Johdanto

hepatosellulaarinen karsinooma (HCC), joka edustaa primaaristen maksasyöpien merkittävää histologista alatyyppiä, on maailmanlaajuisesti viidenneksi yleisin syöpä ja kolmanneksi yleisin syöpäkuolleisuuden aiheuttaja (1,2). Maksasyöpäluvut ovat korkeimmat kehitysmaissa, erityisesti Itä-ja Kaakkois-Aasiassa sekä Keski-ja Länsi-Afrikassa,kun taas Etelä-Keski-ja Länsi-Aasiassa sekä pohjois-ja Itä-Euroopassa (3). Geneettiset muutokset ja epigeneettiset riskitekijät, kuten krooninen HBV-tai HCV-infektio, maksakirroosi, alkoholimaksatauti ja aflatoksiinit, selittävät HCC: n suurta sairastuvuutta (4-6).Kuitenkin molekyylimekanismi liittyy byhepatokarsinogeneesiin ja etenemiseen on vielä suurelta osin epäselvä.Siksi on ratkaisevan tärkeää, että selvitämme etiologiaa ja tutkimme hepatosellulaarisen carcinooman taustalla olevaa elintärkeää molekyylimuutosta ja etenemistä sekä viime kädessä parannamme nykyisiä käsitteitä tämän sairauden diagnosoimiseksi, seulomiseksi ja hoitamiseksi.

maksakarsinogeneesin aikana solusyklin tarkistuspisteiden avautuminen on tärkeä tunnusmerkki, joka voi edistää syövän muodostumista (2).solusyklin tarkistuspisteen yhtenä säätelijänä solunjakautumissykli 20 (CDC20) näyttää toimivan säätelyproteiinina solusyklin anafaasia edistävän kompleksin/syklosomin (APC / C)kanssa, jota tarvitaan anafaasin aloittamiseen ja loppuvan mitoosin poistumiseen (7,8). Kaksi säätelytekijää, CDC20 ja Cdh1 sitoutuvat suoraan APC: hen ja aktivoivat sen sykliinin ubikitinaatioaktiivisuuden mitoosin ja G1-vaiheen aikana (9,10).On raportoitu, että reseptoriin liittyvä proteiini 80(RAP80), joka värvää BRCA1: n DNA-vauriokohtiin DNA-vaurion indusoimassa ubikitinsignalointireitissä, voi hajota anafaasia edistävän kompleksin (APC/C-Cdc20) tai (APC/C-Cdh1) kautta polyubikvitinaatiolla mitoosin aikana G1-vaiheeseen (11). RAP80: n loppuminen osoitti G2-M-vaiheen tarkistuspisteen adefektiivisen kontrollin ja edisti mitoticcell-syklin etenemistä.

CDC20-ekspressio voidaan merkittävästi tukahduttaa p53proteiinilla, joka estää pahanlaatuisen transformaation säätelemällä solusykliä, solujen vanhenemista ja apoptoosiin liittyviä geenejä(12). Cdc20: n voimakasta ilmentymistä on raportoitu useissa pahanlaatuisissa kasvaimissa, kuten pankreaticductal adenokarsinoomassa (13), oraalisolusyövässä, mahasyövässä (14), kohdunkaulan syövässä (15) ja erilaisissa syöpäsoluissa (14, 16).CDC20: n ilmentymismalli ja sen kliininen merkitys ihmisen maksasolusyövässä ei kuitenkaan ole selventynyt.

tässä tutkimuksessa analysoimalla microarray-tietokokonaisuutta(liittymisnumero. GSE14520)geeniekspression Omnibus (GEO) – tietokannasta (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) huomasimme, että Cdc20 oli tärkein solmukohta HCC-molekyylien vuorovaikutusverkoissa. Weexaminoi cdc20: n ilmentymistason primaarisissa HCC-ja adjasentnon-tuumorikudoksissa ja arvioi sen kliinisenpatologista merkitystä132 arkistoidussa HCC-näytteessä. Myös Sirnan cdc20by: n tyrmäyksen vaikutusta maksasyöpäsolujen kasvuun ja solusykliin tutkittiin. Havaintomme viittaavat siihen, että CDC20: llä voi olla merkittävä rooli HCC: n kehityksessä.

materiaalit ja menetelmät

bioinformatiikka-analyysi

Mikroarray-aineisto GSE14520 (17) ladattiin GEO: lta. Tutkimuksessa käytettiin yhteensä 183 HCC: tä ja 179 vastaavaa parasyöpäkudosta, jotka määritettiin Affymetrix U133A-Geenisipsillä kohortin 2 Kiinalaispotilaasta. Geeniekspressioprofilointitietoja tiivistettiin uudelleen RMA-menetelmällä(18) ja Entrez-geenikeskeisillä CDF-tiedostoilla (19) (originalAffymetrix CDF-tiedostojen sijaan), jotka suodattivat genechipsin epäspesifisiä koettimia ja yhdistivät useita sameEntrez-geeniä edustavia koettimia yhdeksi koettimeksi. Mikroarrayn merkitsevyysanalyysi (SAM) (20) tehtiin HCC: n ja vastaavien para-karsinooman kudosten välisten eri geenien tunnistamiseksi. Deltaksi asetettiin 2,25 ja raja-arvoksi ofFDR 0,001. HCC: ssä yli-ilmentyneitä geenejä tutkittiin yli 50 HCC-kudoksessa, mutta alle 10vastaavaa parasyöpäkudosta. Geenit analysoitiin GenCLiP Softwaren (21) (http://ci.smu.edu.cn) avulla geenien toimintojen ja molekyylien vuorovaikutusverkostojen kirjaamiseksi.

eettinen lausunto

kliinisiä näytteitä käytettiin vain tutkimustarkoituksiin. Hyväksyntä saatiin ChinesePLA General Hospitalin eettiseltä komitealta (LREC 2012/40). Kaikki näytteet kerättiin sillä edellytyksellä, että potilailta on saatu etukäteen kirjallinen tietoon perustuva suostumus.

potilaat ja kudosnäytteet

kuusitoista paria tuoreita HCC: tä ja viereisiä ei-kasvaimia, joita käytettiin reaaliaikaisiin PCR-ja western blot-analyyseihin, kerättiin leikkauksen aikana Kiinan PLA General Hospitalissa(Peking, Kiina) marraskuusta 2012 helmikuuhun 2013. Kudokset jäätyivät nestemäiseen typpeen, kunnes niitä käytettiin. Parafiiniin upotettuja, arkistoituja HCC-kudoksia ja niiden vieressä olevia muita kuin kasvainkudoksia, joita käytettiin IHC: n (immunohistokemian) yhteydessä, saatiin 132: lta HCC-potilaalta, joilta tehtiin osittainen maksan resektio samassa sairaalassa tammikuun 2006 ja joulukuun 2007 välisenä aikana. Potilaiden mediaani-ikä oli 52 vuotta (vaihteluväli 24-80 vuotta).

soluviljelmä

yksi normaali maksasolulinja (LO2) ja kolme HCC-solulinjaa (HepG2, Smmc7721, Huh7) ostettiin American TypeCulture Collectionista (ATCC, Manassas, VA) tai Kiinan tiedeakatemian Solupankista ja niitä ylläpidettiin Institute of biotechnology, Academy of Military Medical Sciences. Kaikki solut säilytettiin dulbeccon muunnellussa Eagle-elatusaineessa (Dmem, Invitrogen,CA), jota täydennettiin 10-prosenttisella sikiön naudan seerumilla (FBS, Gibco,Carlsbad, CA) ja 2 mM L-glutamiinilla, 100 U/ml penisilliinillä, 100 µg/mlstreptomysiinillä 37°C: ssa ja 5% CO2: lla.

RNA-uutto, cDNA-synteesi andreaaliaikainen PCR-analyysi

kokonais-RNA uutettiin solulinjoista ja kudosnäytteistä trizolireagenssilla (Invitrogen) valmistajan ohjeiden mukaan. Yhteensä 2 µg RNA: ta käännettiin Transgen Biotechin TransScript-ja cDNA-Synteesipaketilla (Peking, Kiina). Real-time PCR was performed toexamine CDC20 mRNA level in cell lines and tissue samples by usinga Bio-Rad iQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad,Hercules, CA). β-actin was used as an internal control fornormalization. PCR primers were designed using the Primer Premier 5software and the sequences were: CDC20 forward,5′-TCGCATCTGGAATGTGTGCT-3′; and reverse,5′-CCCGGGATGTGTGACCTTTG-3′; β-actin forward,5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′; and reverse, 5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′. Ekspressiotiedot normalisoitiin kodinhoitogeenin β-aktiinin geometriseksi keskiarvoksi ja laskettiin ΔΔCt: llä (22), ja tulokset ilmaistiin 2−ΔΔCt: llä.

Western blot analysis

Western blot analysis tehtiin standardiprotokollan mukaisesti. SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesia (10%) käytettiin erottamaan proteiini, joka sitten sähkösiirrettiin geelistä polyvinylideenifluoridikalvolle (PVDF). Sen jälkeen, kun kalvoa oli blokkattu 5%: lla kuivattua rasvatonta maitoa 1 tunnin ajan, siihen lisättiin kanin anti-human CDC20 polyklonaalinen vasta-aine(1: 1000, Bioworld Technology, St. Louis Park, MN) 1 h huonelämpötilassa. Hiiren anti-human α-tubuliini monoklonaalinen vasta-aine(1: 5 000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) käytettiin sisäisenä kontrollina. Kun kalvo oli pesty Tris-puskuroidulla suolaliuoksella withTween-20 (TBST) kolme kertaa, se inkuboitiin piparjuuriperoksidaasikonjugoidulla vasta-aineella rabbitor-hiirtä vastaan (laimennos 1:5 000). Kemiluminesenssitunnistuksessa käytettiin Immobon Western Chemiluminescent HRP Substratekit (Millipore Corporation, Billerica, MA).

immunohistokemia (IHC) ja

immunohistokemia Cdc20-ilmentymälle HCC: ssä ja adjacent-muissa kuin kasvainnäytteissä suoritettiin standardimenetelmillä.Kudososia inkuboitiin lyhyesti kanin anti-Cdc20-laimennetulla 1:200: lla (Bioworld-tekniikka) yön yli 4°C: ssa.negatiivisena kontrollina käytettiin naudan seerumalbumiinia (1%; BSA) ilman primaarista vasta-ainetta. Toissijainen poly-piparjuuriperoksidaasi (HRP)Anti-kani IgG-vasta-aine (ZSGB-Bio, Peking, Kiina) inkuboitiin huoneenlämmössä 20 min.

kaksi patologiaosallisti kaikki immunologiset osiot toisistaan riippumatta sokkona ilman tietoa kliinisenpatologisista tiedoista h-pisteytysmenetelmän perusteella, jossa värjäytymisvoimakkuus otetaan huomioon yhdessä positiivisten solujen värjäytymisprosentin kanssa (23,24).H-pisteytysmenetelmää varten valittiin satunnaisesti 10 kenttää ×400magnifikaatiolla. Solujen värjäysintensiteetiksi arvioitiin 0,1, 2 ja 3, mikä vastaa negatiivista, heikkoa, keskivaikeaa ja voimakasta värjäystä. Kussakin kentässä laskettiin kullakin intensiteetillä värjäytyneiden solujen ja solujen kokonaismäärä. H-pistemäärä laskettiin seuraavalla kaavalla: (%soluista värjätty, atintensiteettiluokka 1×1) + (%soluista värjätty intensiteettiluokalla 2×2) + (%soluista värjätty intensiteettiluokalla 3×3). H-scoresvaried 0-300 jossa 300 edusti 100% soluista stronglystained (3+) (24). Korkea Cdc20-ekspressio määriteltiin värjäytymiseksi h-pisteytykseksi soluissa ≥200.

pienten interferingRNA (siRNA)

kaksijuosteinen, pieni interferoiva RNA (siRNA) on genepharman (Shanghai, Kiina) puhdistama ja puhdistama. Ihmisen cdc20-koodausaluetta vastaavat seuraukset olivat: sense, 5 ’-GGAGCUCUCAGGCCA UUU-3′; antisense,5′-AUGGCCUGAGAUGCUCUCCUU-3’. Torjuntaan käytettiin sekavaa, ei-tähtäävää sirnaa. Nämä sirnat liuotettiin indietyylipyrokarbonaattiveteen (DEPC), jolloin pitoisuus oli 20µm. Maksasyövän HepG2-soluja käsiteltiin CDC20 siRNA – ornegatiivisella kontrolli-sirnalla 20 nM: ssä interferonin invitro siRNA-transfektioreagenssilla (Polyplus Transfection, NewYork, NY).

kvantitatiivista reaaliaikaista PCR-ja western blot-analysointia käytettiin sicdc20: n interferenssivaikutuksen havaitsemiseen. Kontrolliryhminä olivat solut, jotka olivat hoitamattomia tai joita käsiteltiin negatiivisella kontrollilla sirnaoligonukleotideilla.

soluproliferaatiokoe

kahteen 25 cm2 muoviseen pulloon yhdistettiin 2×105 maksasyöpäsolua (HepG2), joista sitten siirryttiin 20 nM negatiivisella kontrollilla siRNA: lla ja CDC20siRNA: lla 48 tunnin inkubaatiota varten. Tämän jälkeen solut sulatettiin ja kylvettiin 6-kuoppaisiin levyihin, joissa oli 2 ml väliainetta kuoppaa kohti.Sen jälkeen solut hyvin pilkottiin ja laskettuautomated solulaskuri (Invitrogen) 24 tunnin välein kunnes viides päivä.

fluoresenssilla aktivoidun solun lajittelutesti

siRNA cdc20: lle ja negatiiviselle kontrollille sirnaoligonukleotidit siirrettiin HepG2-soluihin in vitro siRNA-transfektioreagenssilla 48 tunnin ajan.kun tymidiiniä(Sigma-Aldrich, St. Louis,MO) oli käsitelty 24 tunnin ajan, solut kerättiin 0, 3, 6, 9, 12-h tymidiinin poistaminen väliaineesta ja kiinnittyminen 70-prosenttiseen alkoholiin.Ennen analyysejä solut pestiin PBS: llä, käsiteltiin 1 mg/mlrnaasi A: lla 37°C: ssa 30 minuutin ajan ja värjättiin sitten propidiumjodidilla(pi). Analyysit teki Bd Factscalibur (Becton-Dickinson,Franklin Lakes, NJ) ja tulokset analysoitiin WinMDI Version 2.9-ohjelmistolla.

Tilastoanalyysit

kaikki tilastoanalyysit tehtiin IBMSPSS 20.0-tilasto-ohjelmistopakettia käyttäen. Yksisuuntaista analyysiä ofvariance (ANOVA) käytettiin vertaamaan cdc20: n mrnanormalisoidun ilmentymistä β-aktiiniin solulinjoissa. Samaa menetelmää käytettiin myös verrattaessa normaalien kasvainnäytteiden histologista erilaistumista normaaleihin maksanäytteisiin. Kahden ryhmän datavertailut tehtiin opiskelijan t-testillä. Χ2-testiä käytettiin CDC20-ilmaisun ja klinikopatologisten piirteiden välisen suhteen analysointiin. Bivariaattikorrelaatiot eri variaabelien välillä laskettiin Spearmanin korrelaatiokertoimien avulla.Tilastollisen merkitsevyyden tasoksi asetettiin p<0,05 alltesteille.

tulokset

CDC20 on tärkein solmukohta HCC: n molekulaarisissa interaktioverkoissa

SAM-analyysi tunnisti 4 358 geeniä yli-ilmentynyttä inHCC: tä, jossa 137 geeniä ilmaistiin yli 50 HCC: n kudoksessa,mutta alle 10 para-karsinooman kudoksessa. GenCLiP-analyysi osoitti, että 137 geenistä 72 geeniä liittyi solusykliin(P=1,238 e-15, χ2-testi), 19 geeniä oli sukua pindle-kokoonpanolle (P=2,172 E-55, χ2-testi) ja 26 geeniä liittyi kromosomien erotteluun (P=5,472 E-55, byx2-testi). 137 geenillä rakennetuista molekyyliverkoista CDC20 oli tärkein solmu, jonka ei ole aiemmin raportoitu liittyvän HCC: hen. Yhdeksän geeniä (NEK2, E2F1,BUB1, BUB1B, AURKB, CCNB1, CCNB2, UBE2C ja CDKN2A) tunnetaan interact CDC20: n kanssa, joissa 7 geeniä liittyi spindleassembly checkpoint (SAC) – geeniin (Kuva.1). SAC: n tavoite on CDC20 (25). Näin pääteltiin,että HCC: ssä cdc20: n yliekspressio johtaa SAC: n puuttumiseen ja soluista tulee nopeasti aneuploidisia.

CDC20 on yliekspressoitunut HCC: ssä

kvantitatiivista reaaliaikaista PCR: ää käytettiin cdc20: n transcript-tason tutkimiseen kolmessa HCC-solulinjassa (HepG2, Smmc-7721 ja Huh7) ja yhdessä normaalissa maksasolulinjassa (LO2). CDC20 mRNA-taso oli korkeampi kaikissa kolmessa HCC-solulinjassa kuin normalcell-solulinjassa (Kuva. 2).

sen määrittämiseksi, onko cdc20: n säätely HCC-solulinjoissa samanlaista HCC-potilailla, suoritimme kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR: n 16 parilla HCC: n ja adjacentnormaalin maksakudoksen kanssa. Kuten kuvassa.3A, CDC20: n havaittiin olevan eri tavoin yliekspressoitunutta kaikissa tutkituissa ihmisen primaarisissa HCC-näytteissä verrattuna samoilta potilailta saatuihin ei-syöpänäytteisiin. Lisäksi cdc20 mRNA: n kasvain/ei-kasvain(T/NT)-suhde oli vähintään >2-kertainen kaikissa näissä 14 ylös säädetyssä näytteessä, ja korkein suhde oli jopa noin 40-kertainen. Cdc20: n proteiinipitoisuus vahvistettiin Kaikissa 16: ssa parillisessa kudosnäytteessä western blot-analyysillä. Kuva J1.47v-ohjelmistoa käytettiin kvantisoimaan kunkin kaistan harmaa taso ja laskemaan kunkin potilaan cdc20 T/NT-suhde normalisoituen tubuliinin kanssa. Tulokset osoittivat, että kaikissa tutkituissa HCC-näytteissä cdc20-proteiinin ekspressiotaso oli korkeampi paitsi näytteissä 1 ja näytteessä 4, joka oli mRNA-tason mukainen(Kuva. 3b). Nämä löydökset viittasivat siihen, että cdc20: n säätely oli yleisesti lisääntynyt joko HCC-kudoksissa tai sellulinjoissa.

Cdc20proteiinin Immunohistokemiallinen värjäys

immunohistokemia (IHC) suoritettiin cdc20-proteiinin ekspression ja lokalisoinnin analysoimiseksi 132paraffiniin sulautetussa arkistoidussa HCC-kudosnäytteessä, joista 14 oli hyvin erilaistuneita, 78 kohtalaisia erilaistuneita ja 40 heikosti erilaistuneita kasvaimia. Cdc20-proteiinin säätely suureni (h-score ≥200) 90: ssä (68, 18%) 132 HCC-kudoksesta. Kuten infig. 4A, suuria cdc20-pitoisuuksia esiintyi primaarisissa HCC-leesioissa, ja positiivinen värjäytyminen oli pääasiallisesti sytoplasmassa ja ytimissä. Sitä vastoin CDC20 värjäytyi negatiivisesti tai heikosti vastaavissa kasvaimettomissa kudoksissa. Vertaamalla kvantitatiivisesti CDC20-värjäyksen pistemääriä 132arkistetun HCC: n ja sen viereisten muiden kuin kasvainkudosten (mm.hepatokirrhoosi ja hepatiitti) välillä, CDC20-värjäyksen pistemäärät lisääntyivät huomattavasti HCC-näytteissä verrattuna peritumoraalinäytteisiin (Kuva. 4b). Lisäksi cdc20-värjäyksen pistemäärät lisääntyivät merkittävästi sekäkasvaimen histologisen erilaistumisen eteneminen hyvin korkeasti erilaistuneista kudoksista (Kuva.5).

korrelaatio kohonneen Cdc20-ekspression ja HCC: n klinikanpatologisten parametrien välillä

CDC20-proteiiniekspression ja 132 HCC-potilaan klinikanpatoligaanisen piirteen välistä suhdetta analysoitiin lisää. Kuten taulukossa I on tiivistetty, CDC20-lauseke liittyi merkittävästi sukupuoleen (P=0, 013), kasvaindifferentiaatioon (P=0, 000), TNM-vaiheeseen (P=0, 012), p53: een ja Ki-67-ekspressioon (P=0, 023 ja P=0, 007). Nostatistisesti merkittävä yhteys havaittiin kuitenkin korkean Cdc20-ekspression ja muiden kliinisten patologisten ominaisuuksien välillä, mukaan lukien ikä, kasvaimen koko, HBV-infektio, seerumin AFP-taso,maksakirroosi, verisuonten invaasio ja intra/extra maksan etäpesäke. Keihäskorrelaatioanalyysi paljasti, että cdc20: n korkea ilmentymä liittyi läheisesti sukupuoleen (R=0, 215, P=0, 013), köyhempään kasvaindifferentiaatioon (R=0, 421,p<0, 001), edistyneeseen TNM-lavastukseen(R=0, 218, P=0, 012), p53: n korkeampaan ilmentymistasoon (R=0, 212, P=0, 014) ja Ki-67 (R=0, 235, P=0, 007) (taulukko II). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että CDC20: tä esiintyi runsaasti HCC-kudoksissa ja että sen ekspressio korreloi läheisesti HCC: n erilaistumisen ja vähenemisen kanssa.

Cdc20-lausekkeen suppressio bysiRNA

kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR paljasti 90% transkriptiotasoisen cdc20: n suppression 48 h: ssa sicc20: n transfektion jälkeen verrattaessa käsittelemättömään solut tai cellstransfected kanssa negatiivinen kontrolli sirna (kuva. 6A) (p<0, 0001). Western blotanalyysi osoitti myös, että cdc20-proteiinin taso 48 h tukahdutettiin selvästi sicc20-transfektion jälkeen (kuva. 6b). Myös sykliiniriippuvaisen kinaasi-inhibiittorin 1A (p21)-proteiinin muuttunutta ilmentymistä tutkittiin western blot-analyysissä, ja tulokset osoittivat, että P21proteiinitaso oli huomattavasti korkeampi CDC20: n suppression vuoksi (kuva. 6b).

CDC20-suppression vaikutus soluproliferaatioon ja solusykliin

solujen proliferaatiokoe osoitti, että cdc20 sirnan transfektoitujen solujen solukasvu oli huomattavan estynyt verrattuna soluihin, joihin transfektoitiin negatiivisella kontrollilla siRNA(Kuva. 6c). Sicdc20: n aikaansaamaan soluproliferaation estoon odotettiin liittyvän solusyklin metafaasin esto. Virtaussytometriatestillä havaittiin G2/M-vaiheen solujen määrän kasvaneen sicdc20-transfektoiduissa soluissa verrattuna negatiivisella kontrollilla sirnalla transfektoituihin soluihin (Kuva. 6D). Nämä tiedot osoittivat, että CDC20: n tukahduttaminen esti solujen kasvua vähentämällä G2/M-vaiheen pysähtymistä.

Keskustelu

mikroarraydatasetin bioinformatiikan analyysissä GEO-tietokannasta tunnistimme CDC20: n, joka oli HCC-molekyylien vuorovaikutusverkostojen pääindeksi, se liittyi solusyklin spindle assembly checkpoint (SAC) – tarkastuspisteeseen. Duringtumorigenesis, vikoja tai häiriöitä Kara assemblycheckpoint ajateltiin olevan vastuussa lisääntynyt määrä ofaneuploidization (26). Mondalet al ovat raportoineet, että cdc20 on yliekspressoitunut pään ja kaulan alueen kasvaimissa sekä useissa oraalisen okasolusyövän solulinjoissa. CDC20: n korkea ekspressiotaso OSCC-soluissa liittyy ennenaikaiseen anafaasiedistymiseen, mikä johtaa mitoticabnormaliteetteihin (27). Tutkimukset ovat myös osoittaneet, että korkea CDC20-ekspressio havaitaan oraalisolusyövässä ja kolorektaalisyöpäkudoksissa, ja sen yliekspressio voi ennustaa huonoa ennustetta potilaille (28, 29).

CDC20 tarvitaan myös myöhäisten anafaasisolujen toeksitille mitoosista (30). TargetingCDC20 johtaa mitoosin poistumisen estämiseen, mikä voi olla parempi syövän terapeuttinen strategia syöpäsolujen tappamiseksi tehokkaammin kuin karaa häiritsevät lääkkeet (31). Wang ym. raportoivat, että cdc20, joka voi toimia onkoproteiinina ihmisen syöpien lisääntymisen ja kehittymisen edistämiseksi, on lupaava terapeuttinenkohde (32). Vaikka CDC20: n osuutta useiden ihmisten tuumorigeneesissä ja ennusteessa on tutkittu ja vahvistettu perusteellisesti, rajoitetuissa tutkimuksissa on selvitetty CDC20: n mahdollista toimintaa maksasolusyövän aloittamisessa ja etenemisessä.

tässä tutkimuksessa arvioimme cdc20: n ilmentymistasoa 16: ssa parillisessa tuoreessa pakastetussa HCC-kudoksessa ja niitä vastaavissa ei-kasvainnäytteissä. Tulokset osoittivat, että cdc20: n keskimääräinen mRNA-ja proteiinitaso HCC-kudoksissa oli paljon korkeampi kuin muissa kuin kasvainkudoksissa. Immunohistokemiaa käytettiin CDC20: n subsellulaarisen sijainnin tutkimiseen ja sen suhteutumiseen HCC: n kliinisiin patologisiin parametreihin patients.By χ2-testin avulla havaitsimme, että korkeampi cdc20-proteiniekspressiotaso liittyi sukupuoleen,kasvaimen erilaistumiseen, TNM-vaiheeseen, P53: een ja Ki-67: ään. Tutkiakseen cdc20: n potentiaalista biologista funktiota ja molekyylimekanismia HCC: ssä wedesigned kaksijuosteinen, pieni häiritsevä RNA (siRNA) targetingCDC20 häiritsemään sen ilmentymistasoa HepG2-solulinjassa. Cellular proliferation assay and FACS test, we found thatcells transfected with siCDC20 oligonukleotides showed drazedgrowth speed and increased ratio of cells in G2 / M stage.

sirnan spesifinen cdc20: n tyrmäys osoitti tukevaa vaikutusta maksasyöpäsolujen proliferaatiota invitroa vastaan, mikä osoitti, että cdc20: n yliekspression voidaan odottaa nopeuttavan solujen proliferaatiota ja edistävän HCC: n kasvainaloittumista ja etenemistä. Maksasyöpäsolut, joilla oli suppressoitu CDC20-ilmentymä, indusoituivat kertymään inG2 / M-faasi, joka voi olla vastuussa solukasvun estymisestä. Sykliinistä riippuvainen kinaasi-inhibiittori 1A (p21), jonka tiedetään osallistuvan G2/M-tarkastuspisteeseen (33), osoittautui säädellyksi, kun cdc20-lauseke erityisesti estettiin maksan syöpäsoluissa. P21 voi estää CDKs: n toimintaa, joka johtaa fosforyloimattoman RB-tuumorisuppressoriproteiinin kumuloitumiseen, mikä estää E2F: n transkriptioaktivaation ja estää myöhemmin solujen pääsyn solusyklin s-vaiheeseen(34).

yhteenvetona voidaan todeta, että tämä on ensimmäinen tutkimus, jonka tarkoituksena on tutkia CDC20: n ilmentymistä HCC: n kudoksissa ja solulinjoissa. Cdc20: n molekyylimekanismeja koskevat lisätutkimukset HCC: n aloittamisessa ja edistymisessä sekä cdc20: n ennusteellista merkitystä koskeva tutkimus ovat kuitenkin tarpeen.

kiitokset

kirjoittajat kiittävät kollegoitaan Sotilaslääketieteen Akatemian biotekniikan instituutista teknisestä tuesta.

	Parkin DM: Global cancer statistics in theyear 2000. Lancet Oncol. 2:533–543. 2001.PubMed/NCBI
	El-Serag HB and Rudolph KL: Hepatocellularcarcinoma: epidemiology and molecular carcinogenesis.Gastroenterology. 132:2557–2576. 2007. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Jemal a, Bray F, Center MM, Ferlay J, WardE ja Forman d: Global cancer statistics. CA Cancer J Clin.61:69–90. 2011. Katso artikkeli: Google Scholar
	Severi T, van Malenstein H, Verslype C andvan Pelt JF: Tumor initiation and progression in hepatocellularcarcinoma: risk factors, classification, and therapeutic targets.Acta Pharmacol Sin. 31:1409–1420. 2010. Katso Artikkeli: Google Scholar : PubMed / NCBI
	Michielsen P ja Ho E: virushepatiitti yhtye hepatosellulaarinen karsinooma. Acta Gastroenterol Belg. 74:4–8.2011.
	McGivern Dr and Lemon SM: Virus-specificmechanoms of carcinogenesis in hepatiitti C virus associated livercancer. Onkogeeni. 30:1969–1983. 2011. Katso artikkeli : Google Scholar: PubMed/NCBI
	Fung TK ja Poon RY: Vuoristorata mitoottisten sykliinien kanssa. Semin Cell Dev Biol. 16:335–342. 2005.Katso artikkeli : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Weinstein J, Jacobsen FW, Hsu-Chen J, Wu Tand Baum LG Saccharomyces cerevisiae-solunjakautumissyklin proteiinien homologia cdc20 ja cdc4. Mol Cell Biol. 14:3350–3363. 1994.
	Peters JM: Solubiologia: checkpointbrake helpottunut. Luonto. 446:868–869. 2007. Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Fang G, Yu H ja Kirschner MW: Cdc20-proteiiniperheen jäsenten Directbinding aktivoi anafaasia edistävän kompleksin mitoosissa ja G1: ssä. Mol Cell. 2:163–171.1998. Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Cho HJ, Lee EH, Han SH, et al: Ihmisen RAP80: n hajoamista säätelevät cdc20-ja Cdh1-ubikitinligaasit. Mol Cancer Res. 10: 615-625. 2012. Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Kidokoro T, Tanikawa C, Furukawa Y,Katagiri t, Nakamura Y ja Matsuda K: CDC20, mahdollinen cancerterapeuttinen kohde, on p53: n negatiivisesti säätelemä. Onkogeeni.27:1562–1571. 2008. Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Chang DZ, Ma Y, Ji B, et al: IncreasedCDC20 expression liittyy haiman ductaladenocarcinooma erilaistumista ja etenemistä. J Hematol Onkol.5:152012. Katso artikkeli: Google Scholar:PubMed/NCBI
	Kim JM, Sohn HY, Yoon SY, et al: Identification of mahasyöpään liittyvät geenit using a cDNAmicroarray containing novel expressed sequence tags expressed ingastric cancer cells. Clin Cancer Res. 11: 473-482. 2005.PubMed/NCBI
	Espinosa AM, Alfaro A, Roman-Basaure E, etal: mitoosi on potentiaalisten merkkiaineiden lähde kohdunkaulasyövän seulontaan ja elintoimintojen ja hoitotavoitteiden määrittämiseen. PloS Yksi.8:.PubMed/NCBI
	Ouellet V, Guyot MC, Le Page C, et al:Tissue array analysis of expression microarray candidatesidies identifies markers related to tuumor grade and outcome inerous epitelous obarary cancer. Int J Syöpä. 119:599–607. 2006.Katso artikkeli: Google Scholar
	Roessler S, Jia HL, Budhu A, et al: auniquen etäpesäkkeiden geenimerkintä mahdollistaa kasvainrelapsen ennustamisen varhaisvaiheen maksasolusyöpäpotilailla. CancerRes. 70:10202–10212. 2010. Katso artikkeli: Google Scholar
	Irizarry RA, Hobbs B, Collin F, et al:Exploration, normalization, and summaries of high densityoligonukleotide array probe level data. Biostatistiikkaa. 4:249–264.2003. Katso artikkeli: Google Scholar
	dai M, Wang P, Boyd AD, et al: Evolvinggene / transkription määritelmät muuttavat merkittävästi GeneChip-tietojen tulkintaa. Nukleiinihapot Res. 33:E1752005. Katso artikkeli: Google Scholar:PubMed/NCBI
	Tusher VG, Tibshirani R and Chu G: Signativity analysis of microarrays applied to the ionizingradation response. Proc Natl Acad Sci USA. 98:5116–5121. 2001.Katso Artikkeli: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Huang ZX, Tian HY, Hu ZF, Zhou YB, Zhao Jand Yao KT: GenCLiP: a software program for clustering gene Lists by literature profiling and construction geeni co-occurrencenetworks related to custom avainsanoja. BMC bioinformatiikka. 9:3082008.Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Adhikary s and Eilers M: transcriptional Regulation and transformation by Myc proteins. Nat Rev Mol CellBiol. 6:635–645. 2005. Näköalahakemisto : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Detre S, Saclani Jotti G and Dowsett M: A’quickscore’ method for immunohistochemical semiquantitation:validation for oestrogen receptor in breast carcinomas. J ClinPathol. 48:876–878. 1995.
	Früh MPM: EGFR IHC score for selection ofcetuximab treatment: Ready for clinical practice? Transl LungCancer Res. 1:145–146. 2012.
	Hwang LH, Lau LF, Smith DL, et al: Buddingyeast Cdc20: karan tarkistuspisteen kohde. Tiede.279:1041–1044. 1998. Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Kops GJ, Weaver BA and Cleveland DW: Oneply road to cancer: aneuploidy and the mitotic checkpoint. Nat RevCancer. 5:773–785. 2005. Katso Artikkeli: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Mondal G, Sengupta S, Panda CK, Gollin SM,Saunders WS ja Roychoudhury S: Cdc20: n yliekspressio johtaa karan kokoonpanotarkastuspisteen vaurioitumiseen ja suusyöpään. Karsinogeneesi. 28:81–92. 2007. Katso artikkeli: Google Scholar:PubMed/NCBI
	Moura IM, Delgado ML, Silva PM, et al: Korkea CDC20-ilmentymä liittyy oralsquamous cell carcinoma-karsinooman huonoon ennusteeseen. J Oral Pathol Med. 43:225–231. 2013.Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Wu WJ, Hu KS, Wang DS, et al: CDC20overexpression ennustaa huonoa ennustetta kolorektaalisyöpäpotilaille. J Transl Med. 11:1422013. Katso artikkeli : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Yeong FM, Lim HH, Padmashree CG ja SuranaU: poistuminen mitoosista orastavassa hiivassa: kaksivaiheinen inaktivaatio theCdc28-Clb2-mitoottisessa kinaasissa ja cdc20. Mol Cell.5:501–511. 2000. Katso artikkeli: Google Scholar:PubMed/NCBI
	Huang HC, Shi J, Orth JD ja Mitchison TJ: Evidence that mitotic exit is a better cancer therapeutic targetthan Kara assembly. Syöpäsolu. 16:347–358. 2009. Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Wang Z, Wan L, Zhong J, et al: Cdc20: apotential novel therapeutic target for cancer treatment. Curr PharmDes. 19:3210–3214. 2013. Katso Artikkeli: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Bunz F, Dutriaux a, Lengauer C, et al:vaatimus p53: lle ja p21: lle G2: n pysäyttämiseksi DNA-vaurion jälkeen.Tiede. 282:1497–1501. 1998. Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Wells J, Boyd KE, Fry CJ, Bartley SM andFarnham PJ: kohdegeenin spesifisyys E2F: stä ja taskuproteiiniperheen jäsenistä elävissä soluissa. Mol Cell Biol. 20:5797–5807. 2000.Näytä Artikkeli : Google Scholar