tulokset ja keskustelu

Hansit ovat peräisin pään Orvaskedestä ja vaativat lb-geenin toimintaa. Aiemmat tutkimukset (5, 11, 17, 19) ovat kuvailleet lb-geenien roolia solujen fate specification-prosesseissa. Vuonna Drosophila, voitto ja menetys funktio kokeet ovat osoittaneet, että lb geenit määrittää identiteetin osajoukko sydämen ja lihasten soluja ja että tämä toiminto johtuu erittäin rajoitettu, lineage-spesifinen mesodermal ilmentymä lb. Lisäksi lbe: n tarkka analyysi (Kuva. 1) ja lbl (tietoja ei näy) ilmentymäkuvio puhkeamista sydämen fuusio paljasti kolmion klusterin lb-positiivisia soluja sijaitsee vain anteriorly kärki sydämen (kuva. 1 A, nuolenkärki). Tuottaaksemme tarkemman kuvauksen näiden solujen sijainnista suhteessa sydämeen liittyviin imusolmukkeisiin ja rengasrauhasiin, me merkitsemme alkiot lb: lle ja tietyille rauhasmerkkiaineille (Kuva. 1 B ja C). Lymfarauhasen esiasteet paljastuivat Anti-Serpent-vasta-aineen kyljessä sydämen kärjen molemmin puolin (Kuva. 1B) mutta eivät ole päällekkäisiä alueen merkitty lb. Samoin L(2)1857 enhancer trap siiman kaksinkertainen värjäytyminen, joka erityisesti ilmaisee LacZ: ia rengasrauhasen alkioalkiossa (15), osoittaa, että lb-positiiviset solut sijaitsevat välittömästi rengasrauhasen edessä (Kuva. 1C).

selvittääksemme sydämeen liittyvien lb-positiivisten solujen alkuperän seurasimme alkioiden etuosan lb-ilmentymää varhaisvaiheesta lähtien. Sydänfuusiota edeltävillä alkioasteilla emme pystyneet havaitsemaan lb-ilmentymää, joka liittyy kahden sydämen primordian etuosaan. Tämä havainto viittasi siihen, että lb-positiivisia soluja ei ole alun perin määritelty sydämen alueella, ja ne voivat edustaa eri alkuperää olevia soluja, jotka liittyvät sydänsoluihin myöhemmissä vaiheissa. Itse asiassa myöhäisessä vaiheessa 11 ryhmä lb-positiivisia soluja dorsaalisen pään epidermiksessä (Kuva. 2A) voidaan havaita. Nämä solut alkavat tunkeutua hieman myöhemmin ja muodostavat Taitetun orvaskeden johtavan osan (kuva. 2b). Tämän loukkauksen sijainti ja ajoitus muistuttavat pään orvaskeden taittumista, jolloin syntyy selkäpussin takaosa, jota kutsutaan otsapussiksi (20). Tarkistaaksemme, vastaavatko lb: tä ilmentävät solut otsapussin kärkeä, käytimme etanan-LacZ-linjaa N516, joka ilmaisee lacZ: n dorsaalipussin muodostavissa soluissa (20). Kaksoisvärjäykset vaiheessa 14 (Kuva. 2B)ja vaihe 16 (Kuva. 2C) N516 alkiot, joissa käytetään anti-LBE-ja anti-β-galaktosidaasi-vasta-aineita, osoittavat selvästi, että lb ja esg ovat koekspressoituneita hyökkäävän otsapussin kärjessä. Alkionpään alueen selkänäkymä (Kuva. 2D) vahvistaa, että näillä soluilla on sama kolmiomainen järjestely kuin aiemmin esitetyillä sydämeen liittyvillä lb-positiivisilla soluilla (vertaa viikunoita. 2D ja 1).

yhdessä nämä tiedot osoittavat, että välittömästi sydämen edessä sijaitsevat lb: tä ilmentävät solut ovat peräisin pään orvaskedestä ja siirtyvät kohti sydämen kärkeä otsapussin invagoinnin aikana. Tämä havainto herättää lisäkysymyksen lb-geenien roolista tämän soluryhmän määrittelyssä. Olemme aiemmin osoittaneet, että lb-geeneillä on tärkeä rooli sydämen ja lihasten esiasteiden alaryhmän (11, 19) määrittelyssä. Funktionaalianalyysi hiiren lb ortolog Lbx1 geeni (21, 22) on myös paljastanut sen vaikutukset valvonnassa spesifikaation ja suunnattu muuttoliike appendicular lihasten esiasteita. Lisäksi tuoreimmat tiedot osoittavat, että hiirillä Lbx1 määrittää sydämen normaalin kehityksen edellyttämän sydämen hermoharjusolujen alapopulaation (23).

testataksemme, tarvitaanko Drosophila lb: tä sydämeen liittyvien solujen spesifikaatioon, olemme analysoineet dorsaalipussin muodostumista alkioissa, joilla on puutteita molemmissa lb-geeneissä (KS.materiaalit ja menetelmät). Käyttämällä ESG-RNA-luotainta merkkiaineena osoitimme, että lbdef-alkioissa ESG-ilmentymä sydämen liittyneitä soluja kantavassa otsapussin distaalisessa osassa puuttuu (vertaa Kuva. 2 E ja G F: llä ja H: lla). Lisäksi, kuten dorsolateraaliset näkemykset vaiheen 14 alkioita (Kuva. 2 G ja H), keltuaispussin ja distaalisimpien esg-positiivisten solujen välinen etäisyys suurenee merkittävästi lb-puutteellisilla alkioilla. Tämä havainto, jota tukee nomarskin optiikkahavainto, joka paljasti, että otsapussin takaosan morfologia on muuttunut (tietoja ei näy), osoitti, että Hanceja ei ole määritelty tai ne eivät siirry kunnolla lbdef-alkioissa. Koska analysoitu puutos kattaa myös viereiset bap-ja C15-geenit, testasimme frontaalipussin muodostumista bap-mutanttien alkioilla ja Arm-GAL4>UAS-RNAiC15-alkioilla. Sekä bap208-että rnaic15-alkioilla esg-värjätty otsapussi oli normaalin muotoinen (tietoja ei näy), jolloin BAP-ja C15-geenien vaikutus sydämeen liittyvien solujen erilaistumiseen tai migraatioon jäi pois. Nämä tiedot viittaavat vahvasti siihen, että lbdef-alkioiden distaalisten esg-positiivisten frontal sac-solujen epänormaali kuvio johtuu lb-toiminnan häviämisestä.

sydämen Ulosvirtausalueen kuviointiin osallistuvat Mesodermaaliset ja ei-Mesodermaaliset komponentit. Immunostisoivat kokeemme osoittivat, että sydämen ankkuroivat lb-positiiviset solut ovat hyvin lähellä lb-ilmentäviä kardioblasteja (Kuva. 1). Koska kaikkein anteriorisimmat kardioblastit ilmaisevat tinaa (5), merkitsemme alkiot kaksinkertaisesti Anti-Tin-ja anti-Lbe-vasta-aineilla havainnollistaaksemme sydämen kärjen ja otsapussin distaalisimman osan sijainnit. Yllättäen nämä kaksi rakennetta limittyvät noin kolmen solun pituudelta, kun havaitaan selkäpuolelta (Kuva. 3 A). Lisäksi sivusuunnassa confocal näkymä anterior sydän alueella (Kuva. 3B) osoittaa selvästi, että otsapussin kärki, joka koostuu nonmesodermal lb-ilmentävistä soluista, on suoraan kiinni sydämessä. Tarkemmin, havaitsimme, että aortan etuosa (osittain päällekkäiset sydämeen liittyvät lb-solut) taipuu ventraalisesti muodostaen morfologisesti erillisen alueen, joka vastaa sydämen ulosvirtausaluetta. Tämä morfologia viittaa siihen, että sydämen ventraalista taivutusta suosiva ylimääräinen solukomponentti saattaa olla olemassa. Päätimme etsiä aortan kärkeen kiinnitetyn vatsapuolella sijaitsevan lihaksen läsnäoloa. Sivusuunnassa näkymä alkion, kaksinkertainen värjätty myosiinin raskas ketju (Myo) ja Lbe (Kuva. 3C), osoittaa selvästi, että sydämen ulosvirtaus on todellakin kiinni pään lihaksessa, jota ehdotamme kutsuttavan COM: ksi. Tarkempi analyysi confocal osien paljasti, että sydämen primordium on, itse asiassa, liittyy kaksi tiiviisti makaa COMs, jotka ulottuvat ruokatorvesta ja liittää molemmin puolin sydämen ulosvirtaus alue (avoin nuolenkärjet Kuvassa. 3D). Yllättävää kyllä, näitä alkion pään lihaksia ei ole aiemmin kuvattu tietääksemme. COMs: n julkaiseman dokumentaation puute johtunee siitä, että Drosophila-alkion somaattisten pään lihasten morfologiaa ja alkuperää ei ole systemaattisesti analysoitu. Millerin (24) tekemän ainoan saatavilla olevan kuvauksen avulla emme pystyneet tunnistamaan aikuisen pään lihaksia, jotka voisivat vastata tässä esitettyjä alkionalkion viestimiä.

mielenkiintoista on, että Myo / Lbe-kaksoisvärjäys paljasti myös, että nonmesodermaaliset Hansit ovat kiinnittyneet molempiin sydänsoluihin (Kuva. 3E) ja COMs (Kuva. 3D). Koska HANCs ilmaista lb ja liittää valikoivasti kaikkein anterior lb-positiivinen pari sydämen soluja (viikunat. 3E ja 4 D-F), spekuloimme, että tämän kontaktin syntyyn voi liittyä homofiilisiä soluvuorovaikutuksia. Homotyyppisten solujen (25, 26) väliseen solujenväliseen signalointiin osallistuvien solujen adheesiomolekyylien testaaminen auttaa määrittelemään mekanismeja, joilla luodaan yhteys lb-ilmentävien Hancien ja sydänsolujen välille.

havainnollistaaksemme aortan kärjen, COMs: n ja lb: tä ilmentävien hankkien tilajärjestelyä käytimme tietokoneavusteista 3D-analyysiä ja konfokaaliskannausten rekonstruktiota. Tämä lähestymistapa vahvisti täysin havaintomme, jotka paljastavat, että hancsin lisäksi sydämen ulosvirtausalue on tiukasti kiinni COMs-parissa (Kuva. 3 F). Nämä lihakset limittävät sydämen kärjen molemmilta puolilta ja edistävät sen ventraalista taivutusta.

ymmärtääksemme, miten sydämen, COMs: n ja Hancsin välinen yhteys syntyy kehityksen aikana, seurasimme näitä rakenteita varhaisessa ja myöhäisessä vaiheessa 14 alkiota (Kuva. 3 G ja H). Tietomme osoittavat, että sekä lb-positiiviset sydänsolut että lb-ilmentävät Hansit houkuttelevat jatkuvia com-yhdisteitä.

coms: n ja Hancsin välinen kontakti näyttää hieman edeltävän COM: n kiinnittymistä aortan kärkeen ja näkyy vaiheen 14 alussa (Kuva. 3G). Tuolloin Comin fillopodia ulottuu lb-positiivisten sydänsolujen suuntaan (kuva. 3G)ja kiinnittyvät lopullisesti näihin soluihin myöhäisessä vaiheessa 14 sydämen fuusion alkaessa (Kuva. 3T). Koska COMs joutuvat kosketuksiin sydänsolujen ja HANCs ennen HANCs kiintyä sydämeen, me spekuloimme, että COMs, lisäksi taivutus kärki sydämen, helpottaa sen yhteyttä HANCs. Somaattisten lihasten ja niiden orvaskeden kiinnityskohtien (jännesolujen) välisen kontaktin muodostumista on tutkittu laajasti (27), mikä paljastaa sinkkisormen transkriptiotekijäjuovan (28) ja RNA: ta sitovan proteiinin How (29) avainroolin. Olemme käyttäneet näitä molempia merkkiaineita testataksemme, ovatko ne Hansit ja sydänsolut, joihin viestimet liittävät jännemäisten solujen näyttöominaisuuksia. KAKSOISMERKINNÄT, jotka tehtiin WT-alkioille anti-Lbe/anti-Stripe-ja how-lacZ-alkioille anti-Lbe/anti-LacZ-vasta-aineilla, osoittivat, että HANCs ja COM-kontaktoivat sydänsolut eivät ilmaise jännesolumarkkereita (tietoja ei näytetä). Tämä havainto osoittaa, että lb-positiiviset solut houkuttelevat Kom-yhdisteitä käyttämällä mekanismia, joka poikkeaa jännesolujen käyttämästä mekanismista. Kiinnostavimmat ehdokkaat COMs: n ohjaamiseksi ovat eritetty proteiinirako, jolla on useita proteiineja sitovat motiivit, ja sen reseptorit Robo ja Robo2 (30). Viilto ja Robo ilmaantuivat äskettäin keskeisinä komponentteina, jotka ohjaavat vetovoimaa ja repulsioprosesseja somaattisten lihasten morfogeneesin aikana (31), mikä viittaa siihen, että ne saattavat liittyä myös COM-vetovoimaan.

kaikkein Anteriorisimmilla lb: tä Ilmentävillä Sydänsoluilla on keskeinen rooli sydämen Ulosvirtausalueen kuvioinnissa. Havainto, että sekä COMs että HANCs päättivät kiinnittyä kaikkein anteriorisimpiin lb-positiivisiin sydänsoluihin, sai meidät testaamaan, voisiko lb: n ilmentymisen purkaminen sydämessä vaikuttaa sydämen ulosvirtausalueen kuviointiin. Tätä testiä varten käytimme Gal4 / UAS-kohdennettua ilmaisujärjestelmää (16). Käytettiin kahta eri GAL4-efektorilinjaa, 24B-GAL4 ja Tin-GAL4 (Kuva. 4 A ja C). 24B-GAL4-linja mahdollistaa kohdennetun ilmaisun kaikissa sydän-ja lihassoluissa (Kuva. 4A), joilla on yhtenäinen ja korkea ilmaisutaso kaikkein anteriorisissa sydänsoluissa (nuoli Kuvassa. 4 A). Tin-GAL4-linja (ystävällisesti R. Bodmer) indusoi UAS-transgeeni-ilmentymän selektiivisesti neljässä kardioblastissa kussakin hemisegmentissä (näihin kuuluvat lb-positiiviset solut), mutta induktion taso kaikkein anteriorisissa sydänsoluissa on pienempi (nuoli Kuvassa. 4C)kuin linjan 24B-GAL4. Sydämen lb-ilmaisun laajentamiseksi molemmat GAL4-efektorilinjat on ylitetty UAS-lbe-linjalla. Tin-GAL4-linjan ohjaama ektooppinen lb-sydämen ilmentymä oli heikompi kuin endogeeninen lb-ilmentymä sydämessä, eikä sydämen ulosvirtausalueen kuvioinnissa ole havaittu selviä toiminnan vahvistumisen aiheuttamia muutoksia (tietoja ei ole esitetty). Sen sijaan 24B-GAL4>UAS-lbe: n alkioissa näkyi lb: n ilmentymisen huomattava laajeneminen sydämessä (Kuva. 4G), mikä johtaa epänormaaliin kosketukseen sydämen kärjessä. Tarkemmin, huomasimme, että COMs liittää suoraan kaikkein anterior sydän soluja, jotka muodostavat sydämen ulosvirtaus (asteriski Kuvassa. 4G)eikä toiseen sydänsolujen pariin kuten WT: ssä (kuva. 4D). COMs: n muuttunut yhteys johtuu todennäköisesti kohdunulkoisista puoleensavetävistä signaaleista, jotka syntyvät lb: n laajentuneesta sydänekspressiosta. Tämän seurauksena sydämen etummaisen osan ventraalinen taivutus oli voimakkaampaa(vrt. 4 D ja G). Olemme myös huomanneet muuttuneen morfologian COMs (avoin nuolenkärki Kuvassa. 4 D ja G), joka saattaa johtua lb: n 24B-GAL4-vetoisesta kohdunulkoisesta lihasilmaisusta. Kokeelliset misekspressiolosuhteet eivät vaikuttaneet Hancsin ja sydänsolujen väliseen kosketukseen. Testataksemme, tarvitaanko sydämen lb-lauseketta COMs: n houkuttelemiseen, hyödynsimme aiemmin kuvattua kielteistä säätelyvaikutusta parillisella ohituksella (eve), joka pystyy erityisesti tukahduttamaan lb: n sydänsoluissa (5). Jälleen, 24b-GAL4 ja Tin-GAL4 efektori linjat käytettiin ajaa eve ilmaisun sydämessä. Havaitsimme, että molemmat näistä kuljettajista ylittivät UAS-eve-linjan (Tin-GAL4, jolla on alempi penetranssi) johtavat lb-toiminnan tukahduttamiseen sydämessä (Kuva. 4 H ja I). Huolimatta virheellisiä vikoja, sydämen primordia muodostuu normaalisti UAS-eve voitto toiminnan alkioita (ref. 5 ja kuva. 4B), jonka avulla voimme seurata COMs ja HANCs yhteydessä, jossa sydämen ilmentymä lb on tyhjentynyt. Tietomme osoittavat, että tällaisissa lb-köyhdytetyissä alkioissa (katso sydämen lb-ilmentymän puuttuminen Kuvassa. 4 H ja I) Comit eivät kiinnity sydämen kärkeen. Huomasimme, että Koms ulottui anteriorly ja kiinnitetty invagining HANCs (Kuva. 4 H ja I), jotka eivät enää pysty ankkuroimaan kunnolla sydämen kärkeä. PÄÄKOMM-haara, joka normaalisti kiinnittyy sydämen ulosvirtausalueeseen (vertaa Kuva. 4 E ja F h: n ja I: n kanssa) oli puuttunut tai sulautunut HANC-kiinnittävään oksaan. Näin ollen uskomme, että epänormaali muoto COM ja täydellinen menetys sen kosketus kärki sydämen johtuvat sydämen lb ehtyminen. Tätä oletusta tukee se, että samoja fenotyyppejä havaittiin alkioilla, joilla oli ektooppinen sydän (Tin-GAL4-vetoinen) ja sydän sekä lihaksikas (24B-GAL4-vetoinen) ilmentymä eve (vertaa Kuva. 4 H ja I). COMs: n muuttunut kontakti ja sijainti ilmaantuivat myöhäisessä vaiheessa 14 alkiossa, kun myosiinin raskasta ketjua ei ole vielä havaittavissa kardioblasteissa (Kuva. 4 E ja H). Vaiheen 15 alkioiden analyysi paljasti lisäksi, että sydämen lb-ilmentymän häviämiseen liittyy β3-tubuliinin alasäätely (vertaa Kuva. 4 F ja I) sydämen ulosvirtausalueella, mikä osoittaa, että lb: n ilmentymisellä sydämessä on tärkeä vaikutus sydämen lopulliseen morfogeneesiin. Nämä tiedot täydentävät viimeaikaisia raportteja, joissa kuvataan COUP-TF-reseptoriperheen jäsenen, Seven–Upin, morfogeneettisiä rooleja, jotka on ilmaistu posteriorisessa kardioblastiparissa kussakin segmentissä ja joita tarvitaan Ostian muodostumiseen vatsan segmenteissä A5-A7 (32, 33). Tässä yhteydessä lb: n roolin osoittaminen sydämen ulosvirtausalueen kuvioinnissa lisää mahdollisuutta, että vatsan segmenteillä lb: llä on samanlainen rooli sydänsolujen ja sydäntä ankkuroivien alarihasten välisen kontaktin muodostamisessa. Tämä hypoteesi on vielä tutkimatta.

lisäksi esitetyt fenotyypit (Kuva. 4) viittaavat siihen, että sydämen kokeellisesti köyhdytetty lb-ilmentymä vaikuttaa sydänsolujen houkuttelevien signaalien emissioon tai vastaanottoon ja johtaa näin ollen yhteydenpidon häiriöihin COMs: ien kanssa. Lb-positiivinen HANCs tuottaa tai vastaanottaa todennäköisesti samaa tai samankaltaista lihashoukutinta, mikä viittaa siihen, että lb säätelee solujen ja solujen väliseen kontaktiin osallistuvien geenien ilmentymistä. Mielenkiintoista on, että hiiren lb-homologuessa Lbx1-geenin havaittiin olevan tarpeen lihasten esiasteiden (21, 22) osajoukon suunnattuun migraatioon, mikä osoittaa, että lb-geenien ohjaamia säilyneitä soluliikemekanismeja saattaa olla olemassa.

analysoimalla alkioita, joissa sydämen lb-ilmentymä on laajentunut tai kokeellisesti heikentynyt, olemme yhdessä osoittaneet, että lb-arvoa tarvitaan HANCs: n ja COMs: n oikeaan kiinnittämiseen ja siten sydämen ulosvirtausalueen asianmukaiseen kuviointiin. Tämä havainto tarjoaa oivalluksia toiminnallisesta merkityksestä sydämen esiasteiden anterior–posterioriselle monipuolistamiselle kussakin Drosophila-sydämen segmentissä.

Voiko HANCs edustaa Drosophila-prototyyppiä Neural Crest-soluista? Selkärankaisten sydämen morfogeneesiin kuuluu kaksi eri solutyyppiä, mesodermaalinen sydämen primordia ja pään alueelta vaeltavien hermoharjusolujen alapopulaatio. Tässä artikkelissa olemme osoittaneet, että drosophilassa ryhmä Ei-steroidaalisia soluja, jotka ovat peräisin pään orvaskedestä (jonka olemme nimenneet hanksiksi), edistää sydämen lopullista morfogeneesiä. Kuten selkärankaisilla neuraaliharjasoluilla, Hancit käyvät läpi suunnattuja liikkeitä, joutuvat kosketuksiin sydänsolujen kanssa ja osallistuvat sydämen ulosvirtausalueen kuviointiin. Olemme osoittaneet, että homeobox-geenit lb, joiden tiedetään osallistuvan sydämen esiasteiden monipuolistamiseen (5, 11), ilmaistaan Hanceina ja vaaditaan niiden määrittelyä varten. Samoin lb: n ortologista, lbx1-geeniä, havaittiin äskettäin vaadittavan sydämen hermoharjusolujen osajoukon määrittelyssä hiiressä (23), mikä osoittaa, että lb/Lbx1-geeneillä on säilyvä rooli sydämen ei-metodermaalisten komponenttien määrittelyssä. Tämän näkemyksen mukaan Hanceja voitaisiin todellakin verrata selkärankaisten hermoharjusoluihin. Datamme osoittavat kuitenkin myös, että Hanceissa on ainakin kaksi piirrettä, jotka ovat ominaisia vain Drosophilalle: (i) ne liikkuvat Taitetun pään ektodermin osana eivätkä delaminoituneina neuraaliharjasoluina; ja (ii) ne muodostavat toiminnallisen kompleksin COMs: ien kanssa, joilla ei ole homologisia rakenteita selkärankaisilla. Siksi tarvitaan lisäanalyysejä, jotta saadaan selville Hancien tarkka rooli ja niiden mahdolliset neuraalisen crest-solun kaltaiset toiminnot.