Tämä on ensimmäinen kolmiosaisessa sarjassa, joka käsittelee E. colin transformaatiota. Loppuun mennessä sinun pitäisi olla asiantuntija E. coli transformaatio ja mitä kantoja valita eri sovelluksiin. Jos olet jo asiantuntija, toivon, että se on nautittavaa virkistystä sinulle. Kummassakin tapauksessa, kommentoi alla, jos sinulla on jotain lisättävää.

sähkön avulla muuntamiseen

vieras DNA voidaan syöttää toimivaltaiseen E. coli-bakteeriin elektroporaatiolla tai kemiallisella muuntamisella. Elektroporaatiota käytettäessä soluun levitetään sähkövirta. Virran arvellaan luovan solukalvoihin hetkellisiä ”huokosia”, jotka pakottavat negatiivisesti varautuneen DNA: n soluihin elektroforeesityyppisellä vaikutuksella. Jotta Elektro-Pätevä E. coli, pese solut huolellisesti poistaa kaikki keskipitkän suolat. Näin varmistetaan, että lataus ei tapahdu väliaineen kautta. Suorita myös elektroporaatio 0°C: ssa solujen lämpövaurioiden minimoimiseksi.

Kemikaalit: ne toimivat myös

kemiallisesti pätevien solujen valmistamiseen, E. coli-bakteerin sekoittamiseen CaCl2-liuoksessa 0°C: ssa. Näissä olosuhteissa Ca2+ – ionin ajatellaan luovan kalvoon huokosia, auttavan DNA: n sitoutumisessa solukalvoon ja peittävän DNA: n negatiivisen varauksen. Yhdessä nämä helpottavat DNA: n kulkua hydrofobisen solukalvon läpi. Pakota DNA soluihin lyhyellä 42°C lämpöshokilla, josta syntyy lämpövirta, joka pyyhkäisee DNA: n soluihin.

kunkin

elektroporaation hyvät ja huonot puolet ovat vähemmän vaivalloisia kuin kemiallinen transformaatio ja antavat yleensä suuremmat muunnostehokkuudet (mitattuna DNA: n mikrogrammaa kohti muodostuneissa pesäkkeissä). Se on kuitenkin kalliimpaa. Se vaatii erikoistuneen laitteen antamaan varauksen ja kupetit siirtämään varauksen kennosuspensioon. Elektroporaatio on herkkä suolalle-voit menettää arvokkaita näytteitä, jos ylimääräinen suola siirretään cuvetteen.

henkilökohtaisesti suosin kemiallista muuntumista. Vaikka se kestää noin puoli tuntia kauemmin, tulokset ovat mielestäni ennustettavampia ja pidän siitä, että DNA: ta voidaan lisätä enemmän, jos pitoisuus on liian alhainen. DNA: n määrää ei voi lisätä elektroporaatiolla, koska liuokseen voi lisätä liikaa suolaa. Vaikka yleisesti mainittu haittapuoli kemiallisessa muuntamisessa on sen alhaisempi tehokkuus, voit nyt ostaa erittäin päteviä soluja, kuten Stratagenen XL10-kultaa, joten tämä ei ole enää niin suuri ongelma.

tämän sarjan Artikkelit:

• E. coli Electroporation vs Chemical Transformation (tämä artikkeli)
• Competent E. coli: To Buy or Not to Buy?
• valitsee pätevän E. coli-kannan

alun perin julkaistu 18.syyskuuta 2007. Korjattu ja päivitetty 11. heinäkuuta 2016.