CRBN hajoaa tehokkaasti VHL-CRBN heterodimerisoivilla Protakeilla

PROTAC-teknologia hyödyntää E3-ligaaseja kohdeproteiinien tuhoamiseen. Pohdimme siis, voiko itse E3-ligaasi olla ubikitinoitunut ja hajota toisella E3-ligaasilla, jos kaksi eri E3-ligaasia sijoitetaan läheisyyteen. VHL-hajoavat aineet saattavat mahdollisesti olla erytropoietiinin korvikkeita hif1a: n aktivoitumisen kautta. Tämän suunnittelemiseksi yhdistimme POMALIDOMIDIN, CRBN-tähtäävän molekyylin, vhl032: een, VHL E3-ligaasi-ligandiin (Kuva. 1 A). Yhdistäjä yhdisti pomalidomidin aminoryhmän ja vh032: n terminaalisen asetyyliryhmän; koska nämä ovat liuotinaltoisia alueita, niiden välinen yhteys ei todennäköisesti häiritsisi niiden sitoutumista kuhunkin E3-ligaasiin. VHL-CRBN heterodimerisoivien Protakien synteesiin (Kuva. 1B ja täydentävä Kuva. S1A), 4-fluorotalidomidi (1) ja VHL-ligandi (5) valmistettiin aiemmin raportoidulla tavalla 33. 4-Fluorotalidomidia (1) käsiteltiin neljällä tert-butyyliesteriryhmän omaavalla amiinilinkerillä (2) n,n-di-isopropyylietyyliamiinin (DIPEA) läsnä ollessa dimetyylisulfoksidissa (DMSO) välituotteen muodostamiseksi (3). Kun tert-butyyliryhmä poistettiin kohdassa 3 käsittelemällä trifluorietikkahappoa (TFA) dikloorimetaanissa (DCM), happo (4) yhdistettiin VHL-ligandiin (5 tai 7) 1–1H-1,2,3-triatsolopyridinium-3-oksidiheksafluorifosfaatin (HATU) ja DIPEAN läsnä ollessa, jolloin saatiin PROTACS (6), TD-158, TD-165, TD-343 ja TD-487 (8).

näiden yhdisteiden käsittelyn jälkeen tarkastelimme VHL: n ja CRBN: n pitoisuuksia Western blot-analyysillä. Hoito TD-158: lla, TD-165: llä tai TD-343: lla aiheutti pitoisuudesta riippuvan CRBN-proteiinien tason laskun (Fig. 1C, ylempi paneeli). Sekä VHL: n pitkän muodon että VHL: n lyhyen muodon tasot kuitenkin kasvoivat, oletettavasti johtuen stabiloitumisesta kemiallisen ja proteiinin välisellä vuorovaikutuksella (Fig. 1C, ylä-keski-ja alapaneelit) 34. Käytettäessä 10 µM TD-158-hoitoa CRBN-tasot palautuivat; tämä ”koukku” – vaikutus on tyypillinen ominaisuus, joka esiintyy suuren annoksen PROTAC-indusoidun proteiinin hajoamisessa9,35,36,37. TD-487, TD-165: n stereoisomeeri, ei kuitenkaan onnistunut aiheuttamaan CRBN: n hajoamista (Kuva. 1C). TD-343: lla oli suhteellisen heikko aktiivisuus, mikä viittaa siihen, että hapen sisällyttäminen linkkeriin estää PROTACIN toimintaa. Kvantitatiivinen käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio (RT-PCR)-analyysi osoitti, että VHL-CRBN-heterodimerisoivien Protakien aiheuttama CRBN-tason lasku ei johtunut mRNA: n muutoksista (täydentävä Kuva). S1B). Kaikista syntetisoiduista yhdisteistä mitattiin 50%: n hajoamispitoisuus (DC50) ja suurin hajoamisarvo (Dmax). TD-158: n laskennalliset DC50-ja Dmax-arvot olivat 44,5 nM ja 97.1%, ja vastaavat arvot TD-165: lle olivat 20, 4 nM ja 99, 6% (Kuva. 1D ja täydentävä Kuva. S1D). Lyhyempi linkkeriä sisältävä degeneraattori TD-156 (DC50 = 100,6 nM, Dmax = 96,9%) osoitti heikompaa aktiivisuutta verrattuna TD-165: een (täydentävä Kuva. S1C). TD-343 (DC50 = 367,8 nM, Dmax = 85,1%), jossa yhdistimeen on sisällytetty happea, johti CRBN: n tehottomaan hajoamiseen. Testataksemme talidomidiin liittyvän yhteyden vaikutusta tutkimme CRBN: n hajoamista VHL-CRBN heterodimerisoimalla Protakeja eri sidoksella. TD-760 (DC50 = 367.7 nM, Dmax = 82%), jossa on glykolinen sidos, ja TD-033 (DC50 = 2546, 1 nM), jossa on amidisidos, CRBN: n hajoaminen oli vähäisempää, kun taas TD-759: n (DC50 = 28, 8 nM), jossa on glysiinisidos, teho oli samanlainen kuin TD-165: n. Selvittääksemme, voivatko suhteelliset proteiinitasot edistää tätä yksipuolista proteiinin hajoamista, käsittelimme soluja yli-ekspressoimalla VHL: ää, CRBN: ää tai molempia TD-158: lla ja analysoimme CRBN-ja VHL-tasoja. Kaikissa tapauksissa CRBN-tasot laskivat, kun taas VHL-tasot pysyivät samanlaisina tai nousivat (Kuva. 1 E). Aika-kurssikokeissa TD-158 hajotti CRBN: n yli 80% 3 tunnin kuluessa ja hajotti sen täysin 12 tunnin kuluttua (kuva. 1). TD-158: n indusoimaa CRBN: n hajoamista havaittiin myös eri ihmisen solulinjoissa (Supplementary Fig. S2A-D).

Crbn: n hajoaminen VHL-CRBN: n heterodimerisoivan Protacsin vaikutuksesta riippuu CRL2VHL: stä

sen varmistamiseksi, että TD-158: n aiheuttama CRBN: n hajoaminen oli riippuvainen UPS: stä tai Cullin-renkaan ubikitiiniligaaseista (CRL), testasimme bortetsomibin, proteasomin estäjän, ja mln4924: n, neddylaation estäjän. Samanaikainen hoito TD-158: n ja bortetsomibin tai mln4924: n kanssa esti CRBN: n hajoamista (Kuva. 2A ja täydentävä Kuva. S3A). Odotetusti poly-ubikitiiniketjun muodostuminen lisääntyi huomattavasti TD-158: n läsnä ollessa (Kuva. 2b). Lisäksi VHL: n knockdown by small interfering RNA (siRNA) heikensi TD-158: n aiheuttamaa CRBN: n hajoamista hek293t–soluissa (Kuva. 2C). Sen sijaan VHL: n ilmentyminen 786-O-soluissa, VHL: n puutteellisessa munuaissyöpäsolulinjassa, palautti TD-158: n aiheuttaman CRBN: n hajoamisen (Kuva. 2D). Näiden tulosten mukaisesti CULLIN2: n siRNA-välitteinen knockdown, crl2vhl-kompleksin telineproteiini, esti TD–158: n aiheuttaman CRBN: n hajoamisen (Kuva. 2 E). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että CRBN hajoaminen VHL-CRBN heterodimerointi PROTACs on riippuvainen CRL2VHL monimutkainen.

tehokas hajoaminen Protakeilla edellyttää ternaarisen kompleksin muodostumista kohdeproteiinin ja E3 ligase9,38: n kanssa. Tämän testaamiseksi teimme rinnakkaisrokotuksia. Havaitsimme, että eksogeenisesti ilmaistu lippu-merkitty CRBN co-immunoprepitated endogeeninen VHL TD-158: n läsnä ollessa, mutta ei sen puuttuessa (Kuva. 2). GST: n vetokokeet puhdistetuilla proteiineilla osoittivat, että CRBN oli suoraan vuorovaikutuksessa VHL-Elongin B/C-kompleksin kanssa TD-158: n läsnä ollessa (Kuva. 2G). Lisäksi ylimääräisen pomalidomidin tai VHL-ligandin lisääminen esti TD-158: n aiheuttamaa CRBN: n hajoamista (Supplementary Fig. S3B, C). Eksogeenisesti ilmaistu CRBN Y384/W386A (AA), pomalidomidia sitova viallinen mutantti16, ei hajonnut TD-158: lla (täydentävä Kuva. S3D). Näin ollen nämä tiedot viittaavat siihen, että crbn: n, VHL: n ja TD-158: n välinen kolmen kompleksin muodostuminen on edellytys CRBN: n hajoamiselle.

maailmanlaajuinen proteominenanalyysi paljastaa, että TD-158 indusoi crbn: n hajoamista

tutkiaksemme crbn: n hajoamista puolueettomasti suoritimme kvantitatiivisen proteomianalyysin. Minimoidaksemme crbn: n hajoamisen toissijaiset vaikutukset käsittelimme Jurkatin soluja, jotka ilmaisivat CRBN-ja IMiD neo-substraatteja, TD-158: lla tai DMSO: lla (vehicle control) 12 tunnin ajan. jokaisen näytteen proteiinit pilkottiin ja pilkkoutuneet peptidit merkittiin isobaarista merkintää varten liitettynä nestekromatografiaan-tandem-massaspektrometriaan. Analyysissä tunnistettiin 7 148 proteiinia, jotka sisältävät enemmän kuin kolme ei-redundanttia, ainutlaatuista peptidiä (täydentävä taulukko S1). Vain kolme proteiinia-CRBN, CNIH1 ja LMBRD2-täyttivät kriteerit, joiden mukaan P-arvo = 0,05 ja yli 1,5-kertainen muutos. Niistä CRBN oli ainoa proteiini, joka muuttui yli 2-kertaiseksi(Kuva. 3 A). Muiden crl4crbn-kompleksien (CUL4A, CUL4B, DDB1 ja RBX1) ja CRL2VHL-kompleksien (elongin C, elongin B , CUL2 ja RBX1) pitoisuudet pysyivät kuitenkin muuttumattomina (Kuva. 3B, C). Mielenkiintoista on, että aiemmin raportoitujen imidien neo-substraattien, mukaan lukien IKZF1, IKZF3, ZFP91, ZNF276 ja ZNF653, pitoisuudet eivät muuttuneet TD-158-hoidon yhteydessä (Kuva. 3B) 39,40,41. Nämä tulokset vahvistettiin immunoblottauksella Jurkatissa ja useissa multippelin myelooman solulinjoissa(Kuva. 3D ja täydentävä Kuva. S2A-D).

CRBN: n hajoaminen VHL-CRBN: n heterodimeroimalla PROTACs: ää kertautuu CRBN: n puutos

crl4crbn: n endogeeninen substraatti on glutamiinisyntetaasi GLUL, joka on keskeinen entsyymi glutamiinin biogeneesissä. ASETYYLITRANSFERAASI CBP / p300 asetyloi kaksi GLUL: N N-terminaalista lysiinijäämää olosuhteissa, joissa glutamiinipitoisuus on suuri, ja saatu asetyloitu GLUL vangitaan ja ubikitinoituu CRL4CRBN: llä ja poistetaan sen jälkeen proteasomeilla 22. Tutkiaksemme TD-158: n vaikutusta GLUL-pitoisuuksiin näännytimme glutamiinin Hep3B-soluja 48 tunnin ajan ja jatkoimme glutamiinia TD-158: n läsnä ollessa tai ilman sitä. TD-158 indusoi CRBN: n hajoamista glutamiinistatuksesta riippumatta, ja GLUL: n pitoisuudet laskivat hitaammin ajan kuluessa TD-158: n läsnä ollessa kuin ilman sitä (Kuva. 4 A,B). Lisäksi in vivo ubikitinaatiokokeet osoittivat, että GLUL: n ubikitinaatio väheni TD-158: n läsnä ollessa (Kuva. 4c). Tutkimme myös, aiheuttaako TD-165-hoito soluille resistenssin IMiD: lle. Kahta Imidille herkkää solulinjaa, WSU-DLCL2: ta ja RPMI8226: ta, hoidettiin ensin TD-165: llä tai DMSO: lla 24 tunnin ajan ja sitten pomalidomidilla, TD-165: llä tai molemmilla 3 tunnin ajan. 4D, E). Nämä tiedot yhdessä osoittavat, että CRBN: n hajoaminen VHL-CRBN: n heterodimerisoimalla PROTACs: ää vahvistaa CRBN: n puutteen.

tutkiaksemme VHL-CRBN: n heterodimerisoivien Protakien in vivo-vaikutuksia yritimme selvittää, voiko TD-165 aiheuttaa CRBN: n hajoamista eläinmalleissa. Vaikka aminohappojäämät hiiren CRBN: ssä (mCRBN), jotka ovat tärkeitä teratogeenisuuden kannalta, eivät säily, mCRBN hajosi selvästi, joskin hieman vähäisemmässä määrin, TD-165: n vaikutuksesta hiiren alkion fibroblasteissa (täydentävä viikuna). S4A). Sitten annoimme TD-165: tä intraperitoneaalisesti hiirille selvittääksemme, aiheuttaako TD-165 CRBN: n hajoamista in vivo. CRBN-tasot eivät kuitenkaan muuttuneet pernassa, perifeerisen veren mononukleaarisoluissa (pbmc) tai maksassa (täydentävä viikuna. S4B). Koska TD-165: n farmakokinetiikka on kohtuullinen (täydentävä taulukko S2), vaikutuksen puuttuminen saattaa johtua TD-165: n suuresta sitoutumisesta plasman proteiineihin (99, 9%) (täydentävä taulukko S3).

n-terminaalisesti typistettyä CRBN: ää ei hajota VHL-CRBN: n heterodimerisoivalla Protakilla

määrittääksemme, mikä crbn: n toimialue on tärkeä TD-165–välitteiselle CRBN: n hajoamiselle, tuotimme sarjan CRBN: n deleetiomutantteja (D1–D4), kuten kuvassa on kuvattu. 5a. solut, jotka ilmentävät täyspitkää CRBN: ää tai yksittäisiä deleetiomutantteja, käsiteltiin joko DMSO: lla tai TD-165: llä, ja solujen lysaatit tutkittiin hajoamisen varalta TD-165-käsittelyn jälkeen. Yllättäen yksikään neljästä CRBN: n poistomutantista ei huonontunut TD-165: llä, kun taas täyspitkä CRBN heikkeni tehokkaasti (Kuva. 5b). Erityisesti VHL: n tasot olivat hieman koholla oletettavasti kemiallisen proteiinin vuorovaikutuksen vakiintumisen vuoksi TD-165: n läsnä ollessa, mutta eivät muuttuneet typistettyjen CRBN-mutanttien ilmentymisen vuoksi TD-165: n läsnä ollessa (Kuva. 5b). Yksi mahdollinen selitys tälle olisi deleetiomutanttien kykenemättömyys muodostaa ternaarinen kompleksi. D1-mutantti kuitenkin muodosti ternaarisen kompleksin TD-165: n ja VHL: n kanssa (kuva. 5C) ja D1: n ubikitinaatio lisääntyi TD-165: n läsnä ollessa (Kuva. 5D). Sitten oletimme, että crbn: n aminoterminaalisia lysiinijäämiä tarvitaan ubikitinaatioon. Testataksemme tätä ajatusta korvasimme kaikki kolme CRBN: n n-terminuksessa olevaa lysiinijäämää (a.a. 1-80) arginiinilla, yksittäin ja yhdessä, ja tutkimme sitten crbn: n hajoamista varten solulysaatteja. TD-158 hajotti tehokkaasti kaikki mutantit samassa määrin kuin villityyppinen CRBN (Kuva. 5E), mikä osoittaa, että CRBN: n n-terminuksessa olevia kolmea lysiinijäämää ei tarvita VHL-CRBN-heterodimerisoivien Protakien aiheuttamaan hajoamiseen.

kohdeproteiinin häiriintynyt alue tarvitaan tehokkaaseen PROTACIN aiheuttamaan hajoamiseen

seuraavaksi pyrittiin määrittämään rakenteelliset erot täyspitkän CRBN: n ja CRBN: n deleetiomutantin D1 välillä. CRBN: n n-päätepisteen (a.a. 1-80) ennustettiin IUPred2A-analyysin (Supplementary Fig. S5A). Tämä sekasortoinen alue (a. a. 1-48) oli crl4crbn-kiderakenteessa joustavuutensa vuoksi erottamaton (PDB-merkintä; 6BN7). On osoitettu, että luonnostaan häiriintynyt alue on yksi proteasomaalisen degronin pääkomponenteista ja se toimii proteasomaalisen proteolyysin initiaattorina25. Vaihtoehtoisesti, jos kyseessä ovat pallomaiset proteiinit, joilla ei ole sekaista aluetta, P97/valosiinia sisältävä proteiini (P97/VCP)-kompleksi voi avata sekundaarirakenteen, mikä helpottaa proteiinien proteasomaalista hajoamista. Tutkiaksemme PROTACIN indusoiman proteiinin hajoamisen ja p97/VCP-kompleksin välistä suhdetta testasimme p97/VCP-inhibiittorin N2, N4-dibentsyylikinatsoliini-2,4-diamiinin (DBeQ) vaikutusta TD–165: n indusoimaan CRBN-hajoamiseen. Nämä kokeet osoittivat, että DBEQ-hoito ei vaikuttanut CRBN: n hajoamiseen (Fig. 6 A). DNA-vaurioita indusoivan transkription 3 (DDIT-3; CHOP) ja positiivisina kontrolleina käytetyn lipidoidun LC-3II: n pitoisuudet olivat koholla DBeQ-hoidon yhteydessä. P97: n kaatuminen siRNA-tai DBeQ-hoidon vaikutuksesta heikensi ERAD-ja autophagy-reittejä, mikä johti CHOP: n, vakiintuneen UPR-merkkiaineen, säätelyyn ja LC-3II: n, edustavan autophagy-merkkiaineen, kertymiseen (Kuva. 6 A) 42. Sen vuoksi tutkimme, helpottaako crbn: n häiriintynyt alue PROTACIN aiheuttamaa proteasomaalista hajoamista, kiinnitimme crbn: n häiriintyneen alueen (a.a. 1-80) D2 -, D3-ja D4-mutantteihin ja tutkimme kimeeriset proteiinit hajoamista varten. Kaikki kimeeriset proteiinit, erityisesti D4-khimera, hajosivat TD-165: n vaikutuksesta pitoisuusriippuvaisesti (Kuva. 6b). CRBN: n epäyhtenäisen alueen kulkeutuminen VHL: n N – tai C-terminaaliin ei kuitenkaan aiheuttanut fuusioproteiinin hajoamista (Kuva. 6C), mikä osoittaa, että epäjärjestyneen alueen kiinnittyminen ei riitä kaikille kohdeproteiineille. Laajentaaksemme tätä ajatusta muiden Protacien aiheuttamaan hajoamiseen testasimme ARCC4: ää, aiemmin ilmoitettua androgeenireseptoria (AR) PROTAC43, koska AR sisältää myös avautumattoman alueen N-terminuksessa (a.a. 1-330), määritettynä IUPred2A-analyysityökalulla(täydentävä Kuva. S5B). Arcc4-käsittelyn yhteydessä AR ilman N-terminaalista häiriintynyttä aluetta (ΔN330) hajosi tehottomammin kuin täysimittainen AR. Kiehtovasti crbn: n epäjärjestetyn alueen (a.a. 1-80) kiinnittäminen AR ΔN330: een lisäsi hajoamistehokkuutta (Kuva. 6D ja täydentävä Kuva. S5C). Tämän mukaisesti AR-epäjärjestyksen alueen (a.a. 1-170) kiinnittyminen CRBN D1-mutanttiin edisti myös proteolyysiä TD-165: llä (Kuva. 6 E ja täydentävä Kuva. S5D).

näiden havaintojen vahvistamiseksi valitsimme kirjallisuushaun perusteella Protacit, joilla on korkea teho (DC50 < 1 µM), ja analysoimme ne sitten luontaisesti sekavan alueen osalta iupred2a-työkalulla. Mielenkiintoista on, että kahdella kolmasosalla valituista PROTAC-kohdeproteiineista havaittiin olevan yli 40 aminohapon epäjärjestynyt alue joko yhdessä termiineistään tai sisäisesti (Taulukko 1)44, vaikka aminohapposekvenssiin perustuva epäjärjestyksellisten tai jäsentymättömien alueiden ennustaminen ei ota muita tekijöitä, kuten proteiinin ja proteiinin vuorovaikutusta tai translaation jälkeisiä muutoksia, huomioon 44, 45,46. Tämän mukaisesti VHL-Homo-PROTACIN on osoitettu aiheuttavan VHL: n pitkän muodon hajoamista, jossa on epäjärjestyksessä oleva alue sen n-päätepisteessä, mutta ei VHL: n lyhyttä form47: ää. Näin ollen tämä tukee käsitystämme siitä, että protacsin tehokas hajoaminen edellyttää kohdeproteiinien häiriintynyttä aluetta.