ATP-analogien hyödyntäminen suunnitelluilla CDK: lla

tuotimme mutanttisia ”Shokat” – CDK: ita, jotka sisälsivät aminohappojen vaihtoa ATP: tä sitovissa taskuissaan. CDK2: n ja CDK3: n tapauksessa kyseessä oli fenyylialaniinin ja alaniinin vaihto kohdassa 80, joka on nimetty CDK2: ksi (F80A). Syntetisoimme myös 12 ATP-analogia selvittääksemme, voivatko suunnitellut CDK: t käyttää näitä analogeja fosforyloimaan rekombinantti retinoblastooma (RB)-proteiinia in vitro, ja huomasimme, että he käyttivät N6-(2-fenyylietyyli)-ATP: tä (PE-ATP) tehokkaimmin (Kuva 1a, eikä tietoja näy). Vaikka sekä wild-Tyyppi että sykliini E-CDK2 (F80A) käyttivät normaalia ATP: tä glutationi-S-transferaasi (GST)-RB-proteiinin fosforyloimiseen, vain F80A-kinaasi pystyi käyttämään PE-ATP: tä. Samansuuntaisia tuloksia saatiin sykliini E-CDK3: lla, mutta tässä tapauksessa f80a-mutantti ei voinut enää käyttää normaalia ATP: tä, joskin havainnon rakenteellinen perusta on epäselvä (kuva 1a). Nämä tutkimukset vahvistivat, että villissä tyypissä ja valmistetuissa kinaaseissa on haluttuja ATP-spesifisyyksiä.

kun mutantit CDK: t käyttivät tehokkaasti PE-ATP: tä Fosforyloimaan Rb in vitro, vastaavat kokeet, joissa käytettiin radioaktiivisesti merkittyä PE-ATP: tä solulysaateissa, epäonnistuivat, koska merkitty fosfaatti irtosi PE-ATP: stä lysaattien ATP-aktiivisuuden vuoksi (Tietoja ei näy). Siksi siirryimme ATP-analogin tiofosfaattimuotoon (PE-ATP-γ-S), jota lysaatit eivät hydrolysoineet (Kuva 1b). Vaikka kinaasit käyttävät usein ATP-γ-S: ää normaalia ATP: tä tehottomammin, tiofosforylaatiolla on tässä yhteydessä useita etuja. Ensinnäkin tiofosfaatit ovat stabiilimpia ja resistenttejä fosfataaseille . Toiseksi, koska soluissa ei ole olemassa tiofosforylaatiotapahtumia, tiofosfaatin merkintä tarjoaa ainutlaatuisia markkereita mutanttikinaasin fosforyloimille proteiineille. Lisäksi tiofosfaattiryhmällä on samanlaiset kemialliset ominaisuudet kuin sulfhydryyliryhmällä ja se on altis kemiallisille muunnoksille. Ilmaisimme ja puhdistimme liukoisia villityyppisiä ja sykliini a-CDK2 (F80A)-komplekseja bakteereista ja suoritimme samanlaisen RB-kinaasimäärityksen testataksemme niiden kykyä käyttää PE-ATP-γ-S: ää. Kuten kuvassa 1C on esitetty, vaikka molemmat kinaasit voivat käyttää ATP: tä tai ATP-γ-S: ää fosforyloimaan GST-RB-proteiinia (kuten sen elektromobiliteettisiirtymä osoittaa) vain f80a-mutantti voi käyttää PE-ATP-γ-S: ää kaikissa myöhemmissä tutkimuksissamme.

tiofosforyloitujen peptidien yksivaiheinen puhdistus

teknisten CDK: iden ja ATP-analogien käyttö helpottaa erittäin spesifistä substraattifosforylaatiota: seuraava haaste on, miten ne tunnistetaan kompleksisessa lysaatissa. Pyrimme hyödyntämään tiofosfaattilappuja kovalenttisesti sieppaamaan ja rikastamaan tiofosforyloituja peptidejä lysaattien fosforyloinnin ja mädättämisen jälkeen. Keskeinen ongelma oli kuitenkin tiofosfopeptidien ja kysteiiniä sisältävien peptidien kemiallisesti erottaminen toisistaan. Vaikka kemoselektiivinen menetelmä tiofosfopeptidien rikastamiseksi on kuvattu, kysteiinijäämien valtava runsaus monimutkaisessa proteiiniseoksessa vaikeuttaa tätä lähestymistapaa . Käytimme yksinkertaista talteenotto-ja vapautusmenetelmää eristääksemme selektiivisesti tiofosforyloituja peptidejä trypsinoitujen solujen lysaattien sisällä (kuva 2a). Lysaatin sisältämät proteiinit fosforyloitiin in vitro sykliini a-CDK2: lla (F80A) ja PE-ATP-γ-S: llä.proteiiniseos pilkottiin tämän jälkeen ja muodostuneet peptidit sekoitettiin tiopropyylisefaroosi 6B: hen , joka on aktivoitu disulfidihartsi, joka vangitsee sekä kysteiinipitoiset peptidit että tiofosfopeptidit disulfidinvaihtoreaktiolla. Koska perinteinen ditiotreitoli (DTT) eluutio vapauttaa molempia sitoutuneita peptidejä, hyödynsimme laadullisia eroja hartsiin sitoutuneiden tiofosfaattipeptidien ja kysteiinipitoisten peptidien välillä fosforotiolaattisulfidi-sidoksessa ja alkyylidisulfidi-sidoksessa. Korkeilla pH-arvoilla fosforotiolaattisulfidin sidos hydrolysoituu ja alkyylidisulfidi pysyy ehjänä . Hartsin käsittely vahvalla emäksellä (kuten natriumhydroksidilla) vapauttaa erityisesti tiofosfopeptidejä (ja muuttaa ne myös tavallisiksi fosfopeptideiksi), mutta ei kysteiiniä sisältäviä peptidejä hydrolysoimalla fosforotiolaattisulfidisidoksen (Kuva 2b). Koska kysteiinin kautta sitoutuneita peptidejä ei eluoida viimeisessä vaiheessa, emme voi palauttaa kysteiiniä sisältäviä tiofosfopeptidejä. Lisäksi eluutio johtaa tiofosfaattijäljen menetykseen muuntamalla tiofosfopeptidin fosfopeptidiksi. Tiofosfopeptidi-eristysmenetelmämme eroaa hieman Blethrow et al: n menetelmästä. siinä otamme tiofosfopeptidit talteen disulfidinvaihtokemian (disulfidihartsi) avulla alkyloinnin (jodiasetamidihartsi) sijaan ja eluoimme ne selektiivisesti emäshydrolyysillä hapettumisen sijaan.

testataksemme tämän menetelmän toteutettavuutta fosforyloimme GST-Rb: n sykliini a-CDK2: lla (F80A) ja PE-ATP-γ-S: llä ja sovitimme puhdistusmenetelmämme reaktioseoksen trypsiini-digestiin. Eristetyt peptidit analysoitiin electrospray tandem-massaspektrometrillä (ESI-MS/MS) ioniloukkumassaspektrometrillä. Peptidit tunnistettiin sovittamalla tandem-massaspektrit ihmisen proteiinisekvenssitietokantaan (johon on lisätty GST-Rb-sekvenssi) SEQUEST-ohjelmiston avulla . GST-Rb-substraatti sisältää viisi kysteiiniä sekä seitsemän SP/TP-aluetta, jotka ovat CDK-fosforylaation suosimia sivustoja . Löysimme useita fosfopeptidejä, jotka sisälsivät vain ja kaikki odotetut fosforylaatiopaikat (Taulukko 1). Emme myöskään löytäneet yhtään kysteiinipitoista peptidiä ja hyvin vähän epäspesifisiä peptidejä. Tämä antoi periaatteen todisteen laajamittaisille määrityksillemme.

ihmisen sykliini a-CDK2-substraattien tunnistaminen solulysaateissa

tavoitteemme oli tunnistaa mahdollinen sykliini a-cdk2 substraatteja proteomin laajuisessa mittakaavassa. Näytteen monimutkaisuuden vähentämiseksi fraktioimme hek293-solujen koko solulysaatin 11 fraktioon ioninvaihtokromatografian ja ammoniumsulfaatin saostuksen avulla (Lisätiedosto 1). Tämän jälkeen suoritimme kullekin fraktiolle in vitro-kinaasimääritykset. Positiivisena kontrollina lisäsimme myös pienen määrän GST-Rb: tä jokaiseen reaktioon. Sulatettuamme reaktioseoksen trypsiinillä käytimme puhdistusprotokollaamme eristääksemme tiofosfopeptidit peptidiseoksista. Talteen otetuille peptideille tehtiin nestekromatografia-MS/MS-analyysi ja tietokantahaku. Löysimme vaihtelevia määriä peptidejä ja ainakin yhden RB-fosfopeptidin jokaisesta lysaattifraktiosta (lisätietoja tiedosto 2).

CDKs fosforyloi proteiineja proliinisuuntautuneesti joko seriinille tai treoniinille, ja lukuisat tutkimukset tukevat ajatusta, että motiivi S/T-P-X-R / K edustaa CDK-konsensusmotiivia. Fosfopeptideistä tunnistimme yhteensä 203 proteiinia: 180 ehdokasta fosforyloitiin SP-tai TP-motiivien sisällä (proliiniohjattu; lisätietoja tiedosto 3). Nämä kandidaattisubstraatit edustavat monenlaisia biologisia prosesseja, kuten solusyklin säätelyä, DNA: n ja RNA: n metaboliaa, translaatiota ja solurakenteita (kuva 3). Yhteensä 96 222: sta (43%) proliiniohjatusta alueesta oli tunnetun CDK-konsensuksen mukaisia (positiivisesti varautunut jäämä asemassa +3). Mielenkiintoista on, että noin 24% proliiniohjatuista kohteista (53/222) sisälsi positiivisesti varautunutta jäännöstä joko +4-tai +5-asemissa, mikä viittaa siihen, että tämä motiivi voi olla myös CDK2: n suosiossa. Todellakin, Blethrow ym. totesi myös, että huomattava määrä sykliini B-CDK1-substraatteja sisältää konsensuksen vastaisia sivustoja. Peptideillä, jotka sisälsivät konsensuksen vastaisia kohtia, havaittiin, että noin 50% vastaavista proteiineista kantoi vähintään yhtä k/RXLφ-tai K/RXLXφ-motiivia (jossa φ on suuri hydrofobinen jäännös ja X on mikä tahansa aminohappo) distaalista fosforylaatiokohtiin, ja lähes kaikissa niistä oli vähintään yksi minimaalinen RXL-motiivi (lisäaineisto 3). Tämä on sopusoinnussa vakiintuneen käsityksen kanssa, että nämä motiivit edistävät sykliini a-CDK2: n sitoutumista substraatteihin . Sen lisäksi, että valitsimme fosforylaatiot CDK-konsensusmotiivien avulla, tunnistimme 28 proteiinia, jotka on aiemmin yhdistetty CDK-substraateiksi (merkitty lihavoidulla lisätiedostossa 3) . Näin ollen lähes 15% ehdokkaistamme on aiemmin todettu CDK-kohteiksi, mikä tukee edelleen ajatusta siitä, että menetelmämme hyödyntävät ja rikastavat CDK2-substraatteja. Lopuksi 43% löytämistämme fosforylaatioista on aiemmin tunnistettu laajoissa in vivo-fosfoproteomian analyyseissä, mikä osoittaa, että nämä fosforylaatiot eivät rajoitu meidän lysaattiolosuhteisiimme .

sekä tutkimuksemme että Blethrow et al: n raportoimat. käytimme samanlaisia fosfopeptidieristysjärjestelmiä ja niihin liittyviä sykliini-CDK: ita, ja odotimme, että molemmissa tutkimuksissa paljastuneissa substraateissa saattaa olla huomattavia päällekkäisyyksiä. Itse asiassa löysimme lähes 50% (30/68) sykliini B-CDK1-substraateista sykliini a-CDK2-ehdokkaiden listalta, joten nämä menetelmät ovat vankkoja ja toistettavissa (lisätietoja tiedosto 4). Näiden kahden luettelon välillä on kuitenkin myös merkittäviä eroja, jotka todennäköisesti johtuivat monista tekijöistä, kuten menettelyeroista, eri solutyypeistä, epätäydellisestä peptidin tunnistamisesta MS: n avulla sekä sykliini-ja/tai kinaasialayksiköiden antamasta substraattispesifisyydestä. Osa näistä eroista saattaa myös heijastaa sykliini a-CDK2: n ja sykliini B-CDK1: n erilaisia biologisia toimintoja. Esimerkiksi proteiinin translaatioon ja/tai ribosomin toimintaan osallistuvia proteiineja löytyi yhdeksän, mutta yhtäkään näistä proteiineista ei löydetty sykliini B-CDK1: llä, vaikka niiden määrä oli suhteellisen suuri.

vaikka tunnistimme useita tunnettuja CDK2-substraatteja, Emme tunnistaneet joitakin aiemmin kuvattuja CDK2-substraatteja. Jotkin edellä mainituista tekijöistä saattavat myös selittää sen, ettei tunnettuja CDK2-substraatteja löydy analyyseistämme. Lisäksi endogeenisten CDK: iden jo fosforyloimia substraatteja ei olisi tiofosforyloitu in vitro. On myös mahdollista, että joitakin proteiineja ei ole liuotettu lysaatin valmistuksen ja/tai sonikaatiovaiheen aikana ja jätetty pois analyyseistämme. Lopuksi on mahdollista, että suuret proteiinikompleksit ovat saattaneet häiriintyä kinaasireaktiota edeltäneiden fraktiointimenetelmien vuoksi, ja että proteiineja, joita CDK2 fosforyloi vain näiden kompleksien yhteydessä, ei välttämättä löydetä menetelmillämme.

löysimme myös neljä sykliini A: ta vastaavaa fosfopeptidiä ja CDK2: ta sekä 27 muuta fosfopeptidiä, joilla ei ole proliinia (Lisätiedosto 5). Epäilimme näiden fosfopeptidien johtuvan sykliini a-CDK2: n auto-fosforylaatiosta ja muiden kinaasien aiheuttamasta taustafosforylaatiosta, ja toiset ovat raportoineet samankaltaisesta taustafosforylaatiosta . Näiden mahdollisuuksien testaamiseksi suoritimme kontrollikinaasireaktion sykliini a-CDK2: lla (F80A) ja PE-ATP-γ-S: llä, johon ei ole lisätty solulysaattia, ja otimme talteen kolme neljästä sykliini a-CDK2-peptidistä (Lisätiedosto 5). Lisäksi, kun suoritimme samanlaisen kinaasi-vain-reaktion γ-32P-ATP: n läsnä ollessa, havaitsimme 32P: n inkorporaation molempiin proteiineihin annosriippuvaisesti (lisätietoja tiedosto 6). Nämä kokeet vahvistivat, että sykliini a-CDK2: n taustalla oli autofosforylaatio alkuperäisissä määrityksissä.

teimme myös kontrollikinaasireaktioita käyttäen lysaattifraktioita, GST-Rb ’spike-in’ ja PE-ATP-γ-S ilman sykliini a-CDK2: ta. Nämä ”ei-kinaasi” – kontrollireaktiot fosforyloivat 7 listamme 27: stä ei-proliini-suunnatusta fosfopeptidistä (Lisätietotiedosto 5), mikä viittaa siihen, että suurin osa, elleivät kaikki, näistä fosfopeptideistä johtui taustafosforylaatiosta kinaasien toimesta, jotka pystyvät käyttämään ATP-analogia rajoitetussa määrin. Esimerkiksi useimmat näistä peptideistä sisältävät happamia jäämiin ohjautuvia fosforylaatiopaikkoja, jotka ovat kaseiinikinaasi 2-motiiveja. Kaseiinikinaasi 2 on ainutlaatuinen siinä, että se voi hyödyntää GTP: tä sekä ATP: tä; siten aktiivinen sivusto voi majoittaa tilaa vieviä ATP-analogeja, kuten PE-ATP: tä . Tärkeää on, että emme saaneet näistä kontrollikokeista RB-fosfopeptidejä takaisin, mikä osoittaa, että määrityksissämme ei ollut epäspesifistä CDK-aktiivisuutta. Löysimme myös 44 muokkaamatonta peptidiä, joista 12 sisälsi kysteiinijäämiä. Suurin osa näistä peptideistä on peräisin useista lysaattifraktioista (lisäaineisto 2). Epäilemme, että nämä johtuivat peptidien vähäisestä epäspesifisestä sitoutumisesta hartsiin tiukoista pesuolosuhteista huolimatta, ja kysteiinipitoisten peptidien tapauksessa alkyylidisulfidisidoksen pienestä hydrolyysimäärästä eluutiovaiheen aikana. Yhteenvetona voidaan todeta, että menetelmämme olivat erittäin valikoivia, ja tutkimuksissamme tunnistettiin yllättävän suuri ryhmä sykliini a-CDK2-substraattiehdokkaita, joista suurinta osaa ei ole aiemmin tunnistettu CDK-kohteiksi.

kandidaattisubstraattien validointi sykliini a-CDK2-tavoitteina

käytimme useita strategioita validoidaksemme joitakin listallamme olevia uusia ehdokkaita sykliini a-CDK2-substraateiksi. Koska proteiinitunnistuksemme perustuivat peptidisekvensseihin, aloitimme varmistamalla, että sykliini a-CDK2 fosforyloi kolme täyspitkää ja syntyperäistä ehdokasta, jotka immunopresipitoitiin 293 transfektoidun solun (EF2, TRF2 ja RAP1) epitooppitunnisteiden kautta. Koska näitä proteiineja ei ollut sykliini B-CDK1-luettelossa , selvitimme, fosforyloituvatko ne myös sykliini B-CDK1: llä. Kukin CDK2-ehdokas fosforyloitiin sekä sykliini a-CDK2: lla että sykliini B-CDK1: llä, vaikka EF2 fosforyloituikin vähäisemmässä määrin kuin joko TRF2 tai RAP1 (Kuva 4a). Ilmaisimme myös trf2: n, RAP1: n ja ribosomaalisen proteiinin RL12: n GST-fuusioina ja puhdistimme ne Escherichia coli-bakteerista. Kun käytimme sykliini a-CDK2: ta fosforyloimaan TRF2: ta ja RAP1: tä in vitro, proteiinit fosforyloituivat voimakkaasti, ja MS-analyysit osoittivat, että nämä fosforylaatiot tapahtuivat samoissa kohdissa, jotka alun perin tunnistimme (Kuva 4b). Käytimme myös sykliini a-CDK2: ta ja sykliini B-CDK1: tä fosforyloimaan GST-RL12: ta ja huomasimme, että molemmat CDK: t fosforyloivat myös RL12: ta in vitro (Kuva 4c). Nämä tutkimukset siis vahvistavat, että seulassamme tunnistetut peptidit edustavat proteiineja, jotka sykliini a-CDK2 voi fosforyloida ainakin in vitro. Vaikka löysimme laadullisia eroja sykliini a-CDK2: n ja sykliini B-CDK1: n kyvyssä fosforyloida tiettyjä proteiineja, kummassakin tapauksessa molemmat CDK: t fosforyloivat ehdokkaat. Koska näissä tutkimuksissa käyttämässämme entsyymivalmisteessa oli ylimäärä vapaata CDK2: ta (F80A), otimme huomioon mahdollisuuden, että jotkin substraattifosforylaatiot voivat johtua endogeenisten sykliinien ja CDK2: n (F80A) yhteenliittymisestä, joka on joko monomeeristä tai joka on saattanut dissosioitua sykliini A: sta määritysolosuhteissa. Havaitsimme, että sykliini B-CDK2: n (F80A) aktiivisuuden määrä näissä uutteissa oli vähäinen verrattuna sykliini a-CDK2: een (F80A), emmekä havainneet sykliini E-CDK2: n (F80A) aktiivisuutta (Lisätietotiedosto 7). Emme kuitenkaan voi sulkea pois sitä mahdollisuutta, että CDK2 (F80A) on fosforyloinut joitakin peptidejä kompleksissa endogeenisen sykliinin kanssa, ja minkä tahansa sykliini A: n substraattiehdokkaan spesifisyys verrattuna muihin sykliineihin, jotka aktivoivat CDK2: ta, on validoitava jäljempänä kuvatulla tavalla.

Rl12: n validointi vivoCDK2-substraattina

edellä mainitut tutkimukset validoivat useita uusia ehdokkaita, jotka on tunnistettu näytössämme CDK2-substraateiksi in vitro. Selvittääksemme, fosforyloituuko uusi substraatti myös CDK2: lla in vivo, teimme kattavamman analyysin ribosomaalisesta proteiinista RL12. Sekoitimme ensin immunopresipitaatteja epitopeilla merkityistä sykliini a-CDK2: sta ja RL12: sta ihmisen soluissa γ-32P-ATP: n läsnä ollessa ja havaitsimme sykliini a-CDK2: n fosforyloituneen RL12: n in vitro (Kuva 5a). Fosforylaatio poistui suurelta osin mutantissa RL12, jossa tunnistettu fosfoseriini S38 korvattiin alaniinilla, ja se palautui, kun S38 korvattiin treoniinilla (Kuva 5b). Käytimme fosfopeptidikartoitusta S38: aa sisältävän peptidin tunnistamiseen ja vahvistimme, että CDK2 fosforyloi sen suoraan in vitro (Kuva 5c). Testattaessa, onko RL12 fosforyloitunut myös In vivo CDK2-riippuvaisella tavalla samassa kohdassa, merkitsimme metabolisesti soluja 32P-ortofosfaatilla ja immunopresipitoitua villityyppiä tai RL12-S38A soluista, jotka yliekspressoivat joko sykliini E-CDK2: ta, katalyyttisesti inaktiivista sykliini E-CDK2: ta tai CDK-inhibiittoria p21 (endogeenisen CDK: n estämiseksi) . Koska endogeenista rl12-fosforylaatiota ei voida tutkia sopivan anti-RL12 – vasta-aineen puuttumisen vuoksi, näissä tutkimuksissa tutkittiin kohdunulkoisen RL12: n fosforylaatiota in vivo (nämä transfektiotilanteet johtivat noin viisi-kymmenkertaiseen rl12 mRNA: n yliekspressioon (lisätietoja 8). Havaitsimme, että villityyppinen RL12, mutta ei RL12-S38A, fosforyloitiin in vivo (Kuva 5d). Tämä fosforylaatio voimistui soluissa, jotka yliekspressoivat sykliini E-CDK2: ta, mutta eivät inaktiivista sykliini E-CDK2: ta, ja väheni soluissa, jotka yliekspressoivat P21 CDK-inhibiittoria (joka estää endogeenisia sykliini-CDK-inhibiittoreita).; Kuva 5d). Lopuksi käytimme fosfopeptidikartoitusta ja fosfoaminohappoanalyysejä rl12-proteiinin immunopresipitoinnista merkityistä soluista ja vahvistimme, että sykliini E-CDK2: n aiheuttama rl12-fosforylaatio in vivo tapahtui myös S38: lla (Kuva 5e). Rl12 S38 fosforylaatiota In vivo on raportoitu myös fosfoproteomitutkimuksissa .

vaikka olemme validoineet jokaisen tähän mennessä testaamamme uuden ehdokkaan osoittamalla, että täyspitkät proteiinit fosforyloituvat CDK2: ssa, jotkut listallamme olevat ehdokkaat osoittautuvat todennäköisesti fysiologisesti merkityksettömiksi sykliini a-CDK2: n substraateiksi. Esimerkiksi kinaasireaktiot suoritettiin lysaateissa, ja In vivo-aliselluloosalokeroituminen saattaa rajoittaa CDK2: n pääsyä joillekin ehdokkaille. Lisäksi on mahdollista, että muut solukinaasit ovat joko päällekkäisiä CDK2: n kanssa tai tärkeämpiä kuin yksittäiset substraatit in vivo. Siksi on tärkeää, että ehdokkaita arvioidaan tarkasti mahdollisimman fysiologisessa yhteydessä. Tätä varten käynnissä olevissa tutkimuksissa käytämme geenien kohdentamismenetelmää mutatoidaksemme osan endogeenisten geenien fosforylaatiopaikoista tutkiaksemme niiden fysiologista merkitystä.