Keskustelu

tässä tutkimuksessa on selvitetty SR luminal Ca: ta sitovan proteiinin, CSQ2: n rooli eksitaatio-supistumiskytkennän säätelyssä ja CICR: n rooli sydämessä. Erityisesti, osoitamme, että Ad-välitteinen yli-ekspressio CSQ2 dramaattisesti lisääntynyt suuruus sekä solujen keskimäärin ICa indused Ca transientit ja spontaani Ca kipinöitä eristyksissä sydänsolujen. Näiden Ca-signaalien nousuvaiheen ja muutosnopeuden analysointi osoitti, että niiden kasvanut koko johtui Sr: stä peräisin olevien Ca-vapautumisvirtojen hidastuneesta päättymisestä. aktiivisen Ca-vapautumisen lisäksi SR Ca-varastojen toiminnallisen latauksen dynamiikka hidastui myös soluissa, joissa CSQ2-proteiinitasot olivat koholla, mikä näkyi hidastuneena palautumisaikana toistuville Ca-KIPINÖILLE. Myosyyttien tulokset olivat päinvastaiset. CSQ2-tasot pienenivät ad-välitteisellä antisense-transduktiolla. Näissä myosyyteissä näkyi lyhyempi Ca-vapautuminen, mutta nopeutettu Ca-vapautumiskohtien palautuminen. Lisäksi ajoittain stimuloiduissa myosyyteissä, joissa CSQ2-tasot laskivat, isoproterenolin käyttö aiheutti rytmihäiriöitä solunsisäisissä värähtelyissä . Nämä tulokset osoittavat, että CSQ2 on keskeinen SR Ca-vapautusfunktion määrittäjä, joka vaikuttaa Ca-vapautumisen kestoon ja vapautumiskohdan refractorisiteettiin. Kun otetaan huomioon havaitut isoproterenolista riippuvaiset häiriöt rytmisessä Ca-pyöräilyssä myosyyteissä, jotka ilmentävät csq2: ta, tuloksemme ovat merkityksellisiä csq2-geenin mutaatioihin liittyvien katekoliamiinin aiheuttamien rytmihäiriöiden solumekanismien ymmärtämisessä.

CSQ2: n toiminnan molekyylimekanismit. Yhdistämme CSQ2: n havaitut vaikutukset Sr Ca: n vapautumiseen tämän proteiinin kykyyn toimia molekyylipuskurina, joka ohjaa vapaata SR luminal-avaruudessa (KS.ehdotettu kuvio Kuvassa. 5). Lipidikerrostutkimuksista tiedetään, että Ca: n sitoutuminen RYR-kompleksin luminaaliosaan (eli luminal Ca-anturi) lisää kanavan aktiivisuutta, kun taas alemmassa luminaalissa kanavan aktiivisuus vähenee (EC50 ≈ 1 mM; ref. 26). Koska monet pyörremyrskyt olisivat aktivoituneessa tilassa normaalissa lepotilassa luminaalin Ca-tasoilla (≈1 mM), luminaalin alentaminen vapautusprosessin aikana vähentäisi siten kanavan yleistä aktiivisuutta (prosessia kutsutaan luminaalin Ca-riippuvaiseksi deaktivoinniksi; ref. 3). Tuloksemme viittaavat siihen, että stabiloimalla paikallista vapaata luminaalia RyRs: n läheisyydessä vapautumisprosessin aikana CSQ2 hidastaa luminal Ca: sta riippuvaista RYR-kanavan sulkeutumista, mikä lisää Sr: stä vapautuvan Ca: n määrää sytosoliin. CSQ2 ohjaa myös vapaan SR: n palautumisdynamiikkaa Ca: n takaisinoton aikana toimimalla Ca: n nieluna SR lumenissa. Näin CSQ2 paitsi voimistaa SR Ca: n poistumista myös vakauttaa CICR: ää moduloimalla Ca: n vapautumiskohtien toiminnallista palautumista eli valmiutta jokaisen vapautumisen jälkeen. Äskettäin olemme vedonneet samanlaiseen mekanismiin selittääksemme SR: ään ladattujen alhaisen affiniteetin Ca-kelaattoreiden (orgaanisten suolojen) vaikutukset Ca-vapautumiseen (3). Tämän hetkisten löydöstemme merkitys on siinä, että ne osoittavat, miten vapautumisprosessia ohjaa endogeeninen, Sr-residentti Ca: ta sitova proteiini CSQ2. Ne paljastavat myös alentuneiden CSQ2-määrien patologiset seuraukset sydänsolujen SR: ssä.

on ehdotettu, että CSQ2 voisi vaikuttaa Ca-vapautumiskanavan toimintaan suorien interaktioiden kautta Ca-vapautuskanavakompleksin muodostavien proteiinien (esim.RyR, junctin ja / tai triadiini) kanssa (viite. 13; uudelleentarkastelua varten katso viite. 9). Tutkimuksemme eivät ole osoittaneet merkittäviä eroja SR Ca: n vapautumisparametreissa niiden solujen välillä, jotka sisältävät noin 3-kertaisesti kohonneita CSQ2-proteiinin tasoja, ja niiden solujen välillä, joissa orgaaniset Puskurit on ladattu SR: ään (3). Näin yksinkertaisin selitys havainnoillemme on, että CSQ2: n pääasialliset vaikutukset Sr Ca: n vapautumiseen johtuvat tämän proteiinin puskurointitoimista SR: n sisällä. Csq2: n ja siihen liittyvien proteiinien, kuten junctin ja triadin säätelevät Ca: n vapautumista, yksityiskohtaisen mekanismin selvittäminen on odotettava tutkimuksia, joihin liittyy näiden proteiinien tasojen manipulointia ja mutanttimuotojen ilmentymistä, joilla on muuttunut kyky vuorovaikutukseen keskenään ja RyR: n kanssa.

Stimuloiduista myosyyteistä vapautuvan Ca: n maksiminopeus oli sama riippumatta SR: ssä (viikunoissa) ilmoitetuista CSQ2-määristä. 2B ja 3D). Nämä tulokset tukevat käsitystä, että CSQ2 ohjaa vapautumisprosessin päättymistä, mutta nämä tulokset eivät ole sellaisia , joita välttämättä ennustettaisiin tämän proteiinin odotettujen puskurointivaikutusten perusteella SR: ssä. itse asiassa enimmäisvapautumisnopeuden odotetaan olevan suurempi soluissa, joissa luminaalin Ca-puskurointivahvuudet ovat lisääntyneet vapaan SR: n sisäisen SR: n hidastuneen laskun vuoksi, koska näissä soluissa Ca-gradientin viivästyneen laskun koko SR-kalvolla odotetaan tekevän suuremmat Ca-vuon intensiteetit. Useat mahdolliset syyt selittävät, miksi tätä ei havaittu. Yksi mahdollisuus on, että alkuperäinen vapaa intra-SR voi olla alhaisempi CSQ2-yli-ilmentyvissä soluissa kuin CSQ2-Ali-ilmentyvissä soluissa. Vaikka vakaan tilan vapaaseen tilaan suljetussa tilassa, kuten SR: ään, ei pitäisi vaikuttaa Ca: n sitoutumiskohtien lukumäärä (tämän pitäisi vaikuttaa vain kinetiikkaan, jolla saavutetaan vakaan tilan intra-SR), on mahdollista, että todellista vakaata tilaa ei saavutettu kokeissamme (ts.myosyytit, jotka saavat matalan nopeuden stimulaation). Toinen mahdollisuus on, että CSQ2-proteiinin kohonnut pitoisuus hidastaa Ca: n diffuusiota luminaalitilassa, mikä hidastaa Ca: n poistumista avoimien kanavien kautta. Tämän ongelman ratkaisemiseksi tarvitaan selvästi enemmän sekä kokeellista että teoreettista tutkimusta.

CICR: n lopettaminen. Kuinka cicr, prosessi, jolla on luontainen taipumus itsensä uudistumiseen, päättyy, on ollut intensiivisen tutkimuksen kohteena, ensin mittaamalla globaaleja Ca-transientteja ja myöhemmin tutkimalla Ca-kipinöitä (3, 27-30). Yhtenä mahdollisuutena on pidetty sitä, että RyR-kanavat käyvät läpi Ca-riippuvaisen inaktivaation tai sopeutumisen kanavan sytosolipuolen nousun seurauksena (27-29). Toinen mahdollisuus on, että lasku intra-SR tarjoaa aktiivisen signaalin sulkemisesta Jyrs kun ne avautuvat (3, 30-32). Olemme äskettäin löytäneet suoraa kokeellista näyttöä luminal Ca: n aiheuttamista muutoksista RyR-aktiivisuudessa (eli luminal Ca: n riippuvaisesta deaktivoinnista) SR Ca: n vapautumisen lopettamisessa kiinnittämällä SR: n sisäisen SR: n tasot SR-säiliöön ladatuilla matalan affiniteetin Ca-puskureilla (3). Käyttämällä näitä puskureita pidensimme merkittävästi myosyyttien aktiivisen Ca-vapautumisen kestoa, joka on sekä fokaalisen että globaalin Ca-transientin taustalla. Näiden havaintojen mukaisesti nykyiset tuloksemme osoittavat, että korkean kapasiteetin SR luminal Ca-puskurin CSQ2: n tasojen lisääminen pidentää Ca-release-kestoa, kun taas endogeenisen puskurin määrän vähentäminen lyhentää release-kestoa ilmeisesti hidastamalla tai kiihdyttämällä Luminal Ca-riippuvaista RyRs: n sulkeutumista vastaavasti. Yhdessä nämä tulokset antavat vakuuttavaa näyttöä Luminaalisesta Ca: sta riippuvaisen RyRs: n deaktivoitumisen merkityksestä CICR: n lopettamisessa. Vaikka osoitamme Luminal Ca: n muutosten merkityksen SR Ca: n vapautumisen päättymisessä, tuloksemme eivät välttämättä sulje pois sitä mahdollisuutta, että myös muut mekanismit, kuten RyR inaktivaatio tai adaptaatio sytosolisen Ca: n säätelykohdissa, saattavat vaikuttaa Ca: n vapautumiseen.

vaikka selvää näyttöä on olemassa luminal Ca: n muutosten osuudesta sydämen kipinöiden loppumiseen (ref. 3; tämä tutkimus), aiemmat tutkimukset viittasivat siihen, että Ca-kipinöihin luustolihaksissa ei välttämättä liity merkittävää SR: n heikentymistä . Lacampagne ym. (33) käytti kineettistä analyysiä korkean aikaresoluutioisen Ca-kipinän tallenteista osoittaakseen, että Ca-kipinän taustalla oleva Ca-vapautusvuo on vakio sammakkoeläinten lihassyissä. Koska SR Ca-vuon on laskeuduttava aina, kun SR laskee, tämä tulos voi tarkoittaa, että luminal Ca-tasot pysyvät vakaina Ca-kipinöiden aikana. Näin ollen on mahdollista, että kipinän päättymisestä vastaavat perusmekanismit ovat erilaiset sydän-ja luustolihaksissa. Täydentävien tutkimusten tulosten näillä kahdella solutyypillä (ts.CSQ-proteiinitasojen modulaatio luustolihassyissä ja nopeat Ca-kipukinetiikan mittaukset sydämen myosyyteissä) pitäisi auttaa selvittämään tätä asiaa.

merkitys CPVT: lle. Yksi tärkeimmistä tuloksista on se, että ne osoittavat, kuinka alentuneet CSQ2-tasot voivat aiheuttaa sydämen rytmihäiriöitä solutasolla. CPVT on rytmihäiriösairaus, jolle on ominaista pyörtyminen ja liikunnan ja katekoliamiini-infuusion aiheuttama äkkikuolema (34). Tähän mennessä neljä mutaatiota on yhdistetty CPVT: hen. Kolme näistä mutaatioista näyttää vähentävän CSQ2: n ilmentymistä (17), ja yhden mutaation on ehdotettu johtavan Ca: n sitoutumisen häiriintymiseen (16). Tuloksemme viittaavat siihen, että CPVT: n perimmäinen syy saattaa liittyä Ca-release-mekanismin epänormaaliin palauttamiseen, joka johtuu vähentyneistä CSQ2-tasoista (Kuva. 5). Koska Csq2: ta ilmentävien solujen Sr: ssä on vähemmän Ca-sitoutumiskohtien pitoisuutta, Ca-varaston täyttäminen SERCA-pumpulla tapahtuu nopeammin kuin normaaleissa soluissa. Varastojen lataus nopeutuu entisestään, kun SERCA: n toimintaa kiihdyttää proteiinikinaasi A, mikä saattaa selittää CPVT: n kliinisten jaksojen riippuvuuden katekoliamiineista. Myosyyteissä, joiden CSQ2-taso laski, Ca-vapautumiskanavien ennenaikainen toipuminen luminaalisesta Ca-riippuvaisesta refraktaarisesta tilasta johti spontaaneihin, ekstrasystolisiin SR Ca-varastojen purkauksiin. Tiedetään, että spontaani Ca vapautuminen voi aiheuttaa sisäänpäin virtauksia ja värähtelyjä kalvopotentiaalissa, mikä johtaa laukaistuun rytmihäiriöön (4-7). Siksi havaitut häiriöt Ca: n käsittelyssä voivat selittää ainakin osittain CPVT: n patogeneesin, joka liittyy geneettisiin virheisiin, jotka johtavat joko Ca: n sitoutumisaktiivisuuden vähenemiseen (16) tai CSQ2: n (17) ekspressiotason alenemiseen.

Vertailu Siirtogeenisillä hiirillä tehtyihin aiempiin tutkimuksiin. Havaintomme eroavat aiemmista tuloksista, jotka on saatu SIIRTOGEENISILLÄ hiirillä yli-ilmentäen CSQ2: ta (14, 15). Näissä tutkimuksissa CSQ2: n 10 – 20-kertainen yliekspressio lisäsi eristettyjen sydänlihassolujen SR Ca-varastointikapasiteettia; luminaalinen Ca ei kuitenkaan ollut saatavilla vapautumista varten, mikä johti maailmanlaajuisten ja paikallisten Ca-vapautumissignaalien masentumiseen. Näihin muutoksiin Ca: n käsittelyssä liittyi useita rakenteellisia, toiminnallisia ja biokemiallisia muutoksia solu-ja subsellutasolla sekä sydämen hypertrofian ja vajaatoiminnan kehittymistä. Toisaalta tämä tutkimus pitää CSQ2-proteiinitasot lähempänä fysiologisia tasoja akuuteissa eikä kroonisissa olosuhteissa; näin ollen nämä tiedot todennäköisesti kuvastavat tarkemmin CSQ2-proteiinipitoisuuksien muutosten suoria fysiologisia seurauksia solunsisäisessä Ca-käsittelyssä. Nämä tulokset korostavat mahdollisia ongelmia tulkittaessa proteiinien konstitutiivisen korkean tason ilmentymisen vaikutuksia siirtogeenisissä eläinmalleissa ja täydentävien tutkimusten arvoa akuuteimmissa olosuhteissa.

johtopäätös. Lopuksi olemme havainneet, että CSQ2 on olennainen määrittäjä SR: n kyvylle tallentaa ja vapauttaa Ca sydänlihakseen. CSQ2 näyttää toimivan Ca: n varastona, joka on helposti CICR: n saatavilla, ja myös aktiivisena Ca: n puskurina, joka moduloi paikallista luminal Ca: sta riippuvaista jyrsinten sulkeutumista. Samalla CSQ2 vakauttaa CICR-mekanismia hidastamalla SR Ca-kauppojen toiminnallista latautumista. Ca-vapautumiskanavien epänormaali uudelleensyntymiskäyttäytyminen voi selittää tai myötävaikuttaa csq2-geenin mutaatioihin liittyviin kammioperäisiin rytmihäiriöihin.