Abstrakti

olemassa olevat kemotaksis—määritykset eivät luo stabiileja kemotaktisia gradientteja ja mittaavat siten—ajan mittaan-vain epäspesifistä satunnaisliikettä (kemokinesia). Vertailun vuoksi mikrofluiditeknologialla on kyky luoda tiukasti valvottu mikroympäristö, jota voidaan ylläpitää vakaasti pitkiä aikoja ja joka on näin ollen mukautettavissa kemotaksien määritykseen. Kuvaamme tässä uutta mikrofluidista laitetta solujen siirtymisen herkkään määritykseen ja osoitamme sen sovelluksen sileän lihassolun kemotaksin arvioimiseksi kemokiinigradientissa.

1. Johdanto

suunnattu solujen muuttoliike on kriittisessä roolissa tulehdussairauksissa, verisuonitaudeissa, haavan paranemisessa ja kasvaimen etäpesäkkeissä . Solujen siirtymisen kvantifioimiseksi on kehitetty useita in vitro-lähestymistapoja, kuten yksikerroksisten haavojen sulkeminen (”scratch assay”) ja Boydenin kammio . Nämä nykyiset menetelmät ovat kuitenkin suhteellisen tunteettomia. Lisäksi tällaisilla lähestymistavoilla voidaan oikeastaan mitata vain kemokinesiaa eli lisääntynyttä satunnaisliikettä kemotaksisuuntaisen solusiirtymän sijaan.

itse asiassa scratch assayn ja Boyden chamber transwellsin hyödyllisyyttä rajoittaa niiden metodologinen rakenne.

scratch-määrityksessä konfluenttisolumonolikerrokseen tehdään määritelty ”haava” (scratch); särön reunoilla olevat solut täyttävät sitten asteittain tyhjiön, ja palautuneen yhtymäkohdan aika kvantifioidaan. Naarmun nopeamman korjaantumisen on tulkittu heijastavan solujen manipuloinnin tai väliaineeseen lisättyjen liukoisten aineiden luonteen aiheuttamaa lisääntynyttä ”kemotaksista”. Vaikka koe on käsitteellisesti suoraviivainen ja teknisesti helppo suorittaa, solut kylpevät yhtenäisessä aineen pitoisuudessa, eikä kemoattractantin pitoisuusgradienttia ole koko kokeen aikana; liike, joka täyttää aukon, edustaa siis vain ”satunnaista kävelyä.”Näin ollen” migraatio ” scratch-määrityksessä on suurelta osin vain lisääntyneen kemokineesin funktio. Lisäksi, kuten tyypillisesti suoritetaan—erityisesti useiden tuntien pituisen määrityksen aikana-naarmun ”haavan” sulkeminen sisältää todennäköisesti myös merkittävän osan solujen proliferaatiosta.

toinen yleisin ”chemotaxis” – mittaustapa on Boydeninkammion transwellien käyttö. Laitteen alempaan osastoon sijoitetaan erilaisia spesifisten kemokiinien pitoisuuksia, kun taas arvioitavia soluja inkuboidaan ylemmässä insertissä; mikrohuokoinen kalvo erottaa kaksi kammiota ja muodostaa solun kasvun tuen ja osittaisen siirtymisen esteen. Solut, jotka lasketaan kalvon alapinnalla tai jotka kerääntyvät alahuoneeseen, arvioidaan tyypillisesti yhteen kiinteään päätepisteeseen. Tämän määrityksen etuna on näennäinen suunnattu muuttoliike eli ylähuoneesta alahuoneeseen, mutta se on silti ongelmallinen. Ensinnäkin ei ole olemassa kemokiinien ”gradienttia” ylhäältä alas, vaan vain yksi askelfunktio alhaisista korkeisiin pitoisuuksiin. Toiseksi, ei ole mitään keinoa ylläpitää kemokiini ero ylhäältä alas kammiot . Aluksi kemokiinipitoisuus alemmassa osastossa on suurempi, mutta muutamassa minuutissa tai tunnissa pitoisuudet tasoittuvat diffuusion vuoksi, jolloin spesifinen kemotaksis lakkaa. Sen sijaan pitkäaikaisissa mittauksissa näkyy todennäköisemmin merkittävä osa kemokinesiaa. Lisäksi, kun solut putoavat kalvon läpi alahuoneeseen, ei ole mahdollisuutta käänteiseen muuttoliikkeeseen. Myös Boydenin kammio on rajallinen, koska solulaskenta edellyttää kokeen lopettamista; aikarata vaatii siis useita laitteita.

Mikrofluiditekniikalla voidaan ylittää nämä rajoitukset luomalla liukenevien tekijöiden pitkäaikainen vakaa ja hallittavissa oleva gradientti, jota voidaan seurata jatkuvasti ajan mittaan . Käyttämällä soluja, jotka on käsitelty estämään proliferaatiota, tällainen laite mahdollistaa todellisen jatkuvan arvioinnin kemotaksis vastaan kemokineesi. Kuvassa 1 esitetään tällainen laite, jossa lähteen ja altaan pitoisuudet pidetään yllä luomalla vastaavat kuopat, joiden tilavuudet ovat suuria suhteessa diffusoivaan vuohon yhdistävän hydrogeelikanavan kautta . Vakaassa tilassa näiden kahden kuopan välille muodostuu lineaarinen konsentraatiogradientti. Vaikka interstitiaalinen virtaus hydrogeelin alueen läpi voi häiritä gradienttia, jos kahden kaivon hydrostaattiset paineet eivät ole yhtä suuret, painegradientit poistetaan liittämällä lähde-ja uppokaivot lisäkanaviin ja-altaisiin, jotka toimivat alhaisina vastusväylinä nestevirtaukselle ja paineen tasapainotukselle. Gradientteja voidaan siis säilyttää useita päiviä, ja niitä voidaan käyttää solujen siirtymisen tutkimiseen herkällä ja erityisellä tavalla eri solutyypeillä . Tässä esitetyssä työssä kuvataan tällaisten laitteiden käyttöä sileiden lihassolujen primaariviljelmien kemotaksien arvioimiseksi ja sen vertaamiseksi scratch-ja Boyden-kammiotekniikoihin herkkyyden osalta.

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figure 1

Device design and stability of concentration gradients as a function of time. (A) alempi 3 kaivot ovat solu-ja/tai lähde kaivoja kemokiinit, ja ylempi 3 kaivot toimivat altaina ylläpitää vastaavia paineita alempi kaivot. Koesuunnittelusta riippuen sivukaivot tai keskuskaivo voivat toimia lähdekaivoina; keskuskaivon solut voivat siirtyä kohti eri kemokiiniärsykkeitä kummallakin puolella, tai sivukaivojen eri solupopulaatiot voivat siirtyä kohti keskuskemokiiniärsykettä. (b, c) Pitoisuusgradientit esitetään kaavamaisesti sen jälkeen, kun pienimolekyylipainoinen fluoresoiva väriaine on lisätty lähdekaivoon ja lähdesäiliöön joko 2 tunnin (b) tai 72 tunnin (C) kuluttua. D) graafinen näyttö pitoisuusgradienteistä 0 tunnista 72 tuntiin sen jälkeen, kun fluoresoiva väriaine on lisätty lähteeseen ja säiliöön.

2. Materiaalit ja menetelmät

2.1. Primaariset sileän lihaksen soluviljelmät (SMC)

aortat kerättiin 8-viikkoisilta C57/B6-hiiriltä (Charles River, Wilmington, MA) steriileillä leikkelysaksilla. Kiinnittynyt rasva poistettiin, ja aortaa inkuboitiin 20 minuuttia 37°C: ssa dulbeccon modifioidussa Kotkan elatusaineessa (Dmem; Invitrogen, Grand Island, NY), joka sisälsi 1% penisilliiniä/streptomysiiniä, 2% sikiön naudan seerumia ja 5 mg/mL tyypin II kollagenaasia (Invitrogen). Aortat huuhdeltiin kylmässä dmem: ssä ja adventitia leikeltiin huolellisesti pois; sitten ne leikattiin pieniksi paloiksi ja inkuboitiin 30 minuutin ajan 37°C: n lämpötilassa dmem: ssä, joka sisälsi 1 mg/mL tyypin I kollagenaasia (Invitrogenaasi) ja 0, 125 mg/mL tyypin III elastaasia (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Toistetun pipetoinnin jälkeen kudoksen dissosioimiseksi saatu soluseos suspendoitiin tuoreeseen ”SMC-väliaineeseen” (dmem, jossa on 10% sikiön naudan seerumia, 1% penisilliiniä/streptomysiiniä; 2% epäolennaisia aminohappoja, 1% L-glutamiinia; kaikki Invitrogeenireagenssit) ja kasvatettiin 37°C: n lämpötilassa 5% CO2-inkubaattorissa levyillä, jotka on päällystetty 1 mg/mL fibronektiinillä 30 minuutin ajan. Kun soluviljelmä on perustettu (tyypillisesti ensimmäisen läpikulun jälkeen), SMC kasvatetaan päällystämättömillä muovipulloilla (Corning Incorporated, Corning, NY).

SMC: tä käytettiin kohdista 2-7 ja niitä oli 99.5% puhdasta virtaussytometrialla määritettynä sileälihaksen α-aktiinin värjäyksen jälkeen. Värjäystä varten solut kerätään talteen ja kiinnitetään 1% paraformaldehydillä (Sigma-Aldrich) fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS). FITC-konjugoitua antismooth Musc α-aktiinivasta-ainetta (Sigma-Aldrich) 1 : 100 laimennettuna 10X BD perm/wash-puskuriin (BD Pharmingen, San Jose, Kalifornia) levitettiin 10 min huoneenlämmössä. Solut pestään kahdesti 1% sikiön naudan seerumilla PBS: ssä ja kerran 1% sikiön naudan seerumilla PBS: ssä, joka sisältää 1% formaldehydiä, ja analysoidaan välittömästi virtaussytometrialla (FACScalibur, BD Biosciences, San Jose, CA). FITC-konjugoitua hiirtä IgG1 isotype (BD Pharmingen) käytetään isotype-kontrollina. Kemotaktisiin määrityksiin tarkoitetut solut kerättiin, kun ne olivat saavuttaneet yhtymäkohdan.

2, 2. Mitomysiini-C-käsittely

solut trypsiinoitiin (0, 25% trypsiini-EDTA; Invitrogeeni) 2 minuutin ajan 37°C: ssa, pestiin SMC-väliaineella ja inkuboitiin sitten yksisolususpensiona 40 µg/mL mitomysiini-C: ssä (MMC; Sigma-Aldrich) SMC-väliaineessa 30 minuutin ajan 37°C: ssa.kun PBS: ssä oli vielä kaksi pesua, solujen elinkyky, proliferaatio tai vaelluskyky arvioitiin. Haavan paranemisen (scratch) määrityksessä MMC-käsittely suoritettiin SMC-pinnoituksen jälkeen ja kun solujen konfluenttipitoisuus oli 100%; soluja inkuboitiin 40 µg/mL MMC: ssä SMC-elatusaineessa 30 minuutin ajan 37°C: ssa, minkä jälkeen ne pestiin kahdesti PBS: llä ennen määritystä.

2, 3. SMC-proliferaation eston määritys

MMC-käsittelyn tai kontrollirembinaation jälkeen SMC viljeltiin 6-kuoppalevyillä (Corning Incorporated). Solut otettiin talteen 1 tunnin, 24 tunnin tai 48 tunnin kuluttua trypsiinisaatiolla ja solujen määrä ja elinkelpoisuus arvioitiin laskemalla käyttäen hemosytometriä ja trypan blue exclusion-menetelmää.

2, 4. Haavan paraneminen / Naarmutesti

SMC: tä viljeltiin 12-kuoppalevyillä (Corning Incorporated) konfluentiksi asti, minkä jälkeen sitä käsiteltiin MMC: llä. Pesun jälkeen lisättiin tuoretta SMC-liuosta ja solumonolikerrosta naarmutettiin toistettavissa olevalla tavalla steriilillä 200 µL: n pipetin kärjellä. Trombosyyttipohjaisen kasvutekijän eri pitoisuudet (PDGF; R&D Systems, Minneapolis, MN) SMC mediaan lisättiin jokaiseen kaivoon. Naarmuvirheen reunojen välinen etäisyys mitattiin ja laskettiin keskimäärin viidestä erillisestä pisteestä 3, 6 ja 9 tunnin kohdalla tai siihen asti, kun haavavirhe oli sulkeutunut.

2, 5. Boyden Chamber Transwell Assay

100 µL SMC–suspensioita 1, 0–1, 5 × 105 solua/mL (1, 0-1, 5 × 104 kokonaissolua) kuormattiin Ylempiin transwell-insertteihin (Costar, Corning Incorporated) ja 600 µL SMC-väliainetta, joka sisälsi erilaisia pdgf-pitoisuuksia, sijoitettiin alempaan osastoon. 6 tunnin, 12 tunnin tai 24 tunnin inkubaation jälkeen transwellin kalvo värjättiin Hoechst 33342: lla (Invitrogen) valmistajan suosituksen mukaisesti, ja alapinnan transmigroidut solut laskettiin fluoresenssimikroskoopilla MetaMorph NX-mikroskopian automaatio-ja Kuvaanalyysiohjelmiston avulla (Biokompare, South San Francisco, CA). Alahuoneen väliaineesta ei koskaan tunnistettu soluja. Kokeissa, joissa arvioitiin, edustiko solusiirtymä kemotaksista vai satunnaista kemokinesiaa ilman pitoisuusgradienttia, lisättiin trombosyyttipohjainen kasvutekijä BB (pdgf) alakammioon, vain yläkammioon tai sekä yläkammioon että alakammioon.

2, 6. Mikrofluidilaitteiden määritys

mikrofluidilaitteet (Kuvat 1(a)-1(c)) valmistetaan muualla kuvatulla tavalla . Kuten kuvassa 1(d) esitetään, lisättyjen reagenssien gradientit ovat stabiileja vähintään 72 tunnin ajan. Koeprotokollasta riippuen arvioitavat solut sijoitetaan keskikaivoon ja kahdesta sivukaivosta kehittyy erilaisia kemotaktisia gradientteja. Vaihtoehtoisesti voidaan arvioida kahden eri solupopulaation siirtymistä sivukaivoista, jolloin keskuskaivoon asetettujen reagenssien aiheuttamat pitoisuusgradientit ovat identtiset. Solupitoisuudet olivat aina 4-5 × 105 / mL ja 40 µL solususpensioita (1,6–2,0 × 103 solua) kuormitettiin testikuoppiin.

soluja inkuboitiin laitteissa eri aikapisteissä ja värjättiin sitten Hoechst 33342: lla (Invitrogen). Kunkin solun sijainti määritettiin fluoresenssimikroskopialla (Nikon Eclipse TE2000-U; Nikon Instruments, Inc., Melville, NY), ja etäisyys siirretty arvioitiin käyttäen Matlab ohjelma (MathWorks, Natick, MA). ”Kokonaissiirtymä” määritellään niiden etäisyyksien summana, jotka kaikki solut ovat siirtyneet alkuperäisen aloituspaikan ulkopuolelle; tätä siirtymäindeksiä käytetään tilastolliseen analyysiin (kuva 2).

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(h)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(F)
(g)
(h)

kuva 2

solujen siirtymisen arviointi mikrofluidisissa laitteissa. Solut pinnoitettiin mikrofluidilaitteen keskialakaivossa siten, että 50 ng/mL PDGF SMC-elatusaineessa asetettiin vasempaan alakaivoon ja pelkkä SMC-elatusaine oikeaan alakaivoon, minkä jälkeen inkuboitiin 37°C: ssa 48 tunnin ajan. (a, b) Faasikontrastikuva solukemotaksista keskikanavasta 50 ng/mL PDGF: n suuntaan vasemmalla kanavalla; kuvat on jaettu kanavaa pitkin altaan ja lähdekaivojen välillä siten, että kanavan koko pituus voidaan esittää suurennoksella, joka mahdollistaa solun erottelukyvyn. (c, d) Faasikontrastikuva solukemokineesistä keskuskanavasta vain SMC-väliaineen suuntaan. (e, f) pienitehoinen fluoresenssikuva vasemmasta (e) tai oikeasta; (f) kanava 48 tunnin kohdalla Hoechst 33342-värjäyksen jälkeen. g) suuritehoinen fluoresenssikuva vasemmasta kanavasta paneelissa (e); kuvan oikeanpuoleisen sivun lähellä oleva musta neliö ilman soluja (asteriski) on rakenteellinen pylväs, joka merkitsee siirtymisen alkupistettä. h) esimerkki siirtymäanalyysistä. Pystysuora punainen viiva merkitsee alkupistettä; etäisyys alkupisteestä kunkin solun tuman keskipisteeseen mitataan, ja kaikkien näiden yksittäisten mittausten summasta tulee kokonaissiirtymäetäisyys MATLABin avulla.

Kollageenityyppiä I (Invitrogeeni) käytetään keski-ja sivukuoppien välisen kanavan täyttämiseen, ja se on substraatti, jonka kautta solut vaeltavat. Kollageenia voidaan käyttää sekä 1 mg/mL että 2 mg/mL. Vaikka 1 mg/mL kollageenia johtaa jonkin verran suurempaan epäspesifiseen taustasolukemokineesiin ja geelin kuormitus on teknisesti vaikeampaa kuin 2 mg/mL kollageenia käytettäessä, alhaisempi kollageenipitoisuus mahdollistaa suuremman siirtymisen SMC: n primaariviljelmiin ja määritysherkkyys on parempi. Ellei toisin mainita, kollageenipitoisuus migraatiokanavissa oli kaikissa kokeissa 1 mg / mL.

2, 7. Tilastollinen analyysi

tilastolliset vertailut tehtiin Opiskelijatestin tai yksisuuntaisen anovan avulla. Merkitys määriteltiin tasolla.

3. Tulokset ja keskustelu

kuten kuvassa 3(a) on esitetty, MMC-hoito estää solujen proliferaatiota. Solujen elinkyvyssä ei ole merkittävää eroa MMC-käsitellyn SMC: n ( % ) ja hoitamattoman SMC: n ( % ) välillä 48 tunnin ajan hoidon jälkeen. Näin ollen solujen kertyminen eri migraatiokokeissa edustaa todellista solujen liikettä ilman solun proliferaation komponenttia. Tämä on tärkeää, koska ilman MMC-käsittelyä pitkäaikaisten inkubaatioiden migraatioindeksit saattavat sekoittua solujen samanaikaiseen proliferaatioon.

(a)

(b)

(C)

(d)

(a)
(b)
(C)

primaarisilla SMC-viljelmillä suoritetuissa scratch-määrityksissä (kuva 3(b)) solut siirtyivät satunnaisesti (kemokinesia) täyttämään viat vertailukelpoisella nopeudella PDGF-pitoisuudesta riippumatta, myös ilman kemotaktista ainetta. Ilman MMC-hoitoa haavan vauriot yleensä sulkeutuvat hieman aikaisemmin, mikä viittaa solujen proliferaatioon.

Kuvassa 3(c) esitetään SMC: n siirtymätulokset Boyden chamber transwell-määrityksen avulla. Varhainen (12 h) aikapiste osoittaa pienen, mutta merkittävästi lisääntyneen migraation vasteena 10-50 ng/mL PDGF: lle verrattuna siihen, että alimmassa kaivossa ei ollut kemokiinia. Pdgf: n 10-kertaisella pitoisuusalueella tapahtuneessa siirtymässä ei kuitenkaan havaittu erotettavaa eroa, mikä viittaa siihen, että määritys on suhteellisen epäherkkä ainakin primaaristen SMC-viljelmien osalta. 24 tuntiin mennessä kemokiinipitoisuuksissa (väliainekontrolli mukaan luettuna) ei ole eroja, mikä viittaa siihen, että migraatio tässä vaiheessa on epäspesifistä, kun sytokiinipitoisuudet ovat alkaneet tasoittua ylä-ja alakuoppien välillä.

jotta voitaisiin muodollisesti osoittaa, että siirtyminen solukalvon läpi ylemmässä kuopassa ei välttämättä johdu suunnatusta kemotaksista, yläkuoppaan lisättiin pdgf: ää joko alaosaston PDGF: n kanssa tai ilman sitä. Vaikka kemokiinigradienttia ei ollutkaan, pdgf ylähuoneessa johti huomattavasti lisääntyneeseen sielunvaellukseen (kuva 3(d)); Tämä johtuu vain lisääntyneestä kemokineesista.

transwellikokeet viittaavat siis siihen, että vaikka alustavat PDGF-pitoisuuserot voivat aiheuttaa jonkin verran lisääntynyttä solujen siirtymistä kohti suurempia pitoisuuksia alemmissa kuopoissa, myöhempi PDGF-diffuusio johtaa satunnaiseen kemokineesiin.

vertailussa annos-vastekokeissa, joissa käytettiin mikrofluidilaitteita (Kuva 4), havaittiin merkittäviä kemotakseja niinkin pieninä pitoisuuksina kuin 2.5 ng/mL PDGF: ää (Kuva 4 b), ja annoksesta riippuva kemotaksin suureneminen, jonka huippupitoisuus on noin 25-50 ng/mL(Kuva 4 a). Mielenkiintoista on, että PDGF: n suuremmat pitoisuudet (esim.100 ng/mL) johtavat vähempään migraatioon, mikä vastaa suuren annoksen kemotaksipidätystä (18). On huomattava, että ilman aikaisempaa MMC-käsittelyä migraatioindeksi on suurempi (kuva 4(a)), mikä korostaa proliferaation merkittävää osuutta kemotaksin ”ilmeiseen” esiintymiseen pidemmillä määritysajoilla. The results demonstrate that the microfluidic device for measuring chemotaxis is substantially more sensitive than the existing scratch or ”gold standard” Boyden chamber approaches.

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figure 4

Microfluidic device assay. a) annos-vastekäyrät aiemman MMC-hoidon kanssa ja ilman sitä. MMC-käsitelty ja ei-käsitelty SMC sijoitettiin sivusolukuoppiin, joissa oli erilaisia pdgf-pitoisuuksia (5 ng/mL, 10 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL ja 100 ng/mL). Migraatio mitattiin Hoechst 33342-värjäyksen ja fluoresenssimikroskopian jälkeen 48 tunnin kuluttua käyttäen Matlab-ohjelmaa kokonaissiirtymän laskemiseen. Kontrollit (vain SMC-väliaine) ja PDGF: n jokainen pitoisuus arvioitiin kolmena laitteena. Pdgf: n välillä 5 ng/mL-100 ng/mL on merkittäviä eroja verrattuna kontrolliin (). (b) Kemokineesi verrattuna kemotaksiin mikrofluidisissa laitteissa. MMC-käsitelty SMC, jossa oli tai ei ollut 2, 5 ng/mL PDGF, pinnoitettiin keskussolukaivoon; sivulähdekaivoihin lisättiin 2, 5 ng/mL tai 50 ng/mL PDGF. Koska pdgf: ää ei esiinny keskussolukuopassa, määritys osoittaa merkitsevästi suurempaa kokonaissiirtymää 48 tunnin jälkeen, kun lähdekuopassa on 50 ng/mL (”0-50”) ja lähdekuopassa 2, 5 ng/mL (”0-2, 5”). 2, 5 ng / mL PDGF: n esiintyminen keskussolukaivossa johtaa merkittävästi suurempaan kokonaissiirtymään, kun on konsentraatiogradientti (”2, 5–50”; ) johtuu paikallisesta kemokineesivaikutuksesta. Ilman gradienttia (”2,5-2,5”) on kemokineesiin liittyvä migraatio, joka on huomattavasti pienempi kuin gradientin ollessa läsnä (”0-2, 5”;). C) paneelina (B) suoritettava aika-kurssi-koe.

paitsi että mikrofluidilaitetta voidaan käyttää kemotaksin mittaamiseen, sillä voidaan myös erityisesti erottaa kemokineesin ja kemotaksin vaikutus migraatioon (Kuva 4 b). Näin ollen kemokiinigradientin puuttuessa (esim. 2.5 ng/mL PDGF sekä keski-että sivukaivoissa), migraatioindeksi heijastaa kemokinesiaa. Vertailussa, jossa ei ole PDGF: ää keskikaivossa ja 2,5 ng/mL sivukaivossa, migraatioindeksi heijastaa suunnattua kemotaksista. Mikrofluidinen laite voi myös arvioida kemotaksin olemassa olevan kemokineesin läsnä ollessa, kuten silloin, kun keskuskaivossa on 2,5 ng/mL PDGF: ää ja sivukaivossa 50 ng/mL. On pieni, mutta tilastollisesti suurempi migraatio, kun ärsyke on kemotaktinen gradientti yksinkertaisen kemokineesin sijaan.

koska kemokiinigradientti määritetään 2 tunnin kuluessa (17) ja on vakaa useita päiviä, solut voivat jatkuvasti siirtyä ylöspäin pitoisuusgradienttia ajan kuluessa (Kuva 4(c)). Vertailussa muilla klassisilla menetelmillä ei joko ole pitoisuusgradienttia (scratch assay) tai niillä on vain ohimenevä kemokiinigradientti, joten kemokineesi—eikä suunnattu kemotaksis—vaikuttaa yhä enemmän.

tässä työssä ilmoitettu mikrofluidilaite on monilta osin parempi kuin muut aiemmin kemotaksian tutkimuksessa käytetyt in vitro-menetelmät. Erityisesti boydenin kammio – johon liittyy kemokiinigradientti huokoisella kalvolla-on ollut vakio kemotaktinen määritys 1950-luvulta lähtien. tällä laitteella on kuitenkin merkittäviä rajoituksia, koska gradientit eivät ole stabiileja eivätkä lineaarisia, ja ensimmäinen terävä pitoisuus nousee, joka vähitellen heikkenee ajan myötä. Viime aikoina on kehitetty MIKROELEKTROMEKAANISIA järjestelmiä (MEMS), jotka hyödyntävät mikrofluidisia biokertymiä in vivo-olosuhteiden jäljittelemiseksi; näissä laitteissa solut altistuvat jatkuvasti leikkaaville voimille kontrolloidussa virtauksessa. Näiden laitteiden jatkuva virtaus on kuitenkin haaste vakaiden kemokiinigradienttien ylläpidolle. Vaikka lähteen ja uppokanavan väliset hydrogeelit voivat luoda lineaarisia pitoisuusgradientteja , kaivojen ja kanavien hienovaraiset vaihtelut voivat aiheuttaa painegradientteja, jotka häiritsevät kaltevuuksia interstitiaalivirtauksen kautta ; lisäksi laitteiden jatkuva virtaus pyrkii laimentamaan solulähteiden erittämiä kemoattractantteja. Aiemmin kuvatussa uudessa mikrofluidisessa laitteessa, joka on validoitu sileän lihassolun siirtymiseen tässä paperissa, suuri tilavuus lähde-ja lavuaarikaivot säilyttävät vakaat kemokiinigladientit yhdistävässä hydrogeelissä; kaikki interstitiaalivirta eliminoidaan liittämällä lähde-ja lavuaarikaivot lisäkanaviin ja säiliöihin, jotka toimivat vastus-kondensaattoripiirinä. Pitoisuusgradientit ovat siis vakaita ja lineaarisia useita päiviä. Nykyinen työ on edelleen tarkentanut hakemusta sisällyttämällä siihen mitomysiini-C-käsittelyn, jolla vähennetään proliferaation mahdollista sekoittavaa vaikutusta, ja osoittamalla, miten kemotaksia ja kemokinesiaa voidaan arvioida samassa kokeellisessa kokoonpanossa.

eturistiriidat

kirjoittajat ilmoittavat, ettei heillä ole eturistiriitoja.

kiitokset

tätä työtä tuettiin BWH-BRI-rahaston apurahalla tutkimuksen huippuosaamisen ylläpitämiseen-Bridge-Tutkimusapurahalla. Chen Zhang sai tukea China Scholarship Councililta 18 kuukauden ajan. Ovid C. Amati ja Richard T. Leetä tuki osittain NSF: n tiede-ja teknologiakeskus CBET-0939511.