Laboratoriohuomautukset BIO 1003: lle

© 30 elokuu 1999, John H. Wahlert & Mary Jean Holland

entsyymit

proteiinit, jotka toimivat katalyytit

(klikkaa tästä: materiaalit, teemat, web-resurssit)

soluissa ei ole lämmön ja voimakkaan sekoittamisen mahdollisuuksia nopeuttaa kemiallisia reaktioita siten, että atomit ja molekyylit törmäävät toisiinsa useammin ja voimakkaammin. Sen sijaan ne valmistavat entsyymeiksi kutsuttuja proteiinikatalyyttejä, jotka tarjoavat pintoja, joilla reaktantit kohtaavat toisensa oikeassa suunnassa, ja entsyymit saattavat jopa heikentää katkeavia sidoksia. Entsyymeillä on suuri spesifisyys-vain tietyt reaktantit sopivat niiden pinnoille ja tasapainottavat paikallisen pinnan varauksia paikassa, jota kutsutaan aktiiviseksi paikaksi. Entsyymin erityistä reaktanttijoukkoa kutsutaan sen substraatiksi(substraateiksi). Entsyymit, kuten kaikki katalyytit, eivät muutu katalysoimallaan reaktiolla; Kun siis kaikki reaktantit on muutettu tuotteiksi, alkuperäiset entsyymimolekyylit jäävät jäljelle.

entsyymin toiminta riippuu ympäristöstä, jossa reaktio tapahtuu. Sellaiset tekijät kuin lämpötila ja pH voivat vaikuttaa suuresti entsyymin kykyyn tehdä työnsä. Seuraava koesarja havainnollistaa entsymaattisesti katalysoitujen reaktioiden periaatteita biologisissa järjestelmissä. Käytämme entsyymi katekolaasi (tai katekolioksidaasi), joka on yleinen kasveissa; se on läsnä tuorepuristettu peruna mehu, joka on toimitettu. Katekolaasin substraatteja ovat katekoli ja happi. Substraatit reagoivat keskenään entsyymin aktiivisen kohdan sisällä. Reaktiossa muodostuvia tuotteita ovat bentsokinoni ja vesi; koska bentsokinonin väri on ruskea, reaktion voi nähdä tapahtuneen. Tätä kutsutaan hedelmien ruskistumisreaktioksi. Bentsokinoni estää mikro-organismien kasvua ja estää vaurioituneita hedelmiä mätänemästä. Ehjissä soluissa katekolaasi varastoituu rakkuloihin eikä sillä ole yhteisvaikutuksia katekolin kanssa.

katakolaasientsyymin läsnä ollessa:

katekoli + ½O2 bentsokinoni + H2O

kaikissa alla olevissa kokeissa sekoitetaan aineet ohjeiden mukaisesti ja sekoitetaan seosta pyörrehengellä tai naputtamalla putken reunaa pohjan lähellä; inkuboidaan seoksia 40 asteessa, ellei toisin mainita.

Jos epäilit entsyymin puhtautta, miten voisit selvittää, onko perunauutteessa katekolaasin lisäksi jotain muuta?

I. Bentsokinonin muodostuminen ja osoittaminen

tässä kokeessa määritellään ulkonäkövaatimukset, kun reaktio on tapahtunut tai ei ole tapahtunut. Käytä tislattua vettä, jos H2O on merkitty.

Mix	Initial color	Color change (after 5 min)
10 drops potato extract with 10 drops 1% catechol (experiment)
10 drops potato extract with 10 drops H2O (control)
10 drops 1 % catechol with 10 drops H2O (kontrolli)

miten määrittelisit kontrollin ja kokeen käsitteet?

II. Entsyymispesifisyys

hydrokinoni on rakenteeltaan samanlainen kuin katekoli, mutta ei sama kuin katekoli. Kokeessa nähdään, voiko entsyymi myös muuntaa sen bentsokinoniksi, vai onko entsyymi yksinkertaisesti liian spesifinen rakenteeltaan ollakseen vuorovaikutuksessa samankaltaisen mutta ei identtisen molekyylin kanssa.

Mix	Initial color	Color change (after 5 min)
10 drops potato extract with 10 drops 1% catechol
10 drops potato extract with 10 drops hydroquinone
10 drops hydroquinone with 10 drops H2O (kontrolli)

Voiko enksyymi muuttaa hydrokinonia bentsokinoniksi? Miten päädyit tähän johtopäätökseen?

HUOM: ryhmäsi tekee joko III tai IV—ei molempia.
Kysy laboratorioopettajaltasi, tekeekö ryhmäsi III lämpötilan vai IV pH: n.

III.lämpötilan vaikutus Entsyymiaktiivisuuteen

entsyymit on suunniteltu toimimaan tietyllä lämpötila-alueella. Voit tehdä joitakin arvauksia lopputuloksesta seuraavien lämpötilojen alla. Muista, että entsyymiä tuottavat rakenteet ovat hedelmä ja peruna; Celsiusasteikolla 0 astetta on jäätävää, 22 astetta on huoneenlämpöistä ja 100 astetta kiehuvaa. Mitä kuumempi se on, sitä nopeammin molekyylit värähtelevät ja liikkuvat. Vesimolekyylien törmäykset entsyymiin voisivat kumota sen Taitetun rakenteen, jota vetysidokset pitävät paikallaan; tällöin molekyylin sanotaan denaturoituneen. Mitä aktiiviselle sivustolle tapahtuisi tässä tapauksessa? Matalissa lämpötiloissa molekyylit liikkuvat hyvin hitaasti, ja niiden törmäämisen ja reagoimisen todennäköisyys on hyvin pieni. Huomaa, että perunauute on pidetty jäissä. Miksi?

Kirjoita hypoteesi lämpötilan vaikutuksesta entsyymiaktiivisuuteen:

Aseta 6 paria koeputkia, joissa on 10 tippaa perunauutetta yhdessä sarjassa ja 10 tippaa 1% katekolia toisessa. Inkuboidaan niitä 5 minuuttia, yksi pari kussakin 5 lämpötila ympäristöissä alla. Sekoita sitten perunauute ja katekoli keskenään; Tallenna alkuperäinen väri ja laita putki takaisin säädeltyihin lämpötiloihin. Tallenna Väri uudelleen 5 minuutin kuluttua.

lämpötila	alkuväri	värinvaihto (5 min. after adding catechol)
0 degrees C
22 degrees C
40 degrees C
60 degrees C
80 astetta c
100 astetta c

tukevatko tulokset alkuperäistä hypoteesiasi?

mitkä lämpötilat denaturoivat entsyymin niin, ettei se voi palautua.

mikä on 100 asteessa muodostuva valkoinen sakka?

IV. pH: n vaikutus Entsyymiaktiivisuuteen

pH-asteikko mittaa liuoksessa olevien vetyionien (joilla kullakin on +1 varaus) määrää. Biologisissa systeemeissä asteikko kulkee 0: sta (vahvasti hapan) 14: ään (vahvasti emäksinen). 7, neutraalipiste, on puhtaan veden pH. Muista, että proteiinimolekyylien taitettu rakenne johtuu suurelta osin polypeptidiketjun vastakkaisesti varautuneiden osien välisestä vetysidoksesta. Muut ionit liuoksessa voisivat korvata ketjun vastaavat osat ja saada sen purkautumaan. Kun näin tapahtuu, mitä tapahtuu aktiiviselle sivustolle?

Kirjoita ylös hypoteesi pH-alueen vaikutuksesta entsyymiaktiivisuuteen:

asetetaan 7 koeputkea, joissa kussakin on 40 tippaa erilaista puskuroitua pH-liuosta. Lisää 10 tippaa perunauutetta jokaiseen ja sekoita. Lisää sitten 10 tippaa 1% katekolia jokaiseen ja sekoita.

pH	Initial color	Color change (5 min after adding catechol)
pH 2
pH 4
pH 6
pH 7
pH 8
pH 10
pH 12

Do the results support your hypothesis?

millä pH: lla tai pH-arvojen vaihteluvälillä entsyymi toimii parhaiten?

miksi sitruunamehun laittaminen juuri viipaloituihin hedelmiin hidastaa sen ruskistumista?

V. Kofaktorien välttämättömyys Entsyymiaktiivisuudelle

monet entsyymit toimivat vain, jos niihin liittyy kofaktori. Katekolaasi vaatii kofaktoriksi kuparia. PTU on kemikaali, jolla on suurempi affiniteetti kupariin kuin katekolaasilla, ja se vie kuparin pois entsyymistä. Voit tarkkailla, mitä tapahtuu entsyymin toiminnalle, kun sen kofaktori poistetaan. We refer to cofactors that our bodies need as vitamins and minerals.

Mix	Initial color	Color change (5 min after adding catechol)
Tube A 10 drops potato extract 5 crystals PTU and mix. After 5 minutes add 10 drops 1% catechol.
Tube B 10 drops potato extract. 5 minuutin kuluttua lisätään 10 tippaa 1% katekolia.

mikä putki, A vai B, on kontrolli tässä kokeessa?