tulokset

il-7-reseptorin α-ketjun (CD127) tunnistaminen muisti-T-solujen Merkkiaineeksi. Etsiessämme uusia markkereita efektori-ja muisti-T-solujen osajoukkojen määrittelemiseksi hiiressä analysoimme il-7-reseptorin α-ketjun/CD127 pinnan ilmentymistä (Kuva. 1 A ). Lm: n primaarivasteiden aikana voidaan erottaa antigeenispesifisten pernan t-solupopulaatioiden erilliset alapopulaatiot CD127-ekspressiotasojen perusteella. Cd127 matala ilmentävät solut (CD127low) ovat vallitsevia akuutin efektorivaiheen aikana. Siirryttäessä muisti-t-soluvaiheeseen CD127low-solut kuitenkin häviävät vähitellen, kun taas suuria tasoja ilmentävät populaatiot (CD127high) pysyvät huomattavan vakaina kooltaan ajan myötä (Fig. 1 A ja c). Nämä erilliset kineettiset arvot viittaavat vahvasti siihen, että CD127: n ilmentyminen on selektiivinen ominaisuus pitkäikäisille muisti-T-soluille. Efektorivaiheen aikana CD127low CD8+ T-solut vaeltavat mieluiten ei-lymfoidisiin elimiin, kun taas Ln: ssä havaitaan vain CD127high CD8+ T-soluja (Kuva. 1b ). Perna edustaa ”väli-elintä”, jossa kaikki eri alapopulaatiot löytyvät varhain immunisaation jälkeen (22, 23). Myöhemmin muistivaiheen aikana antigeenispesifisille T-soluille kaikissa elimissä on ominaista CD127high-fenotyyppi (Fig. 1 b ja c). Cd127low-ja CD127high-antigeenispesifisten T-solujen lisääntymiskyvyn vertailu stimulaation vaikutuksesta paljasti silmiinpistäviä eroja näiden kahden osajoukon välillä. Kuten kuvassa. 1D, puhdistetut Listeriaspesifiset CD127high T-solut lisääntyvät nopeasti anti-CD3-stimulaation jälkeen, kun taas CD127low T-solut lisääntyvät huonosti. On epätodennäköistä, että nämä erot proliferaatiossa johtuisivat Cd127-positiivisten solujen edusta Ab-välitteisen IL-7R-stimulaation kautta, koska eri mAb-klooneilla, joilla tiedetään olevan CD127: ää aktivoiva tai estävä vaikutus, oli sama vaikutus lyhytaikaisissa in vitro-stimulaatiokokeissa (tietoja ei ole osoitettu).

osoittaaksemme suoremmin, että pitkäikäisiä muisti-T-soluja on yksinomaan cd127: n voimakkaasti ilmentävässä osastossa varhain in vivo-pohjustuksen jälkeen, teimme adoptiotutkimuksia käyttämällä äskettäin kehitettyä palautuvaa MHC-multimeerivärjäysmenetelmää (21), jolla antigeenispesifiset T-solut eristettiin toiminnallisesti suoraan ex vivo. Kun CD127high LLO91–99-spesifisiä T-soluja oli siirretty hiiriltä, jotka olivat saaneet tartunnan 10 päivän ajan Lm: llä, siirretyt solut olivat havaittavissa vielä useita viikkoja myöhemmin naiivien vastaanottajahiirien pernassa (Kuva. 2a), kun taas solujen määrä cd127low-solujen siirron jälkeen oli havaitsemisrajalla. Tämä havainto ei johtunut siirrettyjen cd127 high-ja CD127low-solujen in vivo-migraation eroista, koska löysimme samanlaisia eroja keuhkoissa (Kuva. 2a) ja muut elimet (LN ja maksa, tietoja ei näy). Sen tulkinnan tueksi, että Cd127hight T-solut ylläpitävät yksinomaan antigeenispesifisiä muistisoluja, vastaanottajahiiret haastettiin adoptoidun siirron jälkeen Listeria-infektiolla. Jälleen vain hiirillä, jotka olivat saaneet CD127high T–soluja ennen infektiota, havaittiin siirrettyjen LLO91-99-spesifisten T-solujen nopea laajeneminen (Kuva. 2b). Tämäkään tulos ei johtunut migraation eroista, koska siirrettyjen CD127low-T-solujen ylläpitoa tai laajenemista ei ollut havaittavissa missään muussa elimessä (Kuva. 2b ja tietoja ei näytetä). Vaikka nämä adoptiivisten siirtotutkimusten tulokset tukevat vahvasti olettamusta, että pitkäikäisiä muisti-T-soluja on yksinomaan CD127high T-solujen lokerossa, havaitsimme myös merkittäviä rajoituksia tässä kokeellisessa lähestymistavassa. Erityisesti muisti-T-solut, joilla on välitön efektoritoiminto, näyttävät olevan varsin herkkiä adoptiokokeille ja kuolevat nopeasti puhdistuksen ja suonensisäisen käytön jälkeen; vaikka ne selviävät kuukausista vuosiin, jos ne jätetään koskemattomiksi in vivo (11). Näin ollen, vaikka adoptiivisen siirron tulokset ovat sopusoinnussa sen tulkinnan kanssa, että CD127 on pitkäaikaisten muisti-T-solujen merkkiaine, emme voi sulkea pois sitä mahdollisuutta, että myös erillisten T-solujen alapopulaatioiden eloonjäämiseen liittyvät luontaiset ongelmat vaikuttavat näiden kokeiden tuloksiin.

antigeenispesifisten T-solupopulaatioiden kasaaminen CD127: n ja CD62L: n kanssa mahdollistaa erottelun muisti-t-solupopulaatioiden välillä. CD127high t-solupopulaation tarkempi Luonnehdinta osoitti, että se voidaan jakaa alapopulaatioihin, jotka ilmaisevat cd62l: n korkean ja matalan tason (kuva. 3). Puhdistettujen T-solujen suora ex vivo-funktionaalinen analyysi (21) (10-12 päivää tartunnan jälkeen, kun kaikki alapopulaatiot ovat samanaikaisesti havaittavissa pernassa) paljasti lisää toiminnallisia eroja. Siinä missä CD62Llow T-solujen alaryhmillä on voimakasta ja välitöntä ex vivo-sytolyyttistä aktiivisuutta, CD127high / CD62Lhigh T-soluilla on erittäin huono peptidipäällysteisten kohdesolujen hajoaminen (Kuva. 3). Lajiteltujen alapopulaatioiden solunsisäinen sytokiinivärjäys paljasti, että CD127high/CD62Llow T-solut, kuten CD127low/CD62Llow-osajoukko, tuottavat efektorisytokiineja inf-γ ja tuumorinekroositekijä α; sitä vastoin CD127high/CD62Lhigh-osajoukko tuottaa IL-2: ta mutta ei IFN-γ: ta ja tuumorinekroositekijää α. Näin ollen cd127: n ja CD62L: n merkkiyhdistelmä mahdollistaa sellaisten T-solujen alapopulaatioiden tunnistamisen, joiden ominaisuudet ovat hyvin samanlaiset kuin ihmisillä aiemmin kuvatut. CD127low/ CD62Llow T-soluilla on kaikki tunnetut efektori-t-solupopulaation ominaisuudet (TE, heikko proliferatiivinen aktiivisuus, rajallinen in vivo-eloonjääminen ja välitön efektoritoiminta). CD127high / CD62Lhigh-osajoukko vastaa TCM: n ominaisuuksia ja CD127high/CD62Llow T-solut sopivat TEM: n kuvaukseen.

erillisten muisti-T-solujen Alapopulaatioiden syntyminen riippuu CD40L-Välitteisestä T-solun avusta. Koska meistä tuntui, että olisi ongelmallista perustaa yksinomaan tulkinta, jonka mukaan CD127-lauseketta voidaan käyttää merkkiaineena efektorin ja pitkäikäisten muisti-T-solujen erottamiseksi adoptoivista solunsiirtokokeista, päätimme analysoida hiiren mutanttilinjoja, joilla on t-solumuistin generoinnissa vikoja. Jos CD127 On todellakin ”varhainen” muisti-t-solumarkkeri, meidän pitäisi pystyä tunnistamaan eroavaisuudet varhaisina ja myöhäisinä aikapisteinä cd127-positiivisten osajoukkojen sisällä hiirissä, joilla on muistivirheitä.

koska viimeaikaiset tutkimukset osoittivat T-solujen avun merkityksen pitkäkestoisten muistivasteiden (2-4) syntymisessä, päätimme selvittää, johtaako CD4+ T-solujen apu CD8+ T-solujen pohjustuksen aikana eroihin antigeenispesifisissä T-solujen osakoostumuksissa, jotka on havaittu varhaisessa jälkivaiheessa. MHC II-puutteellisilla hiirillä, joilta puuttuvat tavanomaiset CD4+ T-solut, on viallinen CD8+ – muistivaste, ja suojan laatu heikkenee ajan myötä (2-4). T-solujen alapopulaatioiden värjäys 10 päivän kuluttua primaarisesta infektiosta paljasti, että CD127HIGH / CD62Llow-osajoukko puuttuu lähes kokonaan MHC II – / – hiirillä(Kuva. 4a); muut alapopulaatiot ovat esiintymistiheydeltään samanlaisia kuin WT c57bl/6 hiirillä. Nämä tiedot osoittavat, että T-solun avun puuttuminen estää tehokkaan T-solun osajoukon muodostumisen efektorimuistin fenotyypillä, mikä näyttää olevan ratkaisevan tärkeää nopean in vivo-laajenemisen ja efektoritoiminnan kannalta.

koska CD4+ T– solujen tärkeät mekanismit välittyvät CD40: n ja CD40L: n (24– 26) vuorovaikutuksen kautta, tutkimme, onko CD40L–/– hiirillä samanlainen fenotyyppi kuin MHC II – / – hiirillä. Muiden viimeaikaisten tutkimusten (27) mukaan CD40L–/– – hiirillä ei ole eroja bakteerikuormassa tai bakteeripuhdistumassa primaarisen Listeria-infektion jälkeen (Tietoja ei näy), ja niillä on normaali primaarinen CD8+ T-soluvaste subletaaliselle Lm-annokselle (Kuva. 4c). Kuitenkin niiden kyky nopeasti puhdistaa reinfection suuremmalla annoksella Lm (≈10 × LD50) vähenee (Fig. 4b), joka korreloi heikentyneiden CD8+ muisti-T-solujen vasteiden kanssa (kuva. 4c)ja paljon pienempi CD127high / CD62Llow osajoukko (Kuva. 4 E ja f) varhaisvaiheen jälkivaiheessa. Listerian uudelleenfektion aikana cd40l–/– hiirillä reagoivien T-solujen proliferaatio vastaa solupopulaatioiden lisääntymistä WT-hiirillä, mikä osoittaa, että fenotyyppi ei johdu yleisestä häiriöstä muisti-T-solujen proliferatiivisessa kapasiteetissa (Fig. 4d), vaan vähentyneisiin muisti-T-soluihin, jotka kykenevät reagoimaan välittömästi antigeenireenkounteriin. Tämä fenotyyppi osoitettiin in vivo-merkintäkokeilla, joissa BrdUrd sisällytettiin koko laajentumisvaiheen aikana (Fig. 4d) ja in vivo brdurd–pulssijahtitutkimuksissa, joissa seurataan proliferaation merkkiaineen häviämistä (tietoja ei näy).

Efektorimuistin Fenotyypillä varustettujen T-solun osajoukkojen pienentynyt sukupolvi varhain pohjustuksen jälkeen siirtyy Myöhäismuistin t-Solupooliin. Tietomme osoittavat, että CD4+ T-solujen tai CD40L: n puuttuessa CD127high/CD62Llow T-solujen osajoukko pienenee merkittävästi varhain pohjustuksen jälkeen. Lisäksi me (Kuva. 4b) ja muut (3-5) osoittivat, että heikentynyt T-solujen apu T-solujen pohjustuksen aikana johtaa muutoksiin suojaavan immuniteetin laadussa kohti uudelleenfektiota Lm: llä tai lymfosyyttisellä koriomeningiittiviruksella. Jotta CD127high/ CD62Llow T-solujen varhaissukupolvessa havaittu vika saataisiin selvemmin yhdistettyä näiden hiirten myöhemmän t-solumuistin laatuun, analysoimme antigeenispesifisiä T-solupopulaatioita muistivaiheen aikana (5 wk primaarisen Listeria-infektion jälkeen) tarkemmin. Tässä vaiheessa antigeenispesifisten T-solujen analyysi on tehtävä eri kudoksista johdetuille soluille niiden erilaisen vaelluskäyttäytymisen vuoksi. Pernan lisäksi valitsimme LN: n imukudoksen edustavaksi kudokseksi ja keuhkojen tyypilliseksi perifeeriseksi, ei-imukudososastoksi. Tällä hetkellä antigeenispesifiset T-solut näissä elimissä ovat lähes kaikki CD127high (Kuva. 1B); keuhkojen solut ovat CD62Llow (tietoja ei näy), kun taas useimmat antigeenispesifiset muisti T-solut LN: ssä ovat CD62Lhigh (Kuva. 5b ). Määritettäessä antigeenispesifisten muisti-T-solujen lukumäärää, joilla oli selkeä välitön efektoritoiminta eri elimissä, suoritimme solunsisäisen sytokiinivärjäyksen IFN-γ: lle. Kuten kuvassa. 5A, CD40L – / – hiirille on ominaista, että niiden antigeenispesifisten muisti-T-solujen määrä, joilla on välitön efektoritoiminta, on huomattavasti vähentynyt verrattuna WT-hiiriin. Tämä tulos pätee esiintymistiheyksien tasolla (prosentteina)CD8 + T-solulokerossa ja absoluuttisina lukuina (Kuva. 5 a ). LN-johdannaisten lymfosyyttien MHC-tetrameerivärjäys (Kuva. 5b) paljasti lähes identtisen määrän antigeenispesifisiä T-soluja, joilla oli CD62Lhigh-fenotyyppi. Joitakin CD62Llow-antigeenispesifisiä T-soluja on havaittavissa myös WT-hiirten LNs: ssä korreloiden IFN-γ: ta tuottavien solujen frekvenssien kanssa (Fig. 5 a ). Tämä populaatio puuttuu periaatteessa CD40L–/– hiirten LNs: stä; koko CD8+/ CD62Llow-osajoukko pienenee CD40L – / – hiirillä, mikä viittaa yleiseen vikaan tämän T-solun osajoukon sukupolvessa. Yhteenvetona voidaan todeta, että CD40L-riippuvaisten CD4+ T-solujen puuttuminen pohjustusaikana johtaa kvantitatiivisiin eroihin antigeenispesifisissä CD8+ T-solujen alapopulaatioissa, jolloin efektorimuistin fenotyyppi (CD127high/CD62Llow) on huomattavasti vähentynyt. Nämä kvantitatiiviset erot soluissa, joilla on välitön efektoritoiminta, siirtyvät muistivaiheeseen ja vaikuttavat suojaavan immuniteetin laatuun.