Abstrakti

HIV-1-transkriptiota säätelee CDK9 / sykliini T1, joka tyypillisestä solusyklistä riippuvaisesta kinaasista poiketen on säädelty liittymällä 7SK: n pieneen ydinribonukleaariproteiinikompleksiin (snRNP). Vaikka tämän kompleksin proteiinikomponentteja tutkitaan hyvin, kompleksinmuodostuksen mekanismia ei vielä täysin tunneta. CDK9/sykliini T1: n liittymistä 7SK snRNP: hen säätelee osittain palautuva CDK9-fosforylaatio. Esittelemme tässä kattavan katsauksen cdk9-fosforylaatioon osallistuvista kinaaseista ja fosfataaseista ja keskustelemme niiden roolista HIV-1: n replikaation säätelyssä ja mahdollisuuksista kohdentua lääkekehitykseen. Ehdotamme uudenlaista reittiä HIV-1-transkription säätelyyn CDK9 ser-90-fosforylaation kautta CDK2: lla ja CDK9 ser-175-defosforylaation kautta proteiinifosfataasi-1: llä.

1. Johdanto

HIV-1-infektion täydellinen hävittäminen edellyttää uusia lähestymistapoja, joilla voidaan indusoida integroitua HIV-1-provirusta, johon nykyiset antiretroviraaliset lääkkeet eivät vaikuta ja joka reboundoituu, kun antiretroviraalinen hoito lopetetaan . HIV-1-latenssi voi johtua useista tekijöistä, kuten HIV-1-transkriptioaktivaattoriproteiinin (Tat) tai cellular transkriptioaktivaattoreiden puutteesta, transkriptiohäiriöistä solujen promoottoreiden kanssa, epäsuotuisasta integraatiokohdasta, epigenetiikasta ja todennäköisesti muista tekijöistä . Näin ollen HIV-1-transkription aktivoinnin mekanismien parempi ymmärtäminen on tärkeää suunniteltaessa uusia hoitoja, joilla pyritään sekä induktioon että HIV-1-transkription estämiseen. Tässä tarkastelemme cdk9/sykliini T1: n aktivointiin osallistuvia kinaaseja ja fosfataaseja ja keskustelemme siitä, miten näitä entsyymejä voidaan mahdollisesti käyttää estämään tai aktivoimaan HIV-1: tä tulevien hoitotoimien kehittämiseksi HIV-1-infektioiden hoitoon.

2. HIV-1-transkription aktivointi P-TEFb

HIV-1-transkription avulla aktivoituu HIV-1 Tat-proteiinilla, joka sitoutuu terva-RNA: n pullistumaan, kaikkien orastavien HIV-1-transkriptioiden 5′ – päässä sijaitsevaan hiusneulasilmukkarakenteeseen, ja värittää HIV-1-promoottoriin CDK9/sykliini T1: n, positiivisen transkription venymätekijän b (P-TEFb) komponentin (tarkasteltu yksityiskohtaisesti ; KS.myös kuva kuvassa 1). Transkription aloittamisen aikana TFIIH: iin liittyvä CDK7 / sykliini H fosforyloi Ser-5: n 1ysptsps7-heptapeptidisekvenssi toistuu 52 kertaa rnapii: n C-terminaalialueella (CTD). Ser-5 fosforyloitu RNAPII kerääntyy 20-40 nukleotidiin (nt) transkription aloituskohdan jälkeen osittain negatiivivaikutteisen venymätekijäkompleksin, NELF: n, ja DRB-herkkyyttä indusoivan kompleksin, DSIF: n vaikutuksesta . Äskettäin TFIIH: Hon liittyvän CDK7: n osoitettiin fosforyloivan myös CTD Ser-7-jäämiä , jotka voivat aloittaa Ser-2-fosforylaation P-TEFb: llä . P-TEFb: n rekrytointia HIV-1-promoottoriin, joka sijaitsee 5′ LTR: n U3-R-U5-alueella, helpottaa Tat, joka kohdistaa CDK9/sykliini T1 TAR-RNA: han, jossa sykliini T1 sitoutuu terva-RNA: n g-rikkaaseen silmukkaan . CDK9/sykliini T1: n rekrytointi edistää transkriptiovenymää RNA polymeraasi II: n (RNAPII) avulla, joka muutoin pysähtyy TAR-RNA: n synteesin jälkeen . Rnapii: n vapautuminen P-TEFb Complexin tauolta tuo mukanaan mRNA: n korkkauksen ja nelfin menetyksen . P-TEFb käynnistää RNA polymeraasi II: n (RNAPII) transkription venymän fosforyloimalla negatiivisen venymäkertoimen (NELF) ja DRB-herkkyyttä indusoivan kompleksin (DSIF/Spt4/Spt5), mikä edistää NELF: n ja myös fosforyloivien ser-2-jäämien vapautumista rnapii CTD: ssä (tarkasteltu ). Kun dissosiaatio NELF, DSIF tulee positiivinen venymä tekijä ja lisäsi processivity RNAPII . Vaikka P-TEFb kulkee venymäkompleksin Mukana, sen CTD-kinaasiaktiivisuutta ei enää tarvita kompleksin vapauduttua paussilta .

p-TEFb: n tärkeyden vuoksi sääntelyä on ylläpidettävä asianmukaisen toiminnan varmistamiseksi. Cdk9: n tiettyjen kohtien fosforylaation ja defosforylaation on tapahduttava koko transkriptioprosessin ajan ja sitä on valvottava tiukasti. Tässä tarkastelussa keskitytään cdk9: n säätelyyn fosforylaatiomuutosten avulla.

3. P-TEFb: n koostumus ja sen rooli HIV-1-Transkriptioaktivaatiossa

P-Tefb on heterodimeeri, joka koostuu sykliiniriippuvaisesta kinaasista 9 (CDK9) ja yhdestä C-tyypin sykliineistä T1, T2a tai T2b, joista sykliini T1 on runsain kumppani . Sykliini K, jota alun perin luultiin cdk9: n mollivoittoiseksi sykliiniksi, tunnustetaan nykyään cdk12: n ja CDK13: n sykliinikumppaniksi . Vain sykliini T1-proteiini muodostaa tehokkaasti kompleksin terva-RNA: han sitoutuneen HIV-1-Tatin kanssa . Tämä johtuu sykliini T1 kohdassa 261 olevasta kysteiinijäämästä eikä sykliini T2a-ja T2B-proteiineista löytyvästä asparagiinista. Sykliini T1 ja mutatoitunut KYS-261 sitoutuvat Tat: hen, mutta eivät kykene värväämään Tat: ta TAR-RNA: han. TAT: n vuorovaikutus TAR-RNA: n ja sykliini T1: n kanssa on riippuvainen sinkki-ioneista, mikä taas edellyttää KYS-261: n läsnäoloa .

CDK9: llä on kaksi toiminnallista isoformia: 42 kDa: n muoto, joka esiintyy pääasiassa pernassa, kateenkorvassa ja kiveksissä, ja 55 kDa: n muoto, joka ilmaistaan eri kudoksissa mutta huomattavasti pienemmillä tasoilla, eli 42 Kd: n isoformi . Kaikki sykliinit liittyvät CDK9: n molempiin isoformeihin ja niillä on kinaasiaktiivisuutta kohti CTD: tä RNAPII: ssa . Noin puolet P-TEFb: stä on inaktiivisessa suuressa kompleksissa , jota sitoo 7SK snRNA ja useita muita proteiineja , mukaan lukien heksametyleenibisasetamidin indusoituva proteiini 1 (HEXIM1), la-sukuinen LARP7-proteiini ja metyylifosfataasikattoentsyymi MePCE . P-TEFb: n pienempi molekyylipainomuoto koostuu CDK9: stä ja sykliini T1: stä ja on entsymaattisesti aktiivinen . Suuri molekyylipaino P-TEFb on inaktiivinen johtuen HEXIM1: stä, joka tuo sen inhiboivan PYNT-sekvenssin CDK9: n aktiiviseen kohtaan .

molekyylipainoltaan suuri P-TEFb-kompleksi toimii CDK9 / sykliini T1: n lähteenä HIV-1 Tat: n rekrytoinnissa . Stressin aiheuttamissa soluissa CDK9/sykliini T1-kompleksi irtoaa 7 SK: n RNA / HEKSIM1-proteiinista ja sitoutuu sitten BRD4: ään ja muodostaa transkriptioaktiivisen pienen kompleksin, joka rekrytoidaan erilaisiin solunedistäjiin . Huolimatta suuren P-TEFb-kompleksin in vitro toimimattomuudesta, suuri eikä pieni kompleksi on tärkeä HIV-1-transkription aktivoinnissa HIV-1: ksi. Tat kilpailee HEXIM1: n kanssa sitoutumisesta sykliini T1: een, joka edistää P-TEFb: n dissosioitumista suuresta kompleksista . HIV-1 Tat-proteiinin osoitettiin myös värväävän suuren P-TEFb-kompleksin HIV-1-promoottoriksi, jossa terva-RNA pystyi syrjäyttämään 7 SK RNA: ta ja aktivoimaan P-TEFb: tä .

Tat helpottaa myös aktiivista P-TEFb: tä ja muita venymäkertoimia ja transkriptiokoaktivaattoreita sisältävän supervenymokompleksin (sec) muodostumista . Näitä tekijöitä ovat AFF4, ENL, AF9 ja venymäkerroin ELL2 . AFF4-proteiini muodostuu keskeiseksi telineeksi, joka värvää muita tekijöitä suorien vuorovaikutusten kautta. AFF4 sitoo sykliiniä T1, ELL2 ja ENL tai AF9, joka toimii siltana, joka yhdistää tämän kompleksin P-TEFb: hen . TATin ja AFF4: n yhdistävien toimintojen kautta P-TEFb ja ELL2 yhdistyvät muodostaen bifunktionaalisen venymäkompleksin, joka aktivoi suuresti HIV-1-transkription . Ilman Tat: ta AFF4 voi välittää ELL2-P-TEFb-vuorovaikutusta, joskin tehottomasti. Tat voittaa tämän rajoituksen tuomalla lisää ELL2: ta P-TEFb: hen ja stabiloimalla ELL2: ta prosessissa, joka vaatii aktiivista P-Tefb: tä .

4. CDK9 fosforylaatio

p-TEFb: n aktiivisuus riippuu useiden seriini-ja treoniinijäämien fosforylaatiosta, ja käsittelemme tätä jäljempänä ja jotka on esitetty CDK9/sykliini T1 / Tat-mallissa kuvassa 2.

4.1. C-terminaalinen CDK9-fosforylaatio

cdk9: n C-terminaalisten jäämien (Ser-347, ser-353 ja Ser-357; Thr-350 ja Thr-354) klusteri autofosforyloituu ja tämä fosforylaatio on tärkeää CDK9/sykliini T1: n sitoutumisessa TAR-RNA: han . Tästä oli osoituksena entsymaattisesti aktiivisen C-terminaalisesti typistetyn CDK9: n kyvyttömyys sitoa TAR-RNA: ta . Rekombinantti CDK9 / sykliini T1, joka autofosforyloitiin in vitro, deposforyloitui tehokkaasti proteiinifosfataasi 2A: n (PP2A), mutta ei proteiinifosfataasi 1: n (PP1) avulla . PP2A-hoito esti myös CDK9/sykliini T1: n sitoutumisen Tat: hen ja TAR-RNA: han in vitro . Nämä havainnot viittasivat siihen, että PP2A saattaa kohdistua CDK9: n C-terminukseen ja mahdollisesti kontrolloida P-TEFb: n interaktiota TAR-RNA: n kanssa. TFIIH esti CDK9: n autofosforylaation, joka liittyi in vitro preinitaatiokompleksiin . PP2A todettiin myöhemmin välttämättömäksi basal HIV-1-transkriptiolle in vitro, koska PP2A: n ehtyminen esti basal HIV-1-transkriptiota ja pp2a: n lisäys tyhjentyneisiin uutteisiin palautti transkription . PP2A-kohteen luultiin olevan Thr-29 (KS.jäljempänä), mutta tätä ei pystytty varmuudella todistamaan eikä vaikutusta toistettu in vivo. Eräässä varhaisessa tutkimuksessa havaitsimme, että PP2A-inhibitoriset pienet okadaiinihappopitoisuudet indusoivat lievästi basaalia, mutta eivät Tat: n aiheuttamaa HIV-1-transkriptiota . Havaitsimme myös basalin induktion eikä TAT-aktivoidun HIV-1-transkription ja lis1-proteiinin yliekspression, jonka huomasimme sitovan ja estävän PP2A: ta in vitro ja olevan vuorovaikutuksessa HIV-1 Tat-proteiinin kanssa . Yhdessä nämä tutkimukset osoittavat, että PP2A voi säädellä HIV-1-basaalista transkriptiota ja myös kontrolloida P-TEFb: n interaktiota TAR-RNA: n kanssa defosforyloimalla CDK9: n C-terminusta.

4, 2. N-terminaalinen Thr-29 fosforylaatio

CDK9: n Thr-29: n fosforylaatio osoitettiin HTLV-1-Veroproteiinin indusoimaksi . CDK9 / sykliini T1 värvätään kromatinoituneeseen HIV-1 LTR: ään ja muihin promoottoreihin BRD4: llä . Tämä BRD4-värväys liittyi CDK9 Thr-29: n fosforylaatioon ja John Bradyn ryhmän vaatimukseen PP2A-defosforylaatiosta . Qiang Zhoun ryhmä kuitenkin ilmoitti , että CDK9 on fosforyloitava ser-175: llä sitoutuakseen BRD4: ään, minkä Jonathan Karnin ryhmä äskettäin vahvisti (KS.yksityiskohtainen keskustelu alla). CDK9: n Thr-29 on homologinen CDK2: n thr-15: n kanssa, jossa fosforylaatio estää CDK2: n toimintaa . Thr-29: n fosforylaation osoitettiinkin estävän CDK9: n aktiivisuutta ja HIV-1: n transkriptiota . Emme kuitenkaan havainneet CDK9 Thr-29-fosforylaatiota okadaiinihapolla käsitellyissä soluissa, joka esti sekä PP2A: ta että PP1: tä käyttämällä Hunter 2D-ohutkerroksisen elektroforeesin ja korkean resoluution massaspektrometrian yhdistelmää, joka osoitti vain C-terminaalisen ser/Thr-klusterin fosforylaation ja ser-175: n, joista vain ser-175-fosforylaation indusoi okadaiinihappo . Näin ollen CDK9 Thr-29-fosforylaatiota ei välttämättä valvota PP2A: lla, ja se on validoitava edelleen sen roolin selvittämiseksi HIV-1-transkription aikana.

4, 3. CDK9: n t-silmukan Thr-186 fosforylaatio

CDK9 T silmukka sisältää useita fosforylaatiopaikkoja, kuten Ser-175 ja Thr-186 (kuva 2). Säilyneen Thr-186: n fosforylointi on välttämätöntä CDK9: n entsymaattiselle toiminnalle . Myös CDK9/sykliini T1: n liittyminen 7SK RNA snRNP: hen edellyttää CDK9: n Thr-186-fosforylaatiota . CDKs: ssä t-silmukan fosforylaatio laukaisee suuria konformaatiomuutoksia, jotka avaavat ATP-sidontataskun ja substraatin sidontapaikan, jolloin CDKs on täysin aktiivinen kinaasina .

äskettäin tehty Kemiallis-geneettinen analyysi, jossa käytettiin CDK7: n selektiivistä kemiallista inhibitiota, osoitti, että se on yksin vastuussa CDK9 Thr-186-fosforylaatiosta ja P-TEFb-riippuvaisesta CTD Ser-2-fosforylaatiosta ja Histoni H2B-ubikitylaatiosta in vivo . Näin ollen CDK7 / sykliini H, joka aiemmin todettiin CDK-aktivoivaksi kinaasiksi (CAK) solusykliin osallistuville CDK: ille, kuten CDK1, 2 ja 4, toimii myös CAK: na transkription säätelyyn osallistuville CDK: ille, joihin kuuluvat CDK8, 9, 12 ja 13 (tarkasteltu ). Maailmanlaajuinen analyysi kinaaseista, jotka voivat fosforyloida CDK9 T-silmukan sirnan avulla, osoitti Ca(2+)/kalmoduliiniriippuvaisen kinaasin 1D (CaMK1D) knock down by siRNA vähensi Thr-186 fosforylaatiota . Näin ollen Ca(2+)-signalointireitin pienimolekyylinen inhibitio vähensi Thr-186-fosforylaatiota ja esti TAT: n aiheuttamaa HIV-1-transkriptiota, mutta ei Verovälitteistä HTLV-1-transkriptiota . Koska Verovälitteisen transkription taustalla on P-TEFb, on edelleen tutkittava, miksi se vaikutti vain HIV-1-transkriptioon.

CDK9 Thr-186 fosforylaatiota voidaan kontrolloida myös solujen fosfataaseilla. Viime vuosikymmenen tutkimuksemme keskittyivät PP1: een, jonka alun perin havaitsimme stimuloivan Tat-riippuvaista HIV-1-transkriptiota in vitro . Kun yliekspressoimme yhtä PP1: n tärkeimmistä ydinenergian säätelyalayksiköistä, NIPP1: tä (PP1: n nuclear inhibitor), havaitsimme PP1-spesifisen HIV-1-transkription ja viruksen replikaation eston . Huomasimme, että Tat sisältää sekvenssin, joka on samanlainen kuin säilötty PP1-sitova rvxf-motiivi, ja osoitimme, että tämä motiivi välittää Tat: n sitoutumista PP1: een in vitro ja In vivo ja että jäämien mutaatio PP1-sitovassa motiivissa (V36A ja F38A) esti Tat: ta indusoimasta HIV-1-transkriptiota . CDK9, joka fosforyloitiin viljellyissä soluissa, joihin oli lisätty ortofosfaattia (32P)ja joita käsiteltiin okadaiinihapolla, depofosforyloitiin tehokkaasti in vitro PP1: llä, mutta ei PP2A: lla, toisin kuin in vitro autofosforyloitu CDK9, jonka fosforyloi PP2A eikä PP1 . Nämä tulokset viittasivat siihen, että PP1 saattaa hillitä CDK9-fosforylaatiota HIV-1-transkription aikana. PP1: n alfakatalyyttisen alayksikön, PP1a: n, osoitettiin toimivan yhteistyössä ja peräkkäin (CA2+)-kalmoduliini-proteiinifosfataasi 2b: n (PP2B) kanssa UV-säteilytetyissä tai heksametyleenibisasetamidilla (HMBA) käsitellyissä soluissa, joissa P-TEFb vapautuu 7SK snRNP-kompleksista . Vaikka PP2B indusoi konformaatiomuutoksen 7SK snRNP: ssä, PP1a defosforyloi CDK9 Thr-186: n ja helpottaa P-TEFb: n julkaisuja 7SK snRNP: stä . CDK9 säilyi defosforyloituneena brd4: n yhteydessä ja se rekrytoitiin esiinitaatiokompleksiin, jossa TFIIH: Hon liittyvä CDK7 voi aktivoida sen uudelleen. Tämän tutkimuksen mukaisesti havaitsimme lisääntynyttä CDK9 Thr-186-fosforylaatiota soluissa, jotka vakaasti ilmaisivat PP1-inhibitorista peptidiä, nipp1: n keskeistä aluetta, ja havaitsimme myös cdk9/sykliini T1: n lisääntyneen assosiaation 7SK RNA: n kanssa . Cdnipp1: n stabiili ilmentyminen häiritsi TAT: n ja PP1: n välistä vuorovaikutusta ja esti HIV-1-transkriptiota , mikä viittaa siihen, että CDK9 Thr-186: n fosforylaation ja defosforylaation välillä on säilytettävä tasapaino ja että tämän tasapainon siirtäminen kohti fosforylaatiota estää HIV-1-transkriptiota. Cdnipp1: n ilmentyminen fysiologisesti merkityksellisellä tavalla osana HIV-1: n genomia NEF: n voimakkaasti estämän HIV-1: n replikaation sijaan , mikä viittaa myös siihen, että PP1: n kohdennettuja inhibiittoreita voidaan käyttää mahdollisina HIV-1-lääkkeinä. Vaikka PP1 on ehdokas Thr-186 defosforylaation, olemme myös havainneet, että se defosforylates CDK9 ser-175 (KS.alla). Lisäksi CDK9 Thr-186-fosfataasi, magnesiumriippuvainen proteiinifosfataasi 1A (aiemmin 2C) (PPM1A) tunnistettiin fosfataasiekspressiokirjaston ja Thr-186-fosfospesifisten vasta-aineiden avulla . PPM1A-yliekspressio vähensi Thr-186-fosforylaatiota ja siRNA-välitteinen defletaatio lisäsi sitä, ja P-TEFb ja PPM1A myös kopioituivat yhteen, mikä viittaa siihen, että CDK9 voi olla ppm1a: n fysiologinen substraatti . Tuoreempi tutkimus osoitti, että CDK9: n Thr-186-fosforylaatio vähenee levossa olevissa CD4(+) T-soluissa, jotka eivät salli HIV-1: n replikaatiota, ja että tämä väheneminen korreloi PPM1A: n runsauteen ja CDK9: n vähäiseen rekrytointiin suureen P-TEFb-kompleksiin . Tämä havainto tukee myös suuren kompleksin tarvetta HIV-1-transkriptiolle ja PPM1A: n kriittistä roolia HIV-1: n tukahduttamisessa lepäävissä T-soluissa. Koska PPM1A: n ekspressio ei muuttunut T-solujen aktivoituessa , ppm1a: n toiminnan säätelyyn saattaa kuitenkin liittyä tuntemattomia säätelytekijöitä.

4, 4. CDK9: n T-silmukan ser-175 fosforylaatio

kun CDK9/sykliini T1 irtoaa suuresta P-TEFb-kompleksista, CDK9 voi fosforyloitua ser-175: llä. Vaikka Thr-186 defosforylaatio esti täysin CDK9/sykliini T1-kinaasiaktiivisuuden, David Pricen ja kollegoiden cdk9 S175A-ja CDK9 S175D-mutanttien kinaasiaktiivisuudessa ei havaittu eroja . Sen sijaan Qiang Zhou ryhmineen osoitti, että CDK9 s175a-mutantti oli inaktiivinen, kun taas CDK9 s175d-mutantti oli aktiivinen kinaasina . Ne osoittivat myös, että Ser-175-fosforylaatio edistää CDK9/sykliini T1: n sitoutumista Brd4: ään . On esitetty, että Ser-175: n fosforylaatio voi aiheuttaa konformaatiomuutoksen CDK9: ssä, jolloin BRD4 sitoutuu sykliini T1: een . Äskettäisessä tutkimuksessamme huomasimme, että PP1: n dynaaminen inhibitio johti cdk9 ser-175: n eksklusiiviseen fosforylaatioon, joka määritettiin Hunter 2D-peptidikartoituksen ja LC-MS-analyysin yhdistelmällä in vivo . PP1: n esto johti CDK9: n aktiivisuuden estymiseen ja rnapii: n fosforylaation vähenemiseen in vitro ja In vivo . Huomasimme, että CDK9 S175A-mutantti oli entsymaattisesti aktiivinen ja indusoi HIV-1-transkriptiota . Mielenkiintoista on, että vaikka CDK9 S175D-mutantti oli vähemmän aktiivinen kinaasina, se muodosti helpommin pienen P-TEFb-kompleksin varsinkin PP1: n estyessä. Niinpä tulimme siihen tulokseen, että PP1 aktivoi HIV-1-transkription defosforyloimalla CDK9 ser-175-jäämiä. Huomasimme myös, että Ser-175-fosforylaatioaktiivisuus oli paljon runsaampaa kuin thr-186-aktiivisuus soluuutteissa, mikä viittaa siihen, että CDK9-aktiivisuus voi luonnollisesti vaimeta ser-175: n ylifosforylaation kautta. Jonathan Karnin ryhmän tuore tutkimus osoitti, että T-solujen aktivoituminen T-solureseptorin (TCR) tai forboliesterin (PMA) kautta signaloi voimakkaasti cdk9 ser-175: n fosforylaatiota . Molekyylimallinnuksen perusteella he ehdottivat, että fosforyloitu Ser-175 muodostaa vetysidoksen Tat Lys-14: n kanssa vahvistaen Tatin sitoutumista CDK9/sykliini T1: een ja edistäen HIV-1-transkriptio-aktivaatiota . Myös varhaisten havaintojen mukaan CDK9 S175A-mutaation havaittiin poistavan sitoutumisen BRD4: ään . Havaintojemme mukaisesti CDK9 S175A-mutantin havaittiin myös aiheuttavan voimakkaasti TATista riippuvaista latenttia HIV-1: n uudelleenaktivoitumista, minkä Jonathan Karn ja hänen työtoverinsa katsoivat johtuvan siitä, ettei tämä mutantti kykene sitomaan BRD4: ää samalla kun se pystyy sitoutumaan TATiin . He havaitsivat myös , että Ser-175: ssä fosforyloitu CDK9 on suljettu pois 7SK RNP-kompleksista, mikä vastaa aikaisempaa havaintoamme, että CDK9 S175D-fosfomimeettistä mutanttia löytyi pienestä P-TEFb-kompleksista . Siksi tämä uusin tutkimus osoittaa Ser-175: n olevan tärkeä kohde HIV-1: n uudelleenaktivoinnille ja pienimolekyylisten terapeuttisten lääkeaineiden mahdolliselle kehittämiselle.

äskettäin kehitimme PP1-kohdistettuja pieniä molekyylejä, jotka mallinnettiin sopimaan PP1: n RVxF-mukautuvaan onteloon . Seuloimme lähes 300 000 yhdistettä ja sitten fyysisesti noin 1 000 yhdistettä ja tunnistimme yhden hit-yhdisteen, 1H4: n, joka esti HIV-1: n transkriptiota ja replikaatiota ei-sytotoksisilla pitoisuuksilla . 1H4 esti PP1-välitteisen defosforylaation substraattipeptidissä, joka sisälsi rvxf-sekvenssin in vitro, häiritsi PP1: n ja TAT: n yhdistymistä viljellyissä soluissa ja esti PP1: n translokaation tumaan . Parhaillaan jalostamme hit-yhdistettä ja kehitämme myös PP1-kohdennettuja yhdisteitä piilevän proviruksen aktivointiin.

4, 5. CDK9: n ser-90-fosforylaatio

Me ja muut olemme osoittaneet aiemmin, että HIV-1-transkriptio aktivoituu TAT: n vaikutuksesta G1-vaiheessa, mutta ei G2-vaiheessa . Näin otaksuimme, että Tat saattaisi harjoittaa solusyklin säätelykinaasia, jonka osoitimme olevan CDK2 / sykliini E . HIV-1 estyy CDK2: n knockdown-soluissa ja myös makrofagien erilaistumisessa indusoiduista pluripotenteista kantasoluista CDK2: n knockdownilla , mikä viittaa edelleen siihen, että CDK2 on tärkeä HIV-1: n transkriptiossa ja replikaatiossa. Cdk2: n ja CDK9: n välinen toiminnallinen yhteys löytyi, kun analysoimme HIV-1: n inhibitiota rautakelaattoreilla. HIV-1-transkriptio estyi T-soluissa, joita hoidettiin rautakelaattoreilla 311 ja ICL670, mikä esti myös CDK2: n ja CDK9: n solutoimintaa . Tehokkaammat di-2-pyridyyliketonitiosemikarbatsonipohjaiset tridentaattiraudan kelaattorit estivät HIV-1: n transkriptiota ja viruksen replikaatiota paljon pienemmillä pitoisuuksilla kuin 311 tai ILC670 ja estivät myös CDK2: n ja CDK9: n aktiivisuutta . Vaikka CDK2: n eston mekanismia ei ole vielä selvitetty, siihen todennäköisesti sisältyy P21: n induktio hypoksian indusoiman tekijän 1 (HIF-1) säätelyn kautta, koska rautavaje poistaa rautaa prolyylihydroksylaasista ja lisää HIF-1: n ja HIF-2: n proteiinitasoja hypoksian vaikutusta jäljitellen . Analysoimme CDK9-fosforylaation CDK2 – menetelmällä in vitro ja tunnistimme Motifin (90SPYNR94), joka edusti konsensus-CDK2-fosforylaatiokohtaa ja joka fosforyloitiin tehokkaasti . CDK9: n fosforylaatio Ser-90: llä havaittiin fosfospesifisillä vasta-aineilla ja se väheni CDK2: n kaadon jälkeen. CDK9 s90a-mutanttien yhteys suureen P-TEFb-kompleksiin väheni ja sen yli-ekspressio esti HIV-1-transkriptiota. Sen sijaan CDK9 S90D-mutantti osoitti muuttumattoman yhteyden suuriin ja pieniin P-TEFb-komplekseihin ja indusoi TAT-riippuvaista HIV-1-transkriptiota. Fosfomimeettisessä S90: ssä CDK9: n ekspressio kuitenkin väheni yleisesti, mikä viittaa siihen, että fosforylaatio/defosforylaatiotasapaino on säilytettävä suurten ja pienten P-TEFb-kompleksien muodostamiseksi. Molekyylimallinnus osoitti, että CDK9: n ser-90 sijaitsi joustavassa silmukassa, joka altistettiin liuottimelle, mikä viittaa siihen, että se saattaa olla fosforyloitumassa (nähdään myös kuvassa 2). Niinpä viimeaikaiset tutkimuksemme tunnistivat cdk9: ssä uuden säätelevän fosforylaatiokohdan, joka voidaan kohdentaa HIV-1-transkription aktivointiin tai estoon.

5.

Cdk9: n tiettyjen kohtien fosforylaatiota ja defosforylaatiota tapahtuu koko transkriptioprosessin ajan, ja sitä on valvottava tiukasti. Muutokset tietyissä treoniini / seriinijäämissä ratkaisevat sen, liittyykö CDK9 suureen P-TEFb-kompleksiin, jotta se tulisi rekrytoitavaksi, ja tapahtuuko suuren kompleksin dissosiaatio tehokkaasti. Thr-186: n fosforylaatio CDK9: n ja ser-90: n t-silmukassa, joka sijaitsee t-silmukan ulkopuolella, määrittää, säilyykö CDK9 inaktiivisessa suuressa kompleksissa ja onko kinaasi entsymaattisesti aktiivinen, kun se on dissosioitunut 7SK snRNP: stä. Defosforylaatio jommassakummassa näistä kohdista johtaa suuren kompleksin epävakautumiseen ja cdk9/sykliini T1: n vapautumiseen, mikä rajoittaa Tat: n rekrytointia HIV-1 LTR: ään. Muutokset CDK9: n C-terminaalissa mahdollistavat sykliini T1 : tervan sitoutumisen ja defosforylaatio näissä kohdissa estää sitoutumisen toTAR-RNA: han. Sen sijaan thr-29: n tai ser-175: n jäämien fosforylaatio estää CDK9: ää. Näin syntymässä oleva kuva CDK9: n säätelystä fosforylaation kautta näyttää monimutkaiselta ja osittain yhdensuuntaiselta sen suhteen, mitä muista CDK: ista tunnetaan. Äskettäin tunnistetut CDK9-kohdennetut kinaasit CDK7, CDK2 ja fosfataasit PP1 ja PPM1A tulevat todennäköisesti esiin uusina kohteina HIV-1-ja syöpähoidoille.

eturistiriidat

kirjoittajat julistavat, ettei tämän paperin julkaisemiseen liity eturistiriitoja.

kiitokset

tätä hanketta tukivat District of Columbia Developmental Center for AIDS Research (P30ai087714), RCMI-NIH 2g12rr003048 research Centers in Minority Institutions (Rcmi) Program (Division of Research Infrastructure, National Center for Research Resources, nih), Russian Foundation for Basic Research (no. 12-04-91444-NIZ) ja Russian Ministry of Education and Science (no. 2012-1, 5-12-000-1001-030). Kirjoittajat haluavat myös kiittää Nekhai Labin jäseniä ehdotuksista ja pyytää anteeksi niitä, joiden työtä ei mainittu tilanpuutteen vuoksi.