Abstrakti

Karbendatsiimia fungisidina käytettiin yleisesti sienitautien torjuntaan maa-ja metsätaloudessa sekä eläinlääkkeissä. Tässä tutkimuksessa karbendatsiimin akuuttia ja lisääntymistoksisuutta arvioitiin käyttäen mallina Caenorhabditis elegansia (C. elegans), jotta voitaisiin alustavasti arvioida tämän sienitautien torjunta-aineen mahdollisia riskejä maataloustuotannossa ja-käytössä. Tulokset osoittivat, että 0, 01 µg/L karbendatsiimia esti C. elegansin kasvua. Karbendatsiimin 0, 1 µg/L hoito vähensi merkittävästi liikkumiskäyttäytymistä ja vaurioitti merkittävästi lisääntymis-ja antioksidanttijärjestelmää, mikä lyhensi merkittävästi sukkulamatojen elinikää. Tulokset antavat paremman käsityksen karbendatsiimin ympäristöriskeistä ja herättävät uusia huolia turvallisuudesta.

1. Johdanto

torjunta-aineita, eräänlaisia kemiallisia tai biologisia reagensseja, käytetään maataloudessa laajalti kasvien kasvun säätelyyn sekä tautien ja tuhohyönteisten torjuntaan, mikä voi edistää kasvustojen kasvua ja parantaa satoa . Torjunta-aineiden laajamittainen käyttö aiheuttaa kuitenkin eriasteisia jäämiä viljelykasveihin tai elintarvikkeisiin ja vaikuttaa siten ihmisten terveyteen . Torjunta-ainejäämäongelmat eivät ole ainoastaan herättäneet kuluttajien suurta huomiota, vaan niistä on myös tullut yksi elintarviketurvallisuuteen vaikuttavista avaintekijöistä .

Karbendatsiimia on käytetty laajakirjoisena fungisidina sienitautien torjuntaan maa-ja metsätaloudessa sekä eläinlääkkeissä . Maailman terveysjärjestö on kuitenkin luokitellut karbendatsiimin vaarallisten kemikaalien luokkaan, ja Euroopan komissio on luokitellut sen hormonitoimintaa häiritsevien kemikaalien prioriteettiluetteloon . Viime vuosina on ilmiselvää, että karbendatsiimin laajamittainen käyttö, johon liittyy ylipitkiä pitoisuuksia ja yliannostuksia, sekä se, että karbendatsiimia on vaikea hajottaa, ovat molemmat johtaneet karbendatsiimin jäämäongelmaan maataloudessa . Vaikka karbendatsiimin toksisista vaikutuksista on raportoitu 1980-luvulta lähtien, karbendatsiimin myrkyllisyydestä tulee kuuma puheenaihe, koska huoli ympäristön hormonaalisista haitta-aineista kasvaa . Karbendatsiimi on kielletty useissa maissa sen haitallisten ympäristö-ja terveysvaikutusten, kuten kehitys-ja lisääntymishäiriöiden, myrkyllisyyden ja mutageenisuuden vuoksi . Karbendatsiimin haitalliset vaikutukset maksan, munuaisten ja umpirauhasten biokemiallisiin, histopatologisiin ja hematologisiin parametreihin ja niiden hormonipitoisuuksiin on havainnollistettu rotilla . Lisäksi se tarvitsee lisätutkimuksia karbendatsiimin jäämien vuoksi alhaisesta pitoisuudesta.

Caenorhabditis elegans (”C. elegans”) on tärkeä tutkimusmalli, jota käytetään laajalti joidenkin arvioiden tekemiseen. Amrit et al. , C. elegans on monia etuja, kuten pieni koko, nopea sukupolven aika, helppo viljelyn laboratorio, ja lyhyt AIKUINEN elinikä. C. elegans valittiin tässä tutkimuksessa malliorganismiksi arvioimaan karbendatsiimin alhaisen pitoisuuden myrkyllisyyttä, mitä voidaan pitää viitearvona karbendatsiimin käytölle maataloudessa.

2. Materiaalit ja menetelmät

2.1. Kemikaalit ja kannat

Karbendatsiimi (puhtaus ≥ 99%; Aladdin® Biochemical Technology Co., LTD, Shanghai, Kiina) liuotettiin N, N-dimetyyliformamidiin (DMF; Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD, Shanghai, Kiina)tuottamaan 1 g/L karbendatsiimia. DIMETYYLIFUMARAATTIPITOISUUDET olivat 0, 1% lopullisissa altistusliuoksissa (0.01, 0.1, 1, 10, 100 µg / L). Kontrolliryhmä oli 0, 1% DMF: ää ilman karbendatsiimia. C. elegans (villityyppinen N2) on alun perin saatu Caenorhabditis Genetics Centeristä (University of Minnesota, mn, USA). Sukkulamadot viljeltiin sukkulamatojen kasvualustalevyillä, joihin kylvettiin Escherichia coli OP50-bakteeria 20°C: ssa kuvatulla tavalla . L1-toukka C. elegans kerättiin pesemällä gravid-sukkulamadot valkaisuseoksella (1 M NaOH, 10% NaHOCl).

2, 2. Kuolleisuus

alkuperäiset Karbendatsiimiliuokset (1 g/L) laimennettiin s-nestemäisellä väliaineella (1, 12 g K2HPO4, 5, 92 g KH2PO4 ja 5, 85 g NaCl laimennettiin 1 L vedellä), jotta saatiin lopulliset karbendatsiimipitoisuudet 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, ja 1 mg / L, jossa oli 0,1% DMF: ää. Verrokkiryhmänä oli nestemäinen väliaine, jossa oli 0,1% DMF: ää. Kunkin pitoisuuden osalta testattiin 30 sukkulamatoa (L4) 96-kuoppalevyillä. Sukkulamatojen eloonjääminen laskettiin mikroskoopilla sen jälkeen, kun niitä oli viljelty 24 tuntia inkubaattorissa. Testin prosessi perustuu Xiang et al-menetelmään. . Tarvittiin kolme rinnakkaista koetta.

2, 3. Veturikäyttäytyminen

ainakin 10 C. elegania (L4) poimittiin satunnaisesti kustakin pitoisuudesta veturin käyttäytymisen määrittämiseksi, mikä kirjattiin sekä pään-thrash-taajuudella että kehon taivutusajoilla . Head-thrash-taajuuden määrä laskettiin C. elegansin keskivartalon taivutussuunnan muutoksilla 1 min. Kehon mutkan mittaus määriteltiin kellonaikoina, jolloin NGM: ssä ilman E. coli OP50-bakteeria viljellyn sukkulamatojen osan suunta muuttui 30 s: n aikana.

2.4. Kasvu-ja Kehitysmääritykset

C. elegans, joka altistettiin karbendatsiimille 24 tunnin ajan, analysoitiin. Karbendatsiimille altistuneiden sukkulamatojen ruumiinpituutta arvioitiin Image J-ohjelmalla. Kunkin C: n jälkeläiset. elegans L4-toukista päivään 1 kirjattiin L3-vaiheessa sen jälkeen, kun se oli siirtynyt yksilöllisesti uudelle levylle joka päivä, kunnes lisääntyminen loppui . Lisäksi tehtiin ainakin kolme rinnakkaista koetta.

2, 5. Elinkaarianalyysi

kaikki eliniän osalta testatut C. elegans-lajit viljeltiin samassa tilassa 20°C: n lämpötilassa.synkronoitua C. elegans-bakteeria viljeltiin NGM-levyissä, joissa oli erilaisia karbendatsiimin pitoisuuksia päivään 4 asti. Tämän jälkeen testatut sukkulamadot siirrettäisiin uusiin NGM-levyihin joka 2.päivä. Elossa oleva ja kuollut C. eleganeita kirjattiin päivittäin (aikuisiän ensimmäisestä päivästä alkaen), kunnes kaikki sukkulamadot kutakin pitoisuutta kohti olivat kuolleet . Lisäksi tehtiin ainakin kolme rinnakkaista koetta.

2, 6. Hapetusvaurion

solunsisäinen ROS mitattiin 2′,7′-diklooridihydrofluoriskeiinidiasetaatilla (H2DCFH-DA), joka on ylivoimaisesti yleisin ja herkin reaktiivinen hapenilmaisuluotain. Villityypin N2 C. eleganit pestiin M9-puskurissa ja sitten ultraäänellä häirittiin. Supernatantista analysoitiin ROS-taso ROS-sarjan ohjeiden mukaisesti. H2dche-DA: n lopullinen toimintakonsentraatio oli 10 μΜ . Magnetoinnin ja emissioabsorbanssin aallonpituudet olivat vastaavasti 485 nm ja 535 nm. Lisäksi tehtiin ainakin kolme rinnakkaista koetta.

solunsisäinen kokonais superoksididismutaasi (t-SOD) määritettiin Nanjingin Jianchengin biotekniikan instituutista ostetun t-SOD-paketin ohjeen mukaan. Kun tutkitut sukkulamadot oli pesty M9: llä kolme kertaa, ne häiriintyivät ultraäänitutkimuksessa ja reagoivat T-SOD-pakkauksella. Absorbanssin aallonpituus oli 550 nm. Lisäksi supernatantilla havaittiin kunkin konsentraation proteiinipitoisuus, jossa absorbanssin aallonpituus oli 595 nm. Lisäksi tehtiin ainakin kolme rinnakkaista koetta.

2, 7. Data-analyysi

kaikki tiedot annettiin keskiarvon (sem) keskiarvona ± keskivirheenä käyttämällä yksisuuntaista ANOVAA. Graafit esitettiin Origin 8.5: n ja GraphPad Primer 7: n avulla, ja tilastollinen analyysi tehtiin SPSS 19.0-ohjelmiston avulla. Tilastollinen merkitsevyystaso toteutettiin käyttäen ja .

3. Tulokset

3.1. C. elegans after Carbendazim Acute Exposures

LC50C. elegans were exposed to carbendazim for 24 hours to assess its acute toxic effects. Data are represented as shown in Table 1, and the obtained linear fitting equation was y = 2.180x − 0.223 through data analysis. The obtained LC50 is 0.867 mg/L.

Next, we assayed the determination of the locomotive behavior of C. elegans akuutin karbendatsiimialtistuksen jälkeen analysoimalla tietoja sukkulamatojen pään thrash-esiintymistiheydestä ja vartalon taivutusajoista (Kuvat 1 a ja 1 b)). Molempien karbendatsiimipitoisuudet alenivat merkitsevästi 0, 01 µg/L-100 µg/L (). Lisäksi 100 µg/L altistettujen sukkulamatojen pääniskut vähenivät 68, 27%: iin. Kun karbendatsiimin pitoisuudet olivat 10 µg/L ja 100 µg/L, sillä oli merkitsevä C. elegansin kehon mutkia estävä vaikutus 36, 77% ja 35, 48% verrattuna kontrolliryhmään.

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figure 1

Effects of C. elegans on physiological traits exposed to carbendazim. (a) The head thrashes of C. elegans after carbendazim exposure; (b) the body bends of C. elegans karbendatsiimialtistuksen jälkeen; c) C. elegansin ruumiinpituus karbendatsiimialtistuksen jälkeen; ja d) C. elegansin kehon pinta-ala karbendatsiimialtistuksen jälkeen. Tiedot (keskiarvo ± sem) esitetään luvuissa prosenttiarvoina vertailuryhmään verrattuna. Tähdellä esitetään kunkin vastuuryhmän ja kontrolliryhmän ( ja) väliset merkitsevyydet.

3, 2. C: n kasvun ja kehityksen määrittäminen. elegans akuutin Karbendatsiimialtistuksen

jälkeen kontrolliryhmään verrattuna (Kuvat 1(c) ja 1(d)) kehon pituus pieneni merkitsevästi () altistusryhmissä 0, 01 µg/L: sta 100 µg/l: iin.molemmat pienenivät 19, 16%: lla ja 22, 15%: lla, kun hoitoa annettiin 0, 01 µg/L verrattuna kontrolliryhmään. Pitoisuus 10 µg/L aiheutti eniten negatiivisia vaikutuksia, ja C. elegansin kehon pituus pieneni 35, 21% ja kehon pinta-ala 65, 22% verrattuna kontrolliryhmään.

3, 3. C. elegansin Poikuekokojen määrittäminen akuutin Karbendatsiimialtistuksen

jälkeen kuvan 2 mukaan sukkulamatojen poikuekoot pienenivät merkitsevästi () hoitoryhmissä 0, 1 µg/L: sta 100 µg/l: iin.C. elegansin poikuekoot pienenivät merkittävimmin, mikä pieneni 43, 71%: iin 10 µg / L: n hoidolla verrattuna kontrolliryhmään.

3, 4. C. elegansin eliniän määrittäminen akuutin Karbendatsiimialtistuksen

C. elegansin elinikä estyi merkitsevästi 0, 01 µg/L-100 µg/L karbendatsiimin elinikää kuviossa 3 esitetyn elinkaarikäyrän mukaisesti. Tulokset osoittivat, että C. elegansin elinikä lyheni 24 vuorokaudesta 20 vuorokauteen karbendatsiimin 0, 01 µg/L hoidolla. Karbendatsiimia 0, 01 µg / L saaneiden sukkulamatojen elinikä lyheni 20, 00%. Kun karbendatsiimin altistuspitoisuus oli 100 µg/L, C. elegansin elinikä lyheni eniten 45, 83%.

3, 5. Akuutin Karbendatsiimialtistuksen vaikutukset C. elegansin Antioksidanttijärjestelmään

kontrollin ja hoidetun C. elegansin ROS-tasot karbendatsiimialtistuksessa eri pitoisuuksina on esitetty kuvassa 4(a). Solunsisäisen ROS-pitoisuuden todettiin suurentuneen merkitsevästi () välillä 0, 01 µg/L-100 µg/L karbendatsiimia. Kontrolliin verrattuna ROS-taso nousi enimmillään 70,60% 10 µg/L: n hoidolla.solunsisäisten SOD-tasojen tulosten mukaan se nousi hoidossa 0: sta.01 µg/L-100 µg/L karbendatsiimia (Kuva 4 b). SOD-pitoisuus nousi 10, 70% 0, 1 µg/L karbendatsiimia verrattuna kontrolliryhmään.

(a)

(b)

(a)
(b)

4. Keskustelua

Karbendatsiimia käytetään fungisideinä yleisesti maataloudessa estämään sienen kasvua. Karbendatsiimin käyttö on kielletty Australiassa, suurimmassa osassa Euroopan unionia ja Yhdysvalloissa sen vaikean toksikologian ja pysyvyyden vuoksi . Tässä tutkimuksessa käytettiin ensimmäistä kertaa C. elegans malliorganismeina arvioimaan karbendatsiimin vaikutuksia veturin käyttäytymiseen, kasvuun ja kehitykseen, lisääntymiseen, elinikään ja antioksidanttijärjestelmiin. Lisäksi tulokset osoittivat, että sillä oli kielteinen vaikutus C. elegansiin.

24 h-LC50: n mukaan karbendatsiimin eri pitoisuuksille altistuneen C. elegansin akuutti toksisuuspitoisuus on 0, 867 mg/L. karbendatsiimin 96 h LC50-arvo seeprakalan vasteena on esitetty 1, 75 mg / L . Preussilaisen karpin Carassius gibelion munien myrkyllisyysvaikutukset on osoitettu pitoisuudella 0,036 mg / L . Tutkimukset osoittivat, että navicula sp: n kasvu ja kehitys. karbendatsiimi inhiboi sitä 24 h-EC50-arvolla 2, 18 mg/l .vaikka levien kasvunopeus palautuu 72 h-altistuksen jälkeen, klorofylli-a-pitoisuus pienenee merkittävästi, kun karbendatsiimia annettiin yli 0, 5 mg / L. Tässä tutkimuksessa valittiin C. elegans, joka altistui pienelle karbendatsiimin pitoisuudelle, arvioimaan sen vaikutuksia ihmisen päivittäisen altistuksen todellisen pitoisuuden mukaan. Pienet karbendatsiimin pitoisuudet eivät tarkoita, että se olisi turvallista. Karbendatsiimilla on joissakin tutkimuksissa havaittu negatiivisia biologisia vaikutuksia paljon pienemmillä annoksilla.

veturin käyttäytymistä arvioitiin C. elegansin (L4-toukka) neurotoksisuuden arvioimiseksi 24 tunnin karbendatsiimialtistuksen jälkeen. Tulokset osoittivat, että karbendatsiimilla voi olla negatiivisia vaikutuksia veturin käyttäytymiseen C. elegansin pään ja vartalon taipumisen havaitsemisen kautta, sillä molemmat olivat herkempiä suuremmassa altistusryhmässä. Karbendatsiimille altistuneiden seeprakalan alkioiden veturikäyttäytyminen on herkkää . Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että kaloilla on epänormaalia käyttäytymistä, kun karbendatsiimin subletaalipitoisuudet ovat 0,22–0,43 mg/L .

kehityshäiriöt voivat myös olla yksi syy epänormaaliin liikkumiseen . C. elegansin kasvua ja kehitystä selvitettiin tutkimuksessamme. Tulokset osoittivat, että C. elegansin kehon pituus ja kehon pinta-ala kapenivat merkittävästi, kun hoito ylitti 0, 01 µg/L karbendatsiimia. Selkärankaisten normaali kasvu liittyy metaboliseen kilpirauhashormonin homeostaasiin . Williams ym. ovat osoittaneet, että karbendatsiimi voi aiheuttaa siittiökatoa implantaation jälkeen, sikiön epämuodostumia ja hidasta kasvua ja kehitystä.

karbendatsiimin lisääntymistoksisuus on osoitettu, että karbendatsiimi saattaa estää sieni-ja nisäkässolujen mikrotubuluspolymeroitumista ja aiheuttaa siten beetatubuliinin kanssa vaikuttavan mikrotubulusten kokoonpanon häiriöitä, mikä heikentää kromosomien eriytymistä solunjakautumisprosessissa . Mikrotubulusten muodostuminen α – Ja β-tubuliinin epäsovinnaisilla sidoksilla vastaa kromosomien erottelusta mitoosin ja meioosin prosessissa . C. elegansin poikuekoko pienenee merkittävästi karbendatsiimin pitoisuudella 0, 1 µg / L. Karbendatsiimin on todettu vaikuttavan Japanilaisten viiriäisten ja hamstereiden lisääntymisjärjestelmiin . Tutkimuksemme perusteella pääteltiin, että C. elegansin elinikä lyheni merkitsevästi, kun karbendatsiimin pitoisuus oli ≥0, 01 µg/L. Tutkimukset ovat osoittaneet, että karbendatsiimi on johtanut hedelmättömyyteen ja kehitystoksisuuteen ja ilmenee alkiotoksisuutta, sukusolujen apoptoosia ja teratogeneesiä eri nisäkäslajeilla .

apoptoosi on monimutkainen ohjelmoitu solukuolema, joka on pitkälle säännelty ilmiö, jolle on ominaista sarja soluprosesseja . Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että oksidatiivisen stressin aiheuttama ROS: n tuotanto on yhteydessä apoptoottiseen solukuolemaan . Tutkimuksemme mukaan karbendatsiimi voi nostaa ROS-arvoja merkittävästi ja SOD-arvoja hieman. Ympäristön saastumisen aiheuttama oksidatiivinen stressi lisää ROS: n ilmentymistä ja vahingoittaa sen jälkeen antioksidanttipuolustusjärjestelmää . SOD vastaa myrkyllisten vapaiden radikaalien detoksifikaatiosta ja niiden toiminnasta, jota käytetään oksidatiivisen stressitason ja solujen antioksidanttitilanteen arviointiin . Metalloentsyymi SOD nopeuttaa endogeenisten sytotoksisten superoksidiradikaalien muuntumista H2O2: ksi, ja SOD: n ekspressiotasojen kasvu voi osaltaan parantaa entsyymin toimintaa karbendatsiimin indusoimien superoksidiradikaalien eliminoimiseksi ja solujen toimintahäiriöiden estämiseksi karbendatsiimille altistumisen aikana . Karbendatsiimin suuremmat altistuspitoisuudet voivat aiheuttaa vakavaa oksidatiivista stressiä, joka myöhemmin tuhoaa solujen homeostaasin tasapainon ja edistää apoptoosia . Kuitenkin karbendatsiimi pieninä pitoisuuksina voi vielä merkittävästi vahingoittaa sukuelimiin mukaan meidän tuloksia.

5. Päätelmä

tässä tutkimuksessa arvioitiin tietääksemme ensimmäistä kertaa C. elegansille altistetun karbendatsiimin turvallisuutta. Se osoitti, että karbendatsiimilla voi olla haitallinen vaikutus C. elegansin veturin käyttäytymiseen, kehitykseen ja kasvuun, lisääntymiseen, elinikään ja antioksidanttijärjestelmään. Toivottavasti sen on kiinnitettävä enemmän huomiota karbendatsiimin käyttöön tulosten perusteella. Lisäksi karbendatsiimin käytön turvallisuutta on arvioitava tarkemmin, erityisesti biokertyvyyden toksisuutta ja mahdollisia genotoksisia vaikutuksia.

tietojen saatavuus

Kaikki tämän tutkimuksen aikana tuotetut tai analysoidut tiedot sisältyvät tähän artikkeliin.

eturistiriidat

kirjoittajat ilmoittavat, ettei heillä ole eturistiriitoja.

tunnustukset

tätä tutkimusta tuki Kiinan National Natural Science Foundation (31501569).