Introduction

eri organismien, myös nisäkkäiden, täydelliset genomisekvenssit ovat äskettäin tulleet saataville DNA-sekvensointiteknologian nopean kehityksen seurauksena. Erityisesti nisäkkäillä transkriptien analysoinnilla on kuitenkin edelleen keskeinen rooli perimän ja proteomin välisen kuilun kuromisessa umpeen. Tämä johtuu pääasiassa siitä, että tällä hetkellä emme pysty tarkasti ennustamaan tietystä geenistä johdettujen transkriptien rakenteita pelkän genomitiedon perusteella. Niinpä transkriptien analysointimenetelmänä cDNA-kirjastojen rakentaminen on ratkaisevaa myös genomin jälkisekvenssiaikana. Vaikka PCR: llä tapahtuva kiinnostavien geenien cDNA-kloonaus on tarjonnut yksinkertaistetun vaihtoehtoisen reitin transkriptiorakenteiden analysointiin ilman cDNA-kirjastorakennetta, cDNA-kirjaston rakentaminen on valinta silloin, kun analysoidaan suuri määrä cDNA: ta yhdestä mRNA-lähteestä. Tähän mennessä on nähty paljon vaivaa korkealaatuisten cDNA-kirjastojen (1-4) valmistusmenetelmän kehittämiseksi. Sitä vastoin kysymystä korkealaatuisen cDNA-kirjaston valmistamisesta pienestä RNA-altaasta ei ole käsitelty niin aktiivisesti. Tästä on kuitenkin tullut erittäin tärkeä tavoite, koska tutkijat ovat usein kiinnostuneita hypoteettisista geeneistä, joiden ennustetaan ilmenevän vain tietyntyyppisissä soluissa tai kudoksissa tietyissä olosuhteissa, kuten patologisissa näytteissä.

on esitetty useita raportteja, joissa on kuvattu pienten määrien lähde-RNA: ta monistetun cDNA: n tai cRNA: n tuottamiseen, mistä voidaan laatia mikroarray-analyysin kohteet (5-15). Heidän lopullisena tavoitteenaan on saada täyspitkä, ei-populaatio-puolueellinen RNA, joka edustaa suuresti alkuperäistä mRNA: ta. Tätä varten näissä menetelmissä käytetään yleensä PCR-tai in vitro-transkriptiota T7-RNA-polymeraasilla alkuperäisen mRNA: n monistamiseksi cDNA: n tai cRNA: n muodossa. Vaikka ekspressioprofiilien vertailu on yksi tehokkaimmista tavoista tutkia solujen tai kudosten fysiologisten tilojen eroja, transkriptien rakenteellista luonnehdintaa (esim.vaihtoehtoisten liitoskuvioiden tunnistaminen, transkription aloituspaikka ja transkription lopetuspaikka) ei voida tehdä tällaisella mikroarray-analyysillä. Jokaisen transkription sekvenssianalyysi on näissä tapauksissa väistämätön.

kehitimme menetelmän, jonka avulla pieni määrä lähtö-RNA: ta voidaan käyttää geenien kloonaukseen ja kattavaan sekvensointianalyysiin soveltuvan cDNA-kirjaston rakentamiseen. Menetelmä tagit 3 ’ja 5’ päät ensimmäisen kierroksen cDNAs T7 ja SP6 phage promoottori sekvenssit, vastaavasti, minimoida koko bias vaikutuksia vahvistuksen aikana. Kahden kierroksen Crna-vahvistuksen jälkeen muutimme vahvistetut crnat cdnoiksi, kloonasimme nämä tuotteet plasmidiksi ja sitten arvioimme tuloksena olevan cDNA-kirjaston verrattuna tavanomaisella menetelmällä rakennettuun kirjastoon (4,16,17).

materiaalit ja menetelmät

cRNA-monistus

tässä tutkimuksessa käytettyjen oligonukleotidien sekvenssit on esitetty taulukossa 1. Protokollan laatimiseksi käytimme mallina 1 µg Total RNA: ta, joka oli valmistettu ICR-hiiren aivoista (8 viikon ikäiset uroshiiret). Seosta(10 µL), jossa oli 1 µg kokonais-RNA: ta ja 100 pmol T7-Not-(dT)18 primeria inkuboitiin 70°C: ssa 10 minuutin ajan, minkä jälkeen se snapjäähdytettiin jäällä. Kaksoissäikeinen cDNA-synteesi ja adapterin ligaatio suoritettiin SUPERSCRIPT® Plasmidijärjestelmän (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) (4,16,17) protokollien mukaisesti pienin muutoksin. Lyhyesti, ensimmäisen juosteen cDNA-synteesiä varten denaturoituun RNA/T7-Not-(DT) 18 primer mixureen lisättiin 4 µL 5× ensimmäisen juosteen puskuria (Invitrogen), 1 µL 0, 1 M ditiotreitolia (DTT), 1 µL 10 mM dntps, 1 µL (40 U) Rnaseout™ (Invitrogen)ja 1 µL vettä, ja sitä inkuboitiin 37°C: ssa 3 minuutin ajan hehkutettaviin alukkeisiin. Tämän jälkeen reaktioseokseen lisättiin 2 µL (400 U) SUPERSCRIPT III RNaasi H-käänteiskopioijaentsyymiä (Invitrogeeni) ja lämpötila säädettiin 50°C: seen, jotta voitiin aloittaa ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi. 1 tunnin kuluttua suoritettiin toisen juosteen cDNA-synteesi gublerin ja Hoffmanin aiemmin kuvaamalla tavalla (18); ensimmäisen juosteen cDNA-seokseen lisättiin 91 µL vettä, 30 µL 5× toisen juosteen puskuria (Invitrogeeni), 3 µL 10 mM dntps, 1 µL (10 U) Escherichia coli DNA-ligaasi, 4 µL (40 U) E. coli DNA polymeraasi ja 1 µL (2 U) E. coli RNaasi H, ja seosta inkuboitiin. 16°C: ssa 2 tunnin ajan.cDNA-terminit kiillotettiin 10 U T4-DNA-polymeraasilla (invitrogen) 16°C: ssa 5 minuutin ajan, ja reaktio pysäytettiin lisäämällä 10 µl 0,5 m etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA). Tuloksena saadut cdnat puhdistettiin uuttamalla fenoli / kloroformi / isoamyylialkoholilla (25:24:1), minkä jälkeen etanoli saostettiin edellä kuvatulla tavalla (17), lukuun ottamatta 1 µg: n hiivatrna: n käyttöä kantaja-aineena polyadenyylihapon sijasta. Saostunut cDNA liuotettiin 50 µL: aan TE (10 mM Tris-HCl, pH 8, 0 ja 1 mM EDTA), sekoitettiin 30 µL: aan 20-prosenttista (w/v) polyetyleeniglykoli (PEG) 6000/2, 5 M NaCl-liuosta, minkä jälkeen sitä inkuboitiin jäällä 1 tunnin ajan (17). Inkubaation jälkeen cDNA-seosta sentrifugoitiin 18 000× g: n lämpötilassa 4°c 15 minuutin ajan. Tuloksena saatu cDNA-pelletti huuhdeltiin kahdesti 70-prosenttisella etanolilla, kuivattiin ja suspendoitiin uudelleen 30 µL: aan vettä. Puhdistettu cDNAs liitettiin 500 pmol SP6-adapterilla (Taulukko 1) käyttäen 5 U T4-DNA-ligaasia (Invitrogen) 50 µL: n reaktiotilavuudessa 16°C: ssa yön yli. Adapteri-ligated seos laimennettiin kaksi kertaa vedellä, ja sitten cDNAs puhdistettiin käyttäen dnaclear™ sarake (Ambion, Austin, TX, USA). Eluaattia (16 µL: ssa vettä) käytettiin mallina cRNA-synteesissä. MEGAscript® T7 kit: n (Ambion) avulla crnas syntetisoitiin 37°C: n lämpötilassa yön yli 40 µL: n reaktiotilavuudessa. Kun template cDNAs oli hajotettu 4 U DNase I: llä, syntetisoidut crnat puhdistettiin rneasy® Mini Kit: llä (QIAGEN, Valencia, CA, USA) ja eluoitiin 100 µL: n vedellä. CRNA: n pitoisuus määritettiin ultraviolettiabsorptiolla (UV). Toisen kierroksen Crna-vahvistuksessa käytettiin 2 µg syntetisoitua cRNA: ta ja 100 pmol SP6 UP-primeria (joka vastaa taulukossa 1 esitettyä SP6-sovittimen yläjuosteista oligonukleotidia) templaattina ja primerina. Toisen kierroksen cDNA-synteesi suoritettiin alkuperäisen käänteiskopioinnin tavoin lähde-RNA: sta, paitsi että SP6 UP-primer-hehkutus suoritettiin 50°C: ssa 3 minuutin ajan. Saadun kaksijuosteisen cDNA: n puhdistamisen jälkeen DNAclear-kolonnin kautta käytettiin 0,5 µg cDNA: ta seuraavan SP6-RNA-polymeraasiavusteisen cRNA-vahvistuksen mallina. MEGAscript SP6 kit (Ambion) – standardin avulla cRNA-synteesi suoritettiin 37°C: ssa 6 tunnin ajan. kun template cDNA oli hajotettu dnase I: n avulla, syntetisoidut crnat puhdistettiin edellä kuvatulla tavalla.

cDNA-kirjaston rakentaminen

kaksi mikrogrammaa tuloksena olleista crnoista altistettiin kaksijuosteiselle cDNA-synteesille käyttäen 100 pmol attB2-not – (dT)18 primeria (Taulukko 1). CDNA-synteesi, päätypuhallus, puhdistus ja adapteri-ligaatio suoritettiin kuten edellisissä cDNA-synteeseissä, paitsi että attB1-sovitin (Taulukko 1, 500 pmol) liitettiin kaksisäikeisiin cdnoihin. Kun attB1-adapterilla liitetyt cdnat oli puhdistettu fenoli/kloroformi/isoamyylialkoholi-uuttamisella, etanolin saostamisella ja PEG/NaCl-saostamisella tässä järjestyksessä, ne liuotettiin 50 µL: aan TE: tä ja käsiteltiin RNaasi A: lla (lopullisena pitoisuutena 10 µg/mL; Invitrogeeni) saastuneen RNA: n hajottamiseksi 37°C: ssa 30 minuutin ajan. Reaktioseos puhdistettiin jälleen uuttamalla fenoli / kloroformi/isoamyylialkoholi, minkä jälkeen etanoli saostettiin ja PEG / NaCl saostettiin. Tuloksena saadut cdnat liuotettiin 15 µL TE: iin, ja niiden määrä arvioitiin fluoresoivan värjäytymisvoimakkuuden perusteella agaroosigeelin elektroforeesin jälkeen (4). AttB1-ligoituneille cDNAs: ille (36 ng) tehtiin in vitro rekombinaatioreaktio (Gateway®-järjestelmä; Invitrogen) 250 ng: n attP-pSP73-luovuttajavektorilla edellä kuvatulla tavalla (4, 16, 17). Lyhyesti, attB1-ligated cDNA ja attP-pSP73 luovuttaja vektori sekoitettiin ja inkuboitiin 10-µL reaktiotilavuudessa, joka sisälsi 2 µL 5× BP-klonaasi™ – reaktiopuskuria ja 2 µL BP-Klonaasia (molemmat Invitrogeenista) 25°C: ssa yön yli. CDNA-seosta käsiteltiin 2 µg proteinaasi K: lla (Invitrogen) 37°C: n lämpötilassa 10 minuutin ajan reaktion sammuttamiseksi ja uutettiin fenoli/kloroformi/isoamyylialkoholilla, minkä jälkeen etanoli saostettiin 2 µg hiivatrna: lla kantaja-aineena. Saostunut cDNA liuotettiin 10 µL: aan vettä, ja 1 µL seosta käytettiin ElectroMAX™ DH10B™ – E. coli-solujen (Invitrogeeni) muuntamiseen. Tuloksena olevan cDNA-kirjaston titrauksen jälkeen cDNA-plasmidit otettiin talteen noin 1 000 000 pesäkkeestä aiemmin kuvatulla emäksisellä natriumdodekyylisulfaattimenetelmällä (SDS) (4,19). Tuloksena olleet cDNA-kloonit olivat plasmidin muodossa kantamassa attL-alueita. Koska joissakin sovelluksissa tarvitaan attb-paikkoja sisältäviä plasmideja, nämä plasmidit muunnettiin edellä kuvatulla tavalla attB-paikkoja sisältäviksi plasmideiksi (16). Tämän cDNA-kirjaston nimeksi tuli MB-AL (mouse brain amplified cRNA-derived library).

MB-AL: lle kuvatulla tavalla rakensimme cDNA-kirjaston amplifioimattomasta RNA: sta (100 µg hiiren aivojen kokonaisrna) ja nimesimme sen MB-CL: ksi (hiiren aivojen konventionaalisesti rakennettu kirjasto).

Monistettuihin crnoihin kohdistuvan Kokoharhavaikutuksen tutkiminen

kokoharhavaikutuksen tutkimiseksi T7-RNA-polymeraasilla transkriboitu ensimmäisen kierroksen cRNAs ja SP6-RNA-polymeraasilla transkriboitu toisen kierroksen cRNAs tehtiin 1, 0% agaroosigeelillä (1 µg kukin), minkä jälkeen ne pyyhittiin nailonkalvolle (Biodyne® B Nailonkalvo; PALL, East Hills, NY, USA). Ne hybridisoituivat 32P-merkityn SP6 UP-primerin(Taulukko 1) ja Not-(dT)18 (5′-GCGGCCGCTTTTTTTT-3′) oligonukleotidin kanssa. Kymmenen pikomolia jokaisesta anturista merkittiin ATP: llä (noin 3000 Ci / mmol; Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, Yhdysvallat) käyttämällä T4-polynukleotidikinaasia (Takara, Kioto Japani). Yön yli tapahtuneen hybridisaation jälkeen GMC-puskurissa (20) 45°C: n lämpötilassa nämä kalvot pestiin laajasti 1× standardiselline citrate (SSC)/1% SDS-liuoksessa kolme kertaa huoneenlämmössä. Hybridisoituneiden signaalien analyysi tehtiin Bas 2000-Kuva-analysaattorilla (Fuji Photo Film, Tokio, Japani)

cDNA-kirjastojen arviointi

geelielektroforeesi. CDNA-inserttien jakautumista tutkittiin T7-RNA-polymeraasilla syntetisoitujen cRNAs-yhdisteiden elektroforeesillä käyttäen malleina NotI-pilkkoutuneita MB-AL-ja MB-CL-plasmidisia cDNAs-yhdisteitä. Puhdistuksen jälkeen käyttäen Rneasy Mini Kit, cRNAs elektroforisoitiin formaldehydiä sisältävä agaroosigeeli täydellinen RNA markkereita (EMD Biosciences, Madison, WI, USA). Kun geeli oli värjätty SYBR® Green II: lla (Invitrogen), fluoresoiva värjäysintensiteetti analysoitiin käyttäen ImageQuant® (versio 5.0) – ohjelmistoa FluorImager 595: llä (Amersham Biosciences).

satunnainen yhden passin sekvenssianalyysi. CDNA-kloonien 3 ’ – loppuisia sekvenssejä tutkittiin DNA-sekvensoinnilla. 768 satunnaisesti valittujen kloonien plasmidi-DNA puhdistettiin MFX-9600 Magnia® – laitteella (Toyobo, Osaka, Japani) ja analysoitiin RISA 384-Kapillaarisekvensserillä (Shimadzu, Kioto, Japani) (16). Kun vektorisekvenssi oli leikattu käyttämällä Sequencher™ – ohjelmistoversiota 4.1 (Hitachi Software, Tokio, Japani), saadut cDNA-sekvenssit, jotka olivat pitempiä kuin 200 nukleotidijäämää, ryhmiteltiin cDNA-merkintöihin GenBank® – tietokantaan ja omaan hiiritietokantaamme. CDNA-kloonien 3′ – päiden eheys tutkittiin analysoimalla, löytyikö kanoninen polyadenylaatiosignaaliheksameeri (5′-AATAA-3’) tai sen yksiemäsvariantit (11 signaaliheksameria) 50 nukleotidijäännöksestä virtaussuunnassa cdnas: n(21) pyrstöstä.

cDNA microarray. Mikroarray-analyysejä tehtiin cDNA-populaatioiden vertailemiseksi MB-AL-ja MB-CL-kirjastoissa. Kotitekoisia cDNA-nailonmikroaraketteja, joissa oli 3534 luotainta, valmistettiin ja radioisotooppisia tunnisteita tehtiin (22). Lyhyesti, cDNA plasmidit, jotka eristettiin meidän institute ja jolle täysi sekvenssit tai end sekvenssit olivat jo tiedossa, havaittiin käyttäen GeneTAC™ RA1 (Genomic Solutions, Ann Arbor, MI, USA) Biodyne B nailon kalvo ja sitten kiinteä jälkeen valmistajan ohjeita. Luettelo cdnas immobilized tässä mikroarray on saatavilla pyynnöstä kirjoittajat. MB-AL ja MB-CL kohde-cdnat valmistettiin käyttäen käänteistä transkriptiota kustakin 1 µg: n cRNA-näytteestä, jota käytettiin inserttikokoanalyysissä edellä kuvatulla tavalla. Nämä kohteet syntetisoitiin ja merkittiin reaktioseoksessa, joka sisältää 1 µg kutakin cRNA: ta, 100 ng satunnaista heksameeria, 1× alkujuostepuskuria, 10 mM DTT: tä, jokaista 800 µM dATP: tä, dTTP://dgtp, 800 nM dctp, 5 µL dCTP: tä (>2500 Ci / mmol; Amersham Biosciences) ja 100 U: n SuperScript II RNaasi h-käänteistä transkriptaasi huoneenlämmössä 10 minuutin ajan ja sitten 42°C: ssa 1 tunnin ajan. emäksisen hajoamisen ja neutraloinnin jälkeen merkityt cdnat puhdistettiin qiaquick® PCR – puhdistussarjalla (QIAGEN) ja laskettiin. Kohde-cDNA: lle tehtiin hybridisaatio nailonmikroarray-cDNA: n kanssa 1 µg: n polyadenyylihapon ja 2, 5 µg: n hiiren Cot-1 DNA®: n (Invitrogen) läsnä ollessa 250 µL: ssa PerfectHyb™ – puskuria (Toyobo) yön yli 68°C: ssa. Tiukan pesun jälkeen 68°C: ssa 2× SSC/1% SDS: llä (kaksi pesua 15 min kummassakin) ja sitten 0,1× SSC/1% SDS: llä (kaksi pesua 30 min kummassakin) hybridisaatiosignaalit havaittiin ja analysoitiin FLA-8000: lla (Fuji-Valokuvafilmi). CDNA-pisteet, joissa oli voimakkaampia signaaleja kuin taustakontrollissa, valittiin ja niitä analysoitiin tarkemmin. Globaalin normalisoinnin jälkeen saatiin MB-AL-ja MB-CL-kohteista peräisin olevien cDNA-pisteiden signaalitehojen scatter tontteja.

RNA blot-hybridisaatio. RNA blot-hybridisaatio toteutettiin kokoharhavaikutusten tutkimiseksi. MB-AL ja MB-CL cRNAs (kukin 1, 5 µg, syntetisoitu edellä kuvatulla tavalla) elektroforisoitiin formaldehydipitoiseen agaroosigeeliin ja siirrettiin Biodyne B: n nailonkalvoon. Luotaimen cdnat valmistettiin PCR-vahvistuksella. Alukkeet on suunniteltu Genbankin tietokantaan tai omaan tietokantaamme rekisteröityjen sekvenssien perusteella.; mallineet olivat eristämiämme cDNA-plasmideja. Ribosomaalisen S6-proteiinin koetin pituus oli 724 bp, monistettu 5′-CGCTCGGGCTGG-3′ ja 5′-GAGGACAGCTCGGG-3′-alukkeilla, ja lämpöshokkiproteiinin (hsp) koetin 70, 940 bp pituus, monistettiin 5′-GATGGACAAGGCGCAGATCC-3′ ja 5′ – ctcgatggtgagc-3′ alukkeet. Nämä koettimet merkittiin dCTP: llä (noin 3000 Ci/mmol; Amersham Biosciences) käyttäen Radprime-DNA-merkintäjärjestelmää (Invitrogen). Yön yli kestäneen hybridisaation jälkeen PerfectHyb-puskurissa 65°C: n lämpötilassa kalvoja pestiin peräkkäin 0,1× SSC/1% SDS: llä huoneenlämmössä 5 minuutin ja 15 minuutin ajan ja sitten 65°C: ssa 30 minuutin ajan. Hybridisaatiosignaalit havaittiin Bas 2000-kuva-analysaattorilla.

tulokset ja keskustelu

tässä tutkimuksessa kehittämämme cDNA-kirjaston rakentamismenetelmä on esitetty kuvassa 1 (vasta käyttöön otetut vaiheet on korostettu tähdellä). Menetelmä koostuu kahdesta Crna: n monistusvaiheesta, crnas: n muuntamisesta cDNAs: ksi ja rekombinaatioklonoinnista plasmidiksi. Keskeinen vaihe tässä menetelmässä on adapterin ligaatio tagille cDNA päättyy SP6-promoottorisarjaan. Kun voimme onnistuneesti syntetisoida cdnat tässä muodossa, on mahdollista nimenomaan kääntää puhtaaksi ensimmäisen kierroksen crnat, jotka sisältävät SP6 promoottori sekvenssi niiden 3 ’ lopussa. Toisen kierroksen crnat syntetisoidaan SP6 – RNA-polymeraasilla käyttäen tuloksena olevaa kaksijuosteista cdnaa malleina. Kahden RNA-polymeraasiavusteisen monistuskierroksen jälkeen tuloksena olevat crnat muutetaan kaksoissidoksisiksi cdnoiksi käänteiskopioimalla attb2-Not-(dT)18-primeria käyttäen. Attb2-Not-(dT)18 primerin käyttö käänteisessä transkriptiossa antaa meille mahdollisuuden muuntaa vain ne crnat, jotka kuljettavat sekvenssiä 5′-(a)18gcggccgc-3′ Niiden 3’ päissä. Koska näiden muutosten pitäisi sallia vain sellaisten cdnojen vahvistus ja Kloonaus, joissa on oikein merkityt päät, odotamme, että tämä menetelmä minimoi kokoharhat RNA polymeraasiavusteisen vahvistuksen aikana.

testataksemme menetelmän tehoa rakensimme cDNA-kirjastot tavanomaisella menetelmällä (16) käyttäen hiiren aivojen amplifioimatonta kokonais-RNA: ta (100 µg) ja yllä kuvatulla menetelmällä käyttäen 1 µg hiiren aivojen kokonais-RNA: ta. Taulukossa 2 esitetään yhteenveto kussakin vaiheessa saaduista cDNA: n ja cRNA: n määristä, jotka lasketaan MB-AL: n Konstruktion kolmen riippumattoman koeajon keskiarvona. Saimme lopulliseksi tuotokseksi keskimäärin 6,4×107 riippumatonta cDNA-kloonia. Koska tämä cDNA-kloonien määrä on peräisin yhteensä 36 ng: stä vahvistusprotokollaa käyttäen tuotetusta cDNA: sta, laskemme, että tällä menetelmällä saadaan noin 1,2×1011 cDNA-kloonia 1 µg: n kokonais-RNA: sta.

tutkiaksemme monistusvaiheiden kokoharhavaikutusta kokeellisesti vertasimme seuraavaksi ensimmäisen kierroksen ja toisen kierroksen cRNA: n kokojakaumia RNA blot-hybridisaatioanalyysillä. Näissä kokeissa ensimmäisen ja toisen kierroksen cRNAs hybridisoitiin SP6 UP primer ja Not-(dT) 18 oligonukleotidi, vastaavasti, koska nämä oligonukleotidi anturit havaita vain crnas oikein transkriboitu loppuun. Kuten kuviosta 2 käy ilmi, RNA: n koko hybridisaatiosignaalin huipulla toisen kierroksen cRNA: ssa todettiin olevan lähes sama kuin ensimmäisen kierroksen cRNA: ssa, mutta hieman siirryttäessä pienempään kokoon. Epäilemme, että crnas: n katkaisu tapahtui luultavasti toisen kierroksen cDNA-synteesin aikana SP6 UP primerilla.

lisätyn cDNA-kirjaston laadun arvioimiseksi vertailimme myös amplifikaation kanssa ja ilman sitä tuotettujen cDNA-kirjastojen ominaisuuksia (MB-AL ja MB-CL). Tarkastelimme ensin cDNA-inserttien kokojakaumaa, kuten kuvassa 3A on esitetty. geelivärjäyskuvasta saadut fluoresenssisignaalien tulokset osoittivat, että MB-AL: n ja MB-CL: n cDNA-inserttien koot olivat samanlaiset, mutta huippupiste oli MB-AL: ssa (0,65 kb) hieman pienempi kuin MB-CL: ssä (0,8 kb). Seuraavaksi analysoimme 3 ’ – loppuisia sekvenssejä satunnaisesti otetuista cDNA-klooneista jokaisesta kirjastosta. Näiden lausekkeiden ryhmittelytulokset on esitetty kuvassa 3B, ja ne viittaavat siihen, että MB-AL: n monimutkaisuus oli yhtä suuri kuin MB-CL: n. On kuitenkin syytä huomata, että erittäin tarpeettomat cDNA-kloonit hävisivät MB-AL: ssa. Tilastollisella analyysillä (Chi-testi) osoitettiin, että MB-AL: n ja MB-CL: n redundaatioiden ero oli merkittävä (todennäköisyys sille, että MB-AL: n ja MB-CL: n redundaatiot ovat samanlaisia, on <0, 001). Lisäksi tutkimme cdnas: n 3’ – päiden eheyttä analysoimalla, sisälsikö kukin EST polyadenylaatiosignaalin heksameeria vai ei. Tulokset osoittivat, että 80, 1% cDNA-klooneista MB-AL: ssä ja 87, 3% MB-CL: ssä sisälsivät uskottavia polyadenylaatiosignaalisekvenssejä (21). Polyadenylaatiosignaalin heksameerien esiintymistiheyden väheneminen MB-AL: ssä todennäköisesti viittasi cDNA-kloonien määrän kasvuun, kun cDNA-synteesi pohjustettiin sisäisesti kahden DT-pohjustuskierroksen vuoksi.

mikroarray-hybridisaation avulla tarkastelimme MB-AL: n cDNA-populaatiota verrattuna MB-CL: n populaatioon. Kuvassa 3C on Mb-AL-ja MB-CL-kohteiden hybridisaatiosignaalien sirontakaavio. Tulokset osoittivat huomattavan korkean hybridisaatiosignaalien korrelaation MB-AL-ja MB-CL-kohteiden välillä, mikä viittaa siihen, ettei amplifikaatiolla ollut haitallista vaikutusta cDNA-populaatiossa.

lopuksi teimme RNA blot-hybridisaatioanalyysin, jossa tutkittiin kokoharhavaikutuksia kiinnittäen huomiota kodinhoitogeeneihin (kuva 3D). Ribosomaalisen S6-proteiinin ja hsp 70: n cRNA-koot sekä MB-AL: n että MB-CL: n osalta olivat samanlaiset ja verrattavissa raportoitujen nukleotidisekvenssien perusteella odotettuihin. HSP 70 cRNAs: n hybridisaatiomalli MB-AL: ssä oli kuitenkin hieman erilainen kuin MB-CL: ssä, mikä viittaa siihen, että kokoharha-efekti ei poistunut kokonaan.

tässä raportissa kuvattu cDNA-kirjaston rakentamismenetelmä suunniteltiin minimoimaan kokoharhat vahvistusvaiheiden aikana RNA-polymeraasin avustamana. Tällaista RNA-polymeraasiavusteista kirjastorakentamismenetelmää pienestä RNA-poolista kattavaan sekvenssianalyysiin ei ole tutkittu hyvin, kun taas cDNA / cRNA-kirjastorakentamismenetelmiä mikroarray-hybridisaatioon on aktiivisesti jatkettu. Vaikka Lukjanov et al. (23) ja Piao et al. (24) raportoidut menetelmät, joissa PCR-vahvistusta käytetään cDNA-kirjaston muodostamiseen kokonaisrna-RNA: n submikrogrammimäärästä, PCR-vahvistuksella on luonnostaan haittoja, kuten vakava koko ja populaatioharha sekä cDNA-vahvistuksen Alhainen uskollisuus. Tämän vuoksi yritimme tässä tutkimuksessa kehittää cDNA-kirjaston rakentamismenetelmää, joka perustuu RNA-polymeraasiavusteiseen monistukseen.

tätä tarkoitusta varten kehitimme uuden RNA polymeraasiavusteisen monistusstrategian, kuten kuvassa 1 on esitetty, koska eberwine et al. 5), Huang et al. (10), ja Lin et al. (11) niillä on edelleen haittoja plasmidipitoisen cDNA: n valmistamiseksi, joka soveltuu kattavaan geenirakenneanalyysiin. Edellisessä Crna-monistuksen jälkeinen cDNA-synteesi tehdään satunnaisilla heksameereillä, jolloin monistetut cdnat ovat väistämättä lyhyempiä kuin alkuperäiset (5,7). Jälkimmäisessä homopolymeerisen hännän käyttöönotto cDNA: n pääjuosteessa terminaalisella deoksinukleotidyylitransferaasilla (TdT) tai Moloney-hiiren leukemiaviruksen (MMLV) käänteiskopioijaentsyymiaktiivisuudella (10,11) on järkevää minimoida kokoharhavaikutus RNA-polymeraasiavusteisen vahvistuksen aikana, kuten menetelmässämme. Homopolymeerisen jäännösmenetelmän tiedetään kuitenkin aiheuttavan cdnas: n katkeamista johtuen cDNA: n synteesin odottamattomasta alkamisesta sisäisten RNA-sekvenssien homopolymeerisestä venymisestä. Koska tässä tutkimuksessa kuvattu adapteri-ligaatiomenetelmä voisi tarjota tietyn sekvenssin cDNA: n pohjustukselle, voisimme odottaa vähentävämme cDNA: n katkaisua menetelmällämme.

periaatteessa menetelmämme tulisi vain vahvistaa cdnoja, joita reunustaa luontainen poly(a)-pyrstö ja SP6-sovitin, jotka syntyivät ensimmäisen kierroksen cDNA-synteesissä. Kuvissa 2 ja 3a esitetyt tulokset olivat olennaisilta osin yhdenmukaisia tämän kanssa, vaikka pienemmän kokoluokan cDNA-populaatio oli hieman kasvanut. RNA blot-analyysin tulokset (kuva 3d) osoittivat myös, että kokoharhavaikutusta voitiin pienentää, mutta ei kokonaan poistaa edes meidän menetelmässämme. Tämä johtui luultavasti siitä, että Poly(a) – pyrstön liittämät typistetyt cdnat ja SP6-promoottorijakso syntyivät cRNA: n muuntamisen aikana cDNA: ksi. Tätä näkemystä tuki se, että polyadenylaatiosignaalien sekvenssien esiintymistiheys MB-AL: ssä oli huomattavasti pienempi kuin tavanomaisessa cDNA-kirjastossa (21). Cdnas: n katkeaminen voi tapahtua cDNA-synteesin aikana johtuen RNA: n sisäisestä pohjustuksesta dT-tailed primerilla ja SP6 primerilla. Koska eukaryoottisissa mrnoissa esiintyy usein homopolymeerisiä venymiä, homopolymeerinen tailing-menetelmä saattaa aiheuttaa vakavampia kokoharhoja usean kierroksen Crna-vahvistuksessa kuin adapteri-ligaatiomenetelmämme. Vaikka reaktiolämpötilan nostaminen käänteisen transkription aikana ja primer-pitoisuuden pienentäminen voisivat jossain määrin tukahduttaa poikkeavan sisäisen pohjustuksen cDNA-synteesissä, tiedetään tämän olevan tällä hetkellä vaikeaa kokonaan poistaa. Näin ollen, vaikka suoritimme kahden kierroksen Crna-vahvistuksen kokonaisprotokollan demonstroimiseksi, suosittelemme käytännössä toisen kierroksen cRNA-vahvistuksen jättämistä väliin, kun ensimmäisen kierroksen reaktiossa saadaan riittävästi cRNA: ta.

näiden tulosten perusteella päätellään, että uudesta menetelmästämme on hyötyä cDNA-kirjaston rakentamisessa pienestä määrästä lähtö-RNA: ta. Itse asiassa olemme onnistuneesti ja rutiininomaisesti käyttäneet tätä menetelmää cDNA-kirjastojen rakentamiseen, kun kokonais-RNA: n määrä on alle 1 µg (tietoja ei näytetä). Koska 1 µg kokonais-RNA: ta voidaan ottaa talteen 105-106 nisäkässolusta tai 1 mg nisäkässoluista, cDNA-kirjastot voidaan helposti rakentaa solusekoittajien tai mikrotissektion fraktioimista soluista meidän menetelmällämme. Lisäksi, koska laskemme, että tämän menetelmän avulla voimme saada yli 105 cDNA-kloonia 1 pg: n kokonais-RNA: sta, mikä on lähellä kokonais-RNA: n määrää yhdessä solussa, yhden solun johdettu cDNA-kirjasto voidaan rakentaa tämän adapteri-ligaatioavusteisen cRNA-vahvistuksen pohjalta.