kun on kyse proteiinien liuottamisesta ja denaturoinnista ennen isoelektristä fokusointia ja 2-D-geelielektroforeesia, useimmat tutkijat valitsevat urean. Tämä ei ole yllättävää, koska tämä lievä kaotrooppinen aine voi täysin häiritä proteiinimolekyylien välisiä vuorovaikutuksia ja lisätä proteaasitoiminnan tehokkuutta proteiinin pilkkoutumisessa estäen samalla tehokkaasti proteiineja koostumasta ja/tai saostumasta. Lisäksi ureaa käytetään myös aiemmin denaturoitujen näytteiden proteiinien renaturointiin.

huolimatta suosiostaan tehokkaana proteiinin denaturointiaineena, urealiuoksen käyttö proteiinien pilkkomisessa on erityisen haastavaa – se lisää karbamylaation riskiä. Miksi tämän pitäisi huolestuttaa sinua? Seuraavassa on joitakin syitä, miksi karbamylaatio voi olla haitallista kokeilusi ja miksi sitä tulisi välttää hinnalla millä hyvänsä.

1. sen lisäksi, että karbamylaatio estää proteiinimolekyylien N-terminaaliset päät, karbamylaatio häiritsee proteiinien karakterisointia eikä niitä voida käyttää enää.
2. se hyökkää aggressiivisesti arginiini-ja lysiinijäämien sivuketjuja vastaan ja tekee proteiinista epäsopivan entsymaattisille mädätyksille.
3. se estää proteiinien entsymaattista pilkkoutumista ja vaikuttaa haitallisesti proteiinien tunnistamiseen ja kvantifiointiin MS-analyysissä.
4. se sekoittaa peptideistä saadut tulokset odottamattomilla retentioajoilla ja lisää näytteen monimutkaisuutta.
5. se vähentää ionisoitumistehokkuutta ja vaikuttaa negatiivisesti Havaittujen piikkien signaalin voimakkuuteen.
6. se saa aikaan muutoksen proteiinien isoelektrisessä pisteessä ja johtaa artifaktisiin tuloksiin.
7. se saattaa vaikuttaa in vivo-karbamylaatiotutkimusten tuloksiin.

mikä aiheuttaa Karbamylaation?

määritelmän mukaan karbamylaatiolla tarkoitetaan translaation jälkeistä modifikaatiota, joka muuttaa proteiinien rakenteellisia ja toiminnallisia ominaisuuksia. Tämä saadaan aikaan isosyaanihapon ja vapaiden aminoryhmien välisellä ei-entsymaattisella reaktiolla.

vesiliuoksissa ureaa esiintyy tasapainossa ammoniumsyanaatin kanssa. On tärkeää huomata, että (1) urea liuoksessa dissosioituu spontaanisti tuottaen syanaattia ja ammoniumioneja, (2) se hajoaa isosyaanihapoksi (CNOH), joka reagoi aktiivisesti proteiinien aminoryhmien kanssa ja indusoi karbamylaatiota, ja (3) urean dissosiaationopeus ja karbamylaation laajuus riippuu lämpötilasta, pH: sta ja inkubaatioajasta.

Karbamylaation estäminen: joitakin hyödyllisiä vinkkejä

mikään ei voi muuttaa sitä tosiasiaa, että urea lämmön ja proteiinien läsnä ollessa johtaa aina karbamylaatioon. Voit käyttää korkeinta saatavilla olevaa ureaa ja silti karbamylaation vaara.

onneksi on olemassa useita tapoja suojata peptidejä karbamylaatiolta. Tässä muutamia tehokkaita strategioita, joita voidaan käyttää tämän tavoitteen saavuttamiseksi.

• käytetään aina vasta valmistettua ureapohjaista reagenssia proteomisia toimenpiteitä tehtäessä. Käytä laadukkaita kuiva ureapohjaisia esisekoitettuja ja käyttövalmiita puskureita luotettavista lähteistä ja noudata äärimmäistä varovaisuutta näytteidesi valmistelussa. Huomautus: säilytä kiinteä aine huoneenlämmössä ja pidä käsittely minimissä.
• poistetaan urea proteiininäytteestä ennen digestiota dialyysillä ja / tai nopealla käänteisfaasikromatografialla tai spin-kolonnien avulla.
• pidetään näyte suhteellisen alhaisessa lämpötilassa, jotta urean hajoamisnopeus hidastuu. Vältä ureaa sisältävien puskureiden kuumentamista yli 37oC karbamylaatioriskin vähentämiseksi.
• Deionisoidaan urealiuos ioninvaihtohartsilla syanaattipitoisuuden vähentämiseksi.
• Happamoi urealiuos (100 mM HCl) estämään isosyaanihapon muodostumista.
• käyttää reagensseja, kuten etanoliamiinia, etyleenidiamiinia, metyyliamiinia ja Tris-HCl: ää minimoidakseen proteiinin / peptidin karbamylaation. Nämä reagenssit auttavat etsimällä syanaattimolekyylejä, jolloin ne eivät ole peptidien käytettävissä.

kieltämättä näillä strategioilla on omat haittansa (ts., vaativat pidennettyä käsittelyaikaa, indusoivat helposti denaturoitujen proteiinien saostumista ja voivat olla epäsopivia lukuisille entsymaattisille digestointitekniikoille), mutta koska entsyymin digestit suoritetaan korkeissa lämpötiloissa pitkän ajan kuluessa, sinulla ei ole muuta vaihtoehtoa kuin poistaa urea digest-seoksesta. Muuten vaarana on aina karbamylaatio. Se on riski, jota et haluaisi ottaa.