Aldrich). Mem-medium vaihdettiin 2 päivän välein ja astrosyyttien proliferaatiota rajoitettiin fluorodeoksiuridilla (FDU) antimitoottisen hoidon (1 mM, Sigma) aikana ensimmäisten 4 päivän ajan. Neuroniviljelmiä kasvatettiin 7-10 päivää ennen kokeiden suorittamista. Testattiin neljää eri neuronivalmistetta eri aikoina. Yksi neuronivalmisteista ei ollut stabiili ja viljelmä, mukaan lukien seerumi + – kontrolli, joka ei saanut mitään lääkettä, kuoli kesken kokeen. Siksi käytettiin kolmea eri neuronivalmistetta kolmelta geneettisesti erilaiselta luovuttajalta.

VX-765-toksisuutta arvioitiin 3-(4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-2,5-difenyylitetratsoliumbromidilla (MTT). Neuroneja käsiteltiin 25-200 µM VX-765: llä tai 0,1% DMSO: lla (korkein käytetty DMSO−pitoisuus) 72 tunnin ajan. neuroneja inkuboitiin 0,5 µg ml-1 MTT: llä (Sigma-Aldrich) 4 tunnin ajan 37 °C: ssa (5% CO2). Formatsaanikiteet liuotettiin 100 µl: aan DMSO: ta 30 minuutin ajan. Absorbanssi mitattiin 560 ja 670 nm: ssä Synergy H4-levylukijalla.

aksonaalinen degeneraatio aiheutui joko APPWT-siirrosta tai seerumin deprivaatiostressistä. VX-765: tä annettiin joko esikäsittelystrategiana (1 tunti ennen stressitekijää) tai postbeading-hoitostrategiana (48 tuntia stressitekijän jälkeen). Neuronit transfektoitiin Geenipistoolilla (BioRad, Mississauga, ON, Kanada) kultahelmillä, jotka oli päällystetty pbudce41-eGFP: llä fluoresenssin visualisointia varten. Neuronit, jotka olivat APPWT-stressissä, transfektoitiin pbudce41-eGFP/APPWT: llä. Lyhyesti hermosoluja hoidettiin väliaineella, johon oli lisätty 25 tai 50 µM VX-765, 5 µM Kasp1-inhibiittori Z-YVAD-fmk eli DMSO. Fluoresenssikuvat otettiin Nikon Eclipse Ti-mikroskoopilla (Nikon, Mississauga, ON, CA) ja Photometrics coolSNAP HQ2 CCD-kameralla (Photometrics, Tucson, AZ, USA) 24 tunnin välein (jopa 72 tunnin välein käsittelyn jälkeen) käyttäen NIS Elements AR 3.10-ohjelmistoa (Nikon). Hermosolujen helmiäisprosentti mitattiin laskemalla helmiäisten eGFP-positiivisten neuronien määrä eGFP-positiivisten neuronien kokonaismäärään kussakin vaiheessa. Jokaista tilaa varten laskettiin vähintään 150 eGFP-positiivista neuronia. Testiaineesta otettiin näyte (täydennettynä 1 mM Na3VO4: llä, 1 mM NaF: llä, 1 mM PMSF: llä, 10 µl ml−1 proteaasien estäjien cocktaililla (Sigma-Aldrich)), ja neuronit kerättiin solujen hajoamispuskuriin (50 mM HEPES, 0, 1% CHAPS, 0, 1 mM EDTA) analyysia varten.

tilastolliset analyysit

eläinten tai riippumattomien kokeiden lukumäärä ja käytetty tilastollinen analyysi (ANOVA ja post-hoc-vertailut) on kaikki esitetty kuviolegendoissa. Kaikki arvot ilmoitetaan keskiarvona ± s. e.m. ja F-ja p-arvot ilmoitetaan kuvassa legends. Kaikki tilastolliset analyysit tehtiin Grappad Prism 7-ohjelmistolla (Grappad Software, La Jolla, CA, USA).