Abstrakti

on kehitetty suora ja erittäin spesifinen kemiluminesenssiin liittyvä entsyymi-immunologinen määritysmenetelmä (CL-ELISA) kloramfenikolin (CAP) seuraamiseksi kosmetiikassa. Tässä työssä suoraan immunomääritykseen käytetty anti-kloramfenikoli-vasta-aine (MAB) voisi sitoutua erityisesti CAP: hen siten, että ristireaktiivisuus (CR) on vähäinen (alle 0, 01%) useimpien CAP-analogien kanssa, mukaan lukien rakenteellisesti samankaltaiset tiamfenikoli (TAP) ja florfenikoli (FF). Ic10: llä mitattu havaitsemisraja (LOD) oli 0, 0021 ng mL−1. Havaitsemisalue (IC20-IC80) oli 0, 00979−0, 12026 ng mL-1. Kasvinsuojeluainenäytteissä keskimääräinen saanto vaihteli 82,7 prosentista 99,6 prosenttiin, ja päivänsisäinen vaihtelu oli vastaavasti alle 9,8 prosenttia ja päivänsisäinen vaihtelu 8,2 prosenttia. Lisäksi HRP-merkityn anti-CAP mAb: n avulla menetelmää voitiin käsitellä nopeasti suoraan immunoreaktiotilassa. Tätä CL-ELISA-menetelmää voitaisiin soveltaa CAP: n spesifiseen, nopeaan, semikvantitatiiviseen ja kvantitatiiviseen osoittamiseen kosmetiikassa, mikä helpottaisi CAP: n kontaminaation tarkkaa laadunvalvontaa.

1. Johdanto

kloramfenikoli (CAP) kuuluu amphenikoliperheeseen antibakteerisia aineita, ja niitä tuotti Venezuelalainen streptokokki (rakenne kuvassa 1) . Kloramfenikoli tehdään yleensä laajakirjoisena antibioottina, jolla on tehokas antimikrobinen vaikutus. Se voi olla yleensä vastaan levinnyt erilaisia grampositiivisia ja Gram-negatiivisia bakteereja, mukaan lukien anaerobiset organismit . Korkean aktiivisuuden vuoksi kloramfenikolia käytetään laajalti kotieläintuotannossa, vesiviljelyssä ja kosmetiikkateollisuudessa bakteeri-infektion ehkäisyyn ja hoitoon. Tuoreissa julkaisuissa kloramfenikolia on raportoitu käytettävän epifollikuliitin, aknen ja muiden ihosairauksien hoitoon. Kloramfenikoli otettiin laajalti käyttöön myös kosmetiikassa antiseptisenä aineena mikro-organismien kasvun estämiseksi .

viimeaikaiset tutkimukset kuitenkin osoittivat, että amphenikoliantibiooteilla oli potentiaalisia haittavaikutuksia ihmisten terveydelle . Siksi kloramfenikolin käyttö on kielletty monissa maissa, muun muassa EU: n jäsenvaltioissa, Yhdysvalloissa ja Kiinassa . Vaikka näille antibiooteille on viralliset määräykset, kloramfenikolia lisätään edelleen laittomasti kosmetiikkaan sen edullisuuden ja erinomaisen antibakteerisen vaikutuksen vuoksi. Kosmetiikan turvallisuuden varmistamiseksi ja ihmisten terveyden säilyttämiseksi on tärkeää kehittää herkkiä, luotettavia ja käytettävissä olevia menetelmiä kloramfenikolin havaitsemiseksi kosmetiikkanäytteiden jäljitystasoilla.

CAP: n ja siihen liittyvien antibioottien havaitsemiseksi raportoitiin lukuisia analyysimenetelmiä, kuten korkean erotuskyvyn nestekromatografia (HPLC) , kaasukromatografia (GC) ja nestekromatografia-tandem-massaspektrometria (LC-MS / MS) . Nämä menetelmät vaativat kuitenkin pääasiassa kalliita välineitä, monimutkaisia esikäsittelymenetelmiä ja hyvin koulutettuja esikuntia, eivätkä ne soveltuneet suurten näytteiden nopeaan seulontaan. Pääasiallisesti vasta-aine-antigeenispesifiseen tunnistukseen perustuvia immunomäärityksiä käytettiin kohde-analyyttien suurikertoimiseen ja nopeaan seulontaan. Kemiluminesenssisubstraattia, jolla on erittäin herkkä luonne, voidaan käyttää suorassa kemiluminesenssiin liittyvässä entsyymi-immunosorbenttimäärityksessä (CL-ELISA). Verrattuna perinteisiin kolorimetrisiin protokolliin immunomääritysten herkkyyttä voitaisiin parantaa vähintään 2~3 kertaa kemiluminesenssillä substraattina.

aikaisemmat kirjallisuustiedot CAP: n immunomäärityksestä eivät pysty erottamaan CAP: tä sen amphenikoliperheen analogeista (Kuva 1), mukaan lukien tiamfenikoli (TAP) ja florfenikoli (FF), koska spesifiset vasta-aineet ovat erittäin laajoja . Näissä tutkimuksissa on vaikea määrittää, onko kontaminaatiokatto, sen analogit tai niiden summa, kun positiivinen tulos. Tässä tutkimuksessa käytimme korkean spesifisen anti-CAP-monoklonaalisen vasta-aineen (mAb), joka voi sitoutua CAP-spesifisyyteen ja vähäpätöisiin CR-arvoihin useimmille testatuille analogeille. Juuri tämän mAb: n pohjalta kehitettiin erittäin erityinen ja suora CL-ELISA-menetelmä Cap: n jäämien määrittämiseen kosmetiikassa. Tämä kehitetty protokolla ei tarvitse monimutkaista epäsuoraa konjugaatioreaktiota HRP-merkityn sekundaarisen vasta-aineen kanssa. Kemiluminesenssisubstraatilla herkkyys voitaisiin parantaa merkittävästi (kaaviokuva kuvassa 2). Kun käytettiin HRP-merkittyä anti-CAP mAb: tä, määritys suoritettiin fast direct immunoreaction-tilassa ilman monimutkaisia immunoreaktiomenetelmiä. Tätä cl-ELISA-menetelmää voidaan soveltaa CAP: n spesifiseen, nopeaan, semikantitatiiviseen ja kvantitatiiviseen havaitsemiseen kosmetiikassa, ja tämä työ edistää CAP: n laadunvalvontaa ja sääntelyä.

2. Materiaalit ja menetelmät

2.1. Kemikaalit ja reagenssit

kloramfenikoli (CAP), siprofloksasiini (CIP), florfenikoli (FF), penisilliini (PEN), raktopamiini (RAC), salbutamoli (SAL), sulfadiatsiini (SUL) ja tiamfenikoli (TAP) ostettiin Sigma Aldrichilta (99% purity, St. Louis, MO, USA). ZEYANG Co: lta saatiin CAP-konjugoitua antigeenia ja HRP-merkittyä CAP-vasta-ainetta. (Peking, Kiina). SuperSignal chemiluminescence-substraattiliuos ostettiin Thermo Fisheriltä (USA). Milli-Q-Synteesijärjestelmä saatiin milliporesta (Bedford, MA, USA) vedenpuhdistukseen. Muut reagenssit (analyyttistä laatua) ostettiin Beijing Reagent Corp. (Peking, Kiina).

2, 2. Laitteet ja instrumentointi

Costar valkoiset läpinäkymättömät 96-kuoppaiset polystyreeniset mikrotiitterilevyt (Costar Inc., Milpitas, CA, USA) käytettiin tässä työssä. SpectraMax M5 microplate reader saatiin Molecular Devices (CA, USA). MIKRO 22R-sentrifugia saatiin Hettich Laborapparatesta (Tuttlingen, Saksa).

2, 3. Puskurit ja liuokset

tätä kehitettyä cl-ELISA-määritystä varten valmistettiin erilaisia puskureita ja liuoksia immunomääritystä varten.

Fosfaattipuskurisuola (PBS, 0, 01 M, pH 7, 4): 8, 0 g NaCl: ää, 2, 9 g Na2HPO4: ää, 0, 2 g KH2PO4: ää ja 0, 2 g KCl: ää liuotettiin 1 litraan deionisoitua vettä.

Estopuskuri (pH 7,4): 0, 5% kaseiinia 0, 01 M PBS: ssä.

Päällystyspuskuri (pH 9,6): 1,59 g Na2CO3: A ja 2,93 g NaHCO3: a liuotettiin 1 litraan deionisoitua vettä.

entsyymilaimennuspuskuri (pH 7,4): 5% sikiöiden seerumia 0,01 M PBS: ssä.

Pesupuskuri (PBST): 0, 01% Tween-20 0, 01 M PBS.

2, 4. Immunomääritysreaktiota varten hyväksyttiin kompetitiivinen kemiluminesenssi ELISA (cl-ELISA)

Costar valkoiset läpinäkymättömät 96-kuoppaiset polystyreeniset mikrotiitterilevyt. 100 µL CAP-konjugoitua antigeenia liuotettiin päällystyspuskuriin lopullisena pitoisuutena 0, 00042 ng mL-1, joka lisättiin ja inkuboitiin 4°C: ssa 20 tunnin ajan pinnoittamista varten. Kun suojapuskuria oli käytetty kolme kertaa, jokaiseen kaivoon lisättiin estopuskuri (150 µL kuoppaa kohti) ja sitä inkuboitiin ylimääräisten aktiivisten kohtien täyttämiseksi 37°C: ssa 1,5 tunnin ajan. pinnoitetut levyt säilytettiin 4°C: ssa ennen käyttöä.

korkin määritystä varten päällystetyt mikrotiitterilevyt esivakioitiin huoneenlämmössä 30 minuutin ajan. Sitten jokaiseen kuoppaan lisättiin 30 µL prosessoituja näytteitä tai CAP-standardia ja 70 µL HRP-merkittyä anti−CAP-vasta-ainetta (2, 46 ng mL-1), joka on laimennettu entsyymilaimennuspuskurilla. Levyjä inkuboitiin 37°C: ssa 30 minuutin ajan suoraa kilpailureaktiota varten. Kun levy oli pesty pesupuskurilla viisi kertaa, siihen lisättiin Supersignaali kemiluminesenssisubstraattiliuos (100 µL/kuoppa) ja kunkin kuopan kemiluminesenssin voimakkuus mitattiin SpectraMax M5-mikrotiitterilukijalla.

2, 5. Standardikäyrä

kymmenen eri pitoisuustasoa testattiin kalibrointikäyrien arviointia varten. Suurin pitoisuus oli 1000 ng mL-1, ja seuraavat pitoisuudet laimennettiin sarjamaisesti kolmanneksella edellisestä. Jokainen konsentraatio ajettiin kolme kertaa CL-ELISA-protokollan mukaisesti.

b / B0 on määritelty tulosten kemiluminesenssisuhteelle. Tässä B tarkoittaa eri CAP-standardin mukaista kemiluminesenssin intensiteettiä ja B0 kemiluminesenssin intensiteettiä ilman CAP-standardia kussakin testissä.

Standardikäyrät arvioitiin piirtämällä B/B0 eri CAP-standardin pitoisuudella ja sovittamalla tiedot seuraavaan neljän parametrin logistiseen yhtälöön käyttäen Origoa (versio 7.5, OriginLab, Northampton, MA, USA):tässä yhtälössä A tarkoittaa ylempää asymptoottia (kemiluminesenssisuhde B / B0 ilman CAP-standardia). B on käyrän kaltevuus taivutuspisteessä. C, joka edustaa 50% suurimmasta absorbanssista, on X-arvo taivutuspisteessä. Ja D on alempi asymptootti (taustasignaali).

2, 6. Cl-ELISA-analyysia

Kosmetiikkanäytteet (2, 00 g ± 0, 02 g) punnittiin tarkasti ja siirrettiin 50 mL: n polypropyleenisentrifugiputkiin. Sitten lisättiin 20 mL PBS: ää ja pyörrettiin 30 s: n ajan ja sitten ultra-sonication 3 min: n ajan korkin uuttamiseksi. Jokainen näyte sentrifugoitiin 12000 gramman painolla 10 minuutin ajan 4°C: ssa, ja supernatantti kerättiin ja suodatettiin 0,22 µm: n kalvon läpi. Kunkin näytteen supernatantin kolmekymmentä mikrolitran aliquotia lisättiin pinnoitetulle 96-kuoppalevylle analysoitavaksi kehitetyn CL-ELISA-menetelmän mukaisesti.

2, 7. Tarkkuus ja tarkkuus

negatiiviset primer lotion-kosmetiikkanäytteet vahvistettiin aiemmin UPLC-MS / MS-analyyseillä. Sitten jokaiseen näytteeseen lisättiin CAP-standardi kolmella eri pitoisuudella 5, 20 ja 100 ng L−1. Analyysi käsiteltiin kehittyneen CL-ELISA-protokollan mukaisesti viidellä toistolla kussakin (n = 5). Näytteiden pitoisuudet laskettiin kalibrointikäyrän mukaan ja tarkkuus ja tarkkuus arvioitiin kaikkien näytteiden saantojen perusteella.

3. Tulokset ja keskustelu

3.1. Spesifisyys

menetelmän spesifisyyttä arvioitiin arvioimalla ristireaktiivisuuden (CR) laajuutta rakenteellisesti samankaltaisten CIP -, FF -, PEN -, RAC -, SAL -, SUL-ja TAP-yhdisteiden kanssa. CR-arvoja arvioitiin seuraavalla yhtälöllä:Tässä yhtälössä IC50 on aineen puolet maksimaalisesta inhibitorisesta pitoisuudesta. Anti-CAP mAb-menetelmän spesifisyys on esitetty taulukossa 1. Tuloksista saatiin vähäpätöiset CR-arvot (alle 0, 01%) kaikille tässä tutkimuksessa tutkituille analogeille, mukaan lukien useimmat rakenteeseen liittyvät hanat ja FF. Voidaan päätellä, että tätä kehitettyä CL-ELISA-määritystä voitaisiin soveltaa erityiseen CAP-tunnistukseen.

3, 2. Cl-ELISA-menetelmän optimointi

kilpailevan reaktiojärjestelmän antigeeni-vasta-aine-suhde vaikuttaa merkittävästi immunoreaktioon. Tässä cl-ELISA-protokollassa antigeenin ja vasta-aineen suhde arvioitiin ja optimoitiin. Antigeenin ja vasta-aineen suhde 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, ja 30:70 tutkittiin. Tulokset optimoitiin IC50: n ja rlumax: n (suurin suhteellinen valoyksikkö) mukaan, ja ne on esitetty taulukossa 2. IC50-arvo suureni merkittävästi vasta-ainesuhteen kasvaessa. Kun antigeenin ja vasta-aineen suhde oli 70:30, saatiin herkin tulos PIENIMMÄLLÄ IC50-arvolla. Lisäksi suuri määrä vasta-aineita johti korkeaan RLUmax-arvoon. Testattujen antigeenin ja vasta-aineen suhteiden osalta kaikki RLU-arvot soveltuivat kuitenkin CAP: n toteamiseen. Kemiluminesenssisubstraatin suuren herkkyyden vuoksi rlumax-arvossa ei ollut selvää eroa. In order to obtain the most optimized and sensitive result, an antigen to antibody ratio of 70:30 was adopted in this research.

3, 3. Herkkyys

IC50, LOD (mitattuna IC10: llä) ja ilmaisualue (IC20−IC80) saatiin sigmoidisesta kalibrointikäyrästä ehdotetun CL-ELISA-protokollan herkkyyden arvioimiseksi (kuva 3). Tässä tutkimuksessa LOD oli 0, 0021 ng mL−1, kun taas IC50-arvo oli 0, 016 ng mL-1 CAP: lle. Tämän menetelmän osoitusalue oli 0, 00979−0, 12026 ng mL-1. Vakiintuneisiin immunomäärityksiin verrattuna tämän menetelmän herkkyys oli suurempi ja CAP: n LOD-arvo pienempi .

3, 4. Tarkkuus ja tarkkuus

tarkkuuden ja tarkkuustutkimuksen osalta laskettiin ensin kantojen saanto näytteissä, joihin on lisätty väkevyyttä. Tarkkuus ja tarkkuus arvioitiin viidellä rinnakkaisnäytteellä jokaisena kolmena validointipäivänä. Kolmella vahvistetulla tasolla, 5, 20 ja 100 ng L−1, CAP: n keskimääräiset saantoarvot olivat 82, 7% – 99, 6%. Päivänsisäinen vaihtelu oli alle 9,8% ja päivänsisäinen vaihtelu 8,2% (tulokset on esitetty taulukossa 3).

4. Johtopäätökset

tässä tutkimuksessa kehitettiin uudenlainen ja erittäin herkkä cl-ELISA-menetelmä CAP-havaitsemiseksi kosmetiikassa. Määrityksessä käytetty mAb oli erittäin spesifinen CAP: lle ja sen analogeille mitättömät CR-arvot, erityisesti useimmille rakenteeseen liittyville TAP: lle ja FF: lle. Juuri tämän mAb-menetelmän perusteella ehdotettua CL-ELISA-menetelmää voitaisiin soveltaa erityisesti korkin ja muiden analogien seosten osoittamiseen. Tämä on CL-Elisan ensimmäinen raportti CAP: n määrittämiseksi kosmetiikassa. Menetelmän LOD oli 0, 0021 ng mL−1, IC50 oli 0, 016 ng mL−1 ja toteamisalue oli 0, 00979−0, 12026 ng mL−1. Terästetyissä kosmetiikkanäytteissä keskimääräiset saantoasteet vaihtelivat 82,7 prosentista 99,6 prosenttiin, ja päivänsisäinen vaihtelu oli vastaavasti alle 9,8 prosenttia ja päivänsisäinen vaihtelu 8,2 prosenttia. Määrityksen etuja ovat korkea spesifisyys, yksinkertaisuus, nopeat analyysiajat ja kustannustehokkuus. Herkkyytensä ja spesifisyytensä osalta kehitetty CL-ELISA-menetelmä on parempi kuin useimmat raportoidut immunomääritykset CAP: n toteamiseksi. Voidaan päätellä, että tätä kehitettyä CL-ELISA-menetelmää voitaisiin soveltaa CAP: n spesifiseen, nopeaan, semikvantitatiiviseen ja kvantitatiiviseen osoittamiseen kosmetiikassa.

tietojen saatavuus

tämän tutkimuksen tulosten tueksi käytetyt tiedot ovat pyynnöstä saatavissa vastaavalta tekijältä.

eturistiriidat

kirjoittajat ilmoittavat, ettei tämän paperin julkaisemiseen liity eturistiriitoja.

kiitokset

haluamme kiittää Letpubia (www.letpub.com) kielellisen avun antamiseen tämän käsikirjoituksen valmistelun aikana. Tätä työtä tukivat Kiinan kansallinen R&D key Programme of China (no. 2017yfe0110800), Kiinan kansallinen Luonnontieteellinen säätiö (no. 31871718) ja EU: n Horisontti 2020-tutkimus-ja innovaatiotoiminta (no. 727864-EU-China-Safe).