Candida guilliermondii-sieni on levinnyt laajalti luonnossa, mukaan lukien ihmisen ihon ja limakalvojen mikrobisto.22 vaikka tämän lajin virulenssi on alentunut verrattuna muihin Candida-lajeihin, 3 Sitä pidetään tällä hetkellä kehittyvänä taudinaiheuttajana, jolla on merkittävä esiintyvyys Latinalaisessa Amerikassa.18C. guilliermondii on tunnustettu etiologiseksi tekijäksi monenlaisissa kliinisissä infektioissa, mukaan lukien disseminoituneet pääasiassa immuunipuutteisilla potilailla,22 ja nosokomiaaliset taudinpurkaukset leikkauspotilailla, joilla on intravaskulaarinen laite.Tällä hetkellä suositeltu hoito invasiiviseen kandidiaasiin neutropeenisilla potilailla sisältää kaspofungiinin (CFG) tai mikafungiinin (MFG) ensilinjan hoitoina, liposomaalisen amfoterisiini B: n (LAMB) ja anidulafungiinin (AFG) vaihtoehtoina, kun taas flukonatsolia (FLC) suositellaan vain silloin, kun herkkyys tälle lääkkeelle on vahvistettu.Useat tutkimukset ovat kuitenkin osoittaneet, että C. guilliermondiin herkkyys FLC8: lle,15: lle ja 19: lle on heikentynyt,ja isolaatteihin, joilla on suuri amfoterisiini B (AMB), on liittynyt terapeuttisia epäonnistumisia.9,12,24 vaikka lähes 90%: ssa isolaateista ekinokandiinien MIC-arvot ovat yhtä suuria tai pienempiä kuin herkkyyden kliiniset raja-arvot (2ΜG/ml), 17 on samanlaisia kuin muilla Candida-lajeilla, kuten C. parapsilosis-lajilla, joissakin C. guilliermondii-isolaateissa mik-arvot ovat huomattavan korkeita.AFG: n tehosta invasiivisessa kandidiaasissa on vain vähän tietoa, ja lääkkeen mahdollinen merkitys kliinisessä käytännössä tunnetaan huonosti.23 Tässä yhteydessä eläinkokeilla voi olla tärkeä merkitys in vitro–in vivo-korrelaation ymmärtämisen kannalta.11 siksi päätavoitteenamme oli arvioida AFG: n in vitro-ja In vivo-toimintaa C. guilliermondiin eri isolaatteihin verraten tuloksia AMB: n ja FLC: n tuloksiin.
materiaalit ja menetelmät
neljä kliinistä C-isolaattia. guilliermondii-valmistetta (UTHSC 11-142, UTHSC 10-499, UTHSC 11-685 ja UTHSC 10-3207) käytettiin in vitro-tutkimuksessa, ja kaksi niistä (UTHSC 11-685 ja UTHSC 11-142) valittiin hiirimalliin niiden erilaisten in vitro-herkkyyksien perusteella. Isolaatit tunnistettiin sekvensoimalla rRNA: n sisäinen transkriboitu spacer (ITS)–alue ja D1-D2-alueet vertaamalla sekvenssejä tämän lajin tyyppikannan sekvensseihin.
in vitro-tutkimukset
neljän kannan herkkyys AMB: lle, FLC: lle ja AFG: lle in vitro arvioitiin käyttämällä vertailuliemikrodiluutiomenetelmää,6candida parapsiloosi ATCC 22019 ja Candida krusei ATCC 6258 otettiin mukaan laadunvalvontaan.
aika-tappokäyrät kehitettiin kaikille kannoille aiempien tutkimusten mukaisesti.5,20 lyhyesti: jokaisesta sienilääkkeestä valmistettiin kantaliuos, AMB (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Yhdysvallat) ja AFG (Pfizer Inc., Madrid, Espanja) liuotettiin dimetyylisulfoksidiin ja FLC:hen (Pfizer Inc., Madrid, Espanja) tislatussa vedessä. Lisäksi lääkeainelaimennoksia valmistettiin 9 ml: ssa standardia RPMI 1640-väliainetta, jotta saatiin pitoisuudet 0.03, 0.12, 0.5, 1, 2, 8 ja 32µg / ml kutakin lääkettä. Isolaatit kasvatettiin 35°C: n lämpötilassa 24 tunnin ajan peruna-dekstroosi-agar-levyillä (PDA). C. guilliermondii-viljelmät suspendoitiin steriiliin suolaliuokseen, ja tuloksena saadut suspensiot säädettiin tasolle 5×106 pesäkettä muodostavaa yksikköä (PMY)/ml hemosytometrimäärillä ja sarjapinnoituksella PDA: han elinkelpoisuuden varmistamiseksi. Laimennokset ja kontrollit (lääkkeettömät) inokuloitiin 1 ml: lla sienisuspensioita, jolloin inokulaatti oli 5×105cfu/ml, ja inkuboitiin 35°C: ssa. jokaisesta putkesta kerättiin 100µl: n määräosa 0, 2, 4, 6, 8, 24, ja 48 h inokulaation jälkeen ja laimennettuna tislatulla vedellä; 30 µl niitä viljeltiin PDA-levyille ja inkuboitiin 35°C: ssa 48 tunnin ajan PMY/ml: n määrittämiseksi. PMY: n vähenemistä ≥99, 9% eli 3 log10 yksikköä inokulaatin aloittamiseen verrattuna pidettiin fungisidisena, kun taas
log10 yksikön pienenemistä pidettiin fungistaattisena. Havaitsemisraja oli 50CFU / ml. Kaikki aika-tappokäyrää koskevat tutkimukset tehtiin duplicate.In kokeessa käytettiin vivo-tutkimuksia
– 1-Uroshiiriä (Charles River; Criffa SA, Barcelona, Espanja), joiden keskipaino oli 30 g. Hiiriä säilytettiin tavallisissa laatikoissa, joissa oli vapaa pääsy ruokaan ja veteen. Kaikkia eläintoimenpiteitä valvoi ja hyväksyi Universitat Rovira i Virgili Animal Welfare and Ethics Committee.
hiirille tehtiin neutropeniaa päivää ennen infektiota antamalla 200 mg / kg syklofosfamidia (Genoxal; Laboratorios Funk SA, Barcelona, Espanja) ja laskimoon (i.v).) 5-fluorourasiilin (Fluorouracilo; Ferrer Farma SA, Barcelona, Espanja) ruiskutus 150 mg/kg.10,14 tartuntapäivänä hiirille annettiin 1×108cfu / eläin kumpaakin C. guilliermondiin, UTHSC 11-685-ja UTHSC 11-142-kantaa 0,2 ml: ssa steriiliä suolaliuosta sivusuuntaiseen häntälaskimoon.Kullekin kannalle ja lääkkeelle määritettiin satunnaisesti 3,4
kahdeksan eläimen ryhmää. Ryhmiä hoidettiin seuraavasti: amfoterisiini B-deoksikolaatti (AMBd) (Xalabarderin Apteekki, Barcelona, Espanja) annostuksella 0, 8 mg/kg laskimoon kerran vuorokaudessa (QD); liposomaalinen amfoterisiini B (LAMB) (Gilead Sciences S. A., Madrid, Espanja) 10 mg / kg laskimoon, QD; FLC (Pfizer Inc., Madrid, Espanja) 25 mg/kg suun kautta (p.O.) letkulla, kahdesti päivässä (BID); ja AFG (Ecalta; Pfizer Ltd., Sandwich, Kent, Yhdistynyt kuningaskunta) annoksella 10 mg/kg/annos kerran vuorokaudessa. Kaikki hoidot alkoivat 24h haasteen jälkeen ja kestivät 7 päivää. Kontrollit eivät saaneet hoitoa. Bakteeri-infektioiden estämiseksi kaikki hiiret saivat 5 mg/kg päivässä keftatsidiimia ihon alle 1-7 päivänä tartunnan jälkeen. Hiiret tarkastettiin päivittäin, ja ne lopetettiin päivänä 8 CO2-anoksian aiheuttaman infektion jälkeen. Kunkin lääkkeen tehoa arvioitiin kudostaakan vähentämisellä ja histopatologisilla tutkimuksilla. Munuaiset poistettiin aseptisesti, ja yksi niistä punnittiin ja homogenoitiin 2 ml: ssa steriiliä suolaliuosta. Homogenaattien 10-kertaiset sarjalaimennokset pinnoitettiin PDA: lle ja inkuboitiin 48 tunnin ajan 35°C: ssa PMY/g: n laskentaa varten. Histopatologista tutkimusta varten jäljelle jäävä munuainen kiinnitettiin 10–prosenttisesti puskuroidulla formaliinilla, kuivatettiin, parafiinilla upotettiin ja viipaloitiin 2µm: n lohkoiksi, jotka värjättiin hematoksyliini-eosiinilla (H-E) ja periodisella happo-Schiff (PAS) – tahralla valomikroskopian tutkimista varten.
tilastot
kudoksen Pesäkemäärät analysoitiin Mann–Whitneyn U-testillä käyttäen Windowsin Graph Pad Prism 4.0: aa (Grappad Software, San Diego, CA, USA). Kun P-arvot olivat alle 0, 05, eroja pidettiin tilastollisesti merkitsevinä.
tulokset in vitro–tutkimuksissa
AMB: n MICs oli 0, 25–1µg/ml, 0, 06–0, 25 µg/ml AFG: llä ja 0, 5-1µg / ml FLC: llä. Kun AMB: n, FLC: n ja AFG: n herkkyys C. guilliermondii-bakteeria vastaan oli katkennut,16 Kaikki isolaatit olivat herkkiä näille kolmelle lääkkeelle. Laadunvalvontakantojen alttius oli hyväksytyissä rajoissa.
AMB: n tappamiskinetiikka osoitti nopeaa fungisidista aktiivisuutta, joka lisääntyi lääkeainepitoisuuden myötä. MIC: tä vastaavilla pitoisuuksilla kyseinen lääke osoitti fungisidista vaikutusta kolmeen testatuista neljästä isolaatista (Kuva. 1). Tämä aktiivisuus alkoi heti inokulaation jälkeen pitoisuuksilla, jotka olivat yli 1µg / ml, ja fungisidinen päätetapahtuma saavutettiin 4h: n jälkeen pitoisuudella 32µg/ml. AFG: llä yli 0, 5 µg/ml: n pitoisuuksilla havaittiin fungisidinen vaikutus, joka alkoi 4 tunnin inkubaation jälkeen. Fungisidinen päätetapahtuma saavutettiin 12-24 tunnin inkubaatiolla 32µg/ml (Kuva. 2). FLC osoitti fungistaattista aktiivisuutta kaikkia neljää isolaattia vastaan (Kuva. 3).
aikaa tappavan kinetiikan määritykset AMB: stä neljää C. guilliermondiin kantaa vastaan. ( ■ ) 0, 03 µg/ml, ( ▴ ) 0, 12 µg/ml, (□) 0, 5 µg/ml, ( ○ ) 1µg/ml, (Δ) 2µg/ml, ( ▿ ) 8µg/ml, ( ♦ ) 32µg / ml, ( ● ) kontrolli. Katkoviivat merkitsevät PMY: n pienenemistä 3log10 yksikköä kasvussa alkuperäiseen inokulaattiin (fungisidinen aktiivisuus) verrattuna, katkoviivat osoittavat testin kvantifiointirajan.
AFG: n Time-killing kinetics assays against four stages of C. guilliermondii. ( ■ ) 0, 03 µg/ml, ( ▴ ) 0, 12 µg/ml, (□) 0, 5 µg/ml, ( ○ ) 1µg/ml, (Δ) 2µg/ml, ( ▿ ) 8µg/ml, ( ♦ ) 32µg / ml, ( ● ) kontrolli. Katkoviivat merkitsevät PMY: n pienenemistä 3 log10 yksikköä kasvussa verrattuna alkuperäiseen inokulaattiin (fungisidinen aktiivisuus), katkoviivat osoittavat testin kvantifiointirajan.
aikaa tappavan kinetiikan määritykset FLC: stä neljää C. guilliermondii-kantaa vastaan. ( ■ ) 0, 03 µg/mL, ( ▴ ) 0, 12 µg/ml, (□) 0, 5 µg/ml, ( ● ) 1µg/ml, (Δ) 2µg/ml, (▿) 8µg/ml, ( ♦ ) 32µg / ml, ( ● ) kontrolli. Katkoviivat merkitsevät PMY: n pienenemistä 3log10 yksikköä kasvussa alkuperäiseen inokulaattiin (fungisidinen aktiivisuus) verrattuna, katkoviivat osoittavat testin kvantifiointirajan.
In vivo-tutkimukset
LAMB annoksella 10 mg / kg oli ainoa lääke, joka kykeni vähentämään sienikuormaa kummastakin kannasta infektoituneiden hiirten munuaisissa, mikä vähensi huomattavasti enemmän kuin muilla hoidoilla (P≤0, 04). AMBd ja FLC pystyivät vähentämään kudostaakkaa vain hiirillä, jotka olivat saaneet tartunnan kannasta, jossa näiden kahden lääkkeen MIC-arvot olivat alhaisimmat, eli 0, 25 µg/ml AMB: llä ja 0, 5 µg/ml FLC: llä (P≤0, 008). AFG: n tapauksessa sienikuormituksen aleneminen oli vaatimatonta ja vähäisempää kuin AMBd: n tapauksessa, ja se vähensi merkittävästi kudostaakkaa munuaisissa vain suhteessa verrokkiryhmään kannan UTHSC 11-685 osalta (P=0, 002) (Kuva. 4).
Effects of antifungal treatment on colony counts of C. guilliermondii in kidney of neutropenic mice, 8 days post infection. LAMB 10, liposomal amphotericin B at 10mg/kg QD; AMBd 0.8, amphotericin B deoxycholate at 0.8mg/kg QD; AFG 10, anidulafungin at 10mg/kg QD. aP0.05 versus control; bP0.05 versus AMBd 0.8, AFG 10 ja FLC 50; cP0.05 vastaan AFG 10 ja FLC 50.
histologinen tutkimus osoitti hoitamattomien eläinten munuaisissa ja AMBd: llä, FLC: llä tai AFG: llä hoidetuilla hiirillä fokaalista sienisolujen infiltraatiota. Lampaalla hoidettujen hiirten munuaisissa näkyi vain lievä sienirihmasto. Merkkejä nekroosista, tulehdusvasteesta tai parenkyymimuutoksista ei havaittu verrokeilla eikä hoidetuilla eläimillä (Kuva. 5).
sieni-infiltraation (musta nuoli) esiintyminen C. guilliermondii-bakteerin infektoiman kontrollihiiren munuaisosassa 8 päivän kuluttua tartunnasta (periodic acid Schiff-värjäys, suurennos 1000×). Bar=10µm.
Keskustelu
in vitro-tutkimuksissa ei havaittu C. guilliermondii-isolaattien alentunutta herkkyyttä FLC: lle tai AFG: lle. Aiempien tutkimusten mukaisesti AMB: n aika-tappokäyrät osoittivat fungistaattisen vaikutuksen kaikkiin isolaatteihin,4,5,7 ja FLC osoittivat fungistaattista vaikutusta testatusta pitoisuudesta riippumatta.7 tiedetään, että AMBd: n teho on suurempi kuin sen lipidimuodon, erityisesti munuaisten osalta, kun sitä annetaan samanaikaisesti.1 farmakokineettiset tutkimukset kuitenkin osoittivat, että annettaessa AMBd: tä 0, 75 mg/kg amb: n Cmax hiirten seerumissa oli 0, 30 µg/ml.25 kuitenkin jommankumman testatun isolaatin AMB-MIC on suurempi kuin tämä arvo; siksi käytimme suurta LAMMASANNOSTA korkeampien pitoisuuksien saavuttamiseksi.1 lampaanlihan annostelu annoksella 10 mg / kg vähensi tehokkaasti molempien kantojen sienikuormaa. Tämä seikka korreloi tappokäyrien kanssa, joissa AMB saavutti fungisidisen vaikutuksensa kahta in vivo testattua isolaattia vastaan pitoisuuksina 1µg/ml. Tämä on tietääksemme ensimmäinen tutkimus, jossa pyrittiin luomaan yhteys tappamiskinetiikan ja AFG: n ja FLC: n in vivo-kokeellisen tehon välillä C. guilliermondiin kliinisiä isolaatteja vastaan. Ekinokandiineista on olemassa vain aiempi tutkimus, erityisesti kaspofungiinin (CFG) käytöstä C. guilliermondiin disseminoituneessa infektiossa. CFG (1 mg / kg) vähensi tehokkaasti munuaisten sienikuormaa hiirillä, joilla oli yksi C. guilliermondii-kanta, jonka MIC oli 8µg/ml, kun taas ajan tappaminen paljasti, ettei fungisidista vaikutusta saavutettu pitoisuuksilla 64µg/ml.4 vastaavasti tutkimuksemme osoitti AFG: n pitoisuusriippuvaista aktiivisuutta, joka 32µg / ml: ssa aiheutti fungisidista aktiivisuutta, kuten aiemmin on raportoitu,17 24 tunnin kohdalla ja 8µg/ml: ssa. Aiemmissa tutkimuksissa AFG-pitoisuudet seerumissa ja munuaisissa olivat noin 13µg/ml 7 hoitopäivän jälkeen annoksilla 10 mg/kg.21 tässä tapauksessa AFG pystyi vähentämään vain vähän niiden neutropenisten hiirten munuaistaakkaa, jotka olivat saaneet tartunnan jommastakummasta testatusta kannasta, mikä ei näytä liittyvän kahden testatun kannan väliseen alhaiseen AFG-Mikrofonieroon (1 laimennos), mikä viittaa siihen, että AFG-hoitovaste riippuu kannasta. Vastaavasti FLC pystyi myös vähentämään vain hieman niiden hiirten munuaistaakkaa, joille oli altistunut jompikumpi näistä kahdesta kannasta, huolimatta annoksesta, joka saavutti seerumipitoisuudet yli Mikrofonipitoisuuksien,2 mikä ei myöskään ollut yllättävää sen fungistaattisen aktiivisuuden vuoksi.
yhteenvetona voidaan todeta, että tutkimuksemme osoitti lampaanlihan suuremman aktiivisuuden ja tehon kahta C. guilliermondiin kantaa vastaan, toisin kuin FLC: n ja AFG: n huono vaikutus. On kuitenkin tehtävä lisätutkimuksia useammilla C. guilliermondii-isolaateilla, jotka edustavat laajempaa AFG-mikrofonien valikoimaa, jotta voidaan arvioida, onko MIC-arvojen ja AFG-tehon välillä mitään yhteyttä.
eturistiriita
ei ilmoitettavaa.
