Paul Barberin toimittama
DNA Extraction via Chelex
Chelex on tunnettu siitä, että se on yhtä ailahteleva kuin halpa ja helppo. Tässä muutamia vinkkejä hyviin vahvistuksiin: 1. Joskus näytteet toimivat parhaiten, jos niitä käytetään heti, joskus on parempi odottaa yön yli ennen niiden käyttöä. Kokeilkaa ja etsikää, mikä toimii lajillenne. Tulokset voivat vaihdella taksoittain.2. Kun teet alustavia PCR-standardeja, tee mallin sarjalaimennus.PCR:ssä käytettävän Chelex-DNA-uutteen määrä voi olla jopa puolet PCR: n tilavuudesta tai 1: 10 000 laimennoksen 1 mikrolitra. Mielestäni 1 microliter of a 1: 1 on hyvä useimmissa sovelluksissa.3. Jos et saa vahvistuksia PCR: stä ensimmäistä kertaa Chelex-uutteella, toista vortex, spin, inkuboi, vortex, spin, sit overnight-menettely edellä kuvatulla tavalla. Usein tämä saa negatiivisen PCR: n toimimaan.
metodi¶
- valkaisuaineella steriloidaan kuiva reagenssilastalla ja pienellä magneettisekoittimella.
- valmistetaan 5-10 painoprosenttia Chelex100-hartsista (Bioradiosa 143- 3832,100-200 mesh Chelex, natrium muodossa) ja UV steriloitu HPLC vettä. Tehokkain tapa tehdä tämä on ottaa 50 ml: n steriili falcon-putki, asettaa asteikko pienen dekantterilasiin ja nollata asteikko. Lisää sitten 5 grammaa Chelexia ja täytä 50ml-merkkiin vedellä.
tarkkuus ei ole kriittistä. Steriili tekniikka on.
- aseta steriili sauvasekoitin putkeen ja aseta magneettisekoitin päälle. Chelex laskeutuu nopeasti, joten jos liete ei ole hyvin sekoitettu, pitoisuudet ja tulokset vaihtelevat. Pidetään liete hyvin sekoitettuna, määräosa 300-500micro litraa 0,6 tai 1,6 ml: n Eppendorf-putkiin (jälleen, steriili) ja korkki välittömästi. Jos sinulla on pääsy laminar flow huppu, se on hyvä paikka tehdä kaikki tämä. Voit pyyhkiä asteikon ja sekoittimen 10% valkaisuaineliuoksella ja / tai UV-steriloinnilla ennen käyttöä.
- kytke lämmityslohko päälle. Aseta 95°C: seen. täytä reiät vedellä.
- käyttämällä steriilejä pihtejä (liekki alkoholipolttimen päällä useita kertoja steriloimiseksi), poista pieni pala kudosta näytteestäsi. Tämän kudospalan pitäisi olla tarpeeksi suuri, jotta se olisi näkyvissä, mutta ei niin suuri, että se olisi helposti nähtävissä. Kuvittele, että leikkaat 0,2 mm: n pätkän tavallisesta niitistä. Tämä on iso juttu. Liika kudos voi estää reaktioitasi.
steriloi pihdit näytteiden välillä.
- kun olet valmis, tee negatiivinen Chelex-kontrolli upottamalla steriloidut pihdit Chelex-lieteputkeen.
- Vortex-näyte ja chelex-liete 10-15 sekunnin ajan.
varmista, että kannet napsahtavat tiukasti kiinni ennen kuin aloitat.
- Spin-näytteet lyhyesti suurella nopeudella mikrosentrifugissa
- inkuboidaan näytteitä 20 minuuttia 95°C: ssa
*lohkon lämpötila voi laskea hieman tätä vaihetta tehtäessä. Pudotus on normaali. Tarkista putket hautoessasi varmistaaksesi, että kannet eivät ole irronneet.*
- Vortex samples again for 10-15 seconds.
Becareful as steam may poksauttaa kannen sentrifugiputkesta. Pidä kannet alhaalla.
- pyöräyttää putkia jälleen suurella nopeudella mikrosentrifugissa.
- näytteet ovat käyttövalmiita.
käytetään vain SUPERNAATTIA PCR-reaktioissa. Kleksi helmi inaktivoi Taq!
tämä menetelmä perustuu luvallisesti täällä saatavilla olevaan alkuperäiseen protokollaan.
